CN115595349A - 一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺 - Google Patents

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Abstract

为解决菌体浓度低，蛋白表达量低，不利于商业化大规模生产的技术问题，本公开提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：(1)一级种子培养；(2)二级种子培养；(3)三级种子培养；(4)发酵罐甘油培养；(5)发酵罐甘油流加补料培养；(6)甲醇诱导培养。本发明所述的重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法通过对培养基、溶氧、OD600的优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的毕赤酵母吨级以上高密度发酵规模的生产。

Description

一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺
技术领域
本发明属于生物技术和发酵工程领域，具体涉及一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺，特别是涉及通过毕赤酵母高密度发酵技术和甲醇低温诱导表达技术相结合的毕赤酵母大规模生产重组蛋白的方法和应用。
背景技术
毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，毕赤酵母菌作为一种单细胞真核生物，既具有原核生物结构简单遗传背景清楚的特点，又具有真核生物严格的基因调控机制和对表达产物的翻译后修饰的能力，自身不含有内毒素、热源、病原体，是一种非常安全的表达宿主，已经成为最有效的表达外源蛋白的表达系统之一。据文献资料统计已有数千种外源蛋白已经实现了在毕赤酵母体系中成功表达，其中有很多已经实现了大规模工业化生产。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)，为其在食品及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。
在重组毕赤酵母在放大到吨级以上的发酵规模后，存在搅拌、通气等条件要求苛刻的情况，并伴随有耗氧量和产热量巨大等缺点，难以真正大规模工业化生产。现有技术中规模化培养毕赤酵母通常采用BSM培养基实现大规模高密度发酵生产重组蛋白。基于BSM培养基的发酵工艺通常包括种子培养、甘油培养、甘油补料、甲醇补料诱导的不同阶段，在甘油补料阶段一般向发酵罐中添加50％浓度灭菌甘油作为碳源，诱导阶段以100％的甲醇作为碳源，甘油粘稠称量配料过程操作较为麻烦，大规模工业化生产成本较高，诱导阶段单纯补充甲醇，使毕赤酵母细胞生长缓慢，整个发酵周期长，毕赤酵母细胞难以快速达到高密度发酵水平。此外，在毕赤酵母高密度发酵的中后期，毕赤酵母容易出现菌体老化、自溶、蛋白酶分泌量增加等情况，从而导致重组蛋白出现降解，蛋白表达量大幅度衰减的现象。
发明内容
为解决菌体浓度低，蛋白表达量低，不利于商业化大规模生产的技术问题，本公开提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：(1)一级种子培养；(2)二级种子培养；(3)三级种子培养；(4)发酵罐甘油培养；(5)发酵罐甘油流加补料培养；(6)甲醇诱导培养。本发明所述的重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法通过对培养基、溶氧、OD600的优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的毕赤酵母吨级以上高密度发酵规模的生产。
具体而言：
一方面，本发明提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：
(1)一级种子培养；
(2)二级种子培养；
(3)三级种子培养；
(4)发酵罐甘油培养；
(5)发酵罐甘油流加补料培养；
(6)甲醇诱导培养；
(7)放罐、离心收集、送检；
其特征在于，(4)发酵罐甘油培养步骤中控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，进行(5)发酵罐甘油流加补料培养步骤，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，至OD600达225-275。
进一步，本发明所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(1)一级种子培养步骤包括将检定合格的种子液以0.05％-0.1％接种量接种至300±6g YPD培养基中，30±1℃，250±5rpm摇床培养，测定OD600至10-20，镜检细胞呈圆形或椭圆形、出芽、无杂菌。
进一步，本发明所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(2)二级种子培养步骤包括将摇瓶种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的6.7±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。
进一步，本发明所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(3)三级种子培养步骤包括将二级种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的63±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。
进一步，本发明所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(6)甲醇诱导培养步骤包括甘油流加阶段结束后，等溶氧和pH均明显上升后，将温度控制为18-25℃，pH值控制为5.3-6.0，开始以甲醇进行诱导，甲醇适应5h后，一次性补加PTM1 3080±61.6g，诱导48h再次补加PTM1 3080±61.6g，诱导60-72h，进行(7)放罐、离心收集、送检。
另一方面，本发明提供一种毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于毕赤酵母的发酵罐培养包括两个阶段：菌体增殖阶段和外源蛋白诱导表达阶段；其中菌体增殖阶段以甘油为碳源在30℃实现毕赤酵母中高密度发酵，外源蛋白诱导表达阶段以甲醇为诱导剂在20℃实现外源蛋白的诱导表达。
进一步，本发明所述毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于所述发酵罐培养为吨级发酵罐，优选2000L发酵罐。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“毕赤酵母”，即巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
巴斯德毕赤酵母的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，AOX增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。
术语“AOX”，即甲醇脱氢酶也叫甲醇氧化酶，是甲醇代谢途径必需的一种酶，它催化甲醇氧化成甲酸,进而氧化释放出二氧化碳。毕赤酵母中AOX1基因启动子因受到甲醇的诱导而启动甲醇脱氢酶基因的表达。SIBIA(Salk Institute Biotechnology/IndustrialAssociates).的研究人员分离了AOX基因的启动子和宿主菌株，构建了载体，并开发出了相应的毕赤酵母基因操作技术。醇氧化酶AOX1基因启动子是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。毕赤酵母AOX1基因启动子表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化。
术语“补料”在发酵培养过程中连续或间断性地添加的营养物质，主要包括连续补料和分批补料。
术语“连续补料”是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。
术语“分批补料”是以某种方式向发酵罐中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，分批补料使发酵液的体积随时间逐渐增加，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
术语“诱导物”，能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物。无论在正调控系统还是在负调控系统中，操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此也称这种因子为效应物，凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物，凡能导致操纵子关闭，阻遏转录过程的效应物称为辅助诱导物。
术语“诱导表达”，有些基因表达极易受环境变化影响，在特定环境信号刺激下，有些基因的表达方面为开放或增强，这种表达方式称为诱导表达。
术语“诱导型启动子”(inducible promoter)，是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。
本发明取得了以下有益的技术效果：
通过毕赤酵母高密度发酵技术和甲醇低温诱导技术联合，实现了毕赤酵母吨级以上规模的高密度发酵，通过在30℃进行发酵、20℃进行甲醇诱导，即实现了毕赤酵母的高密度发酵、又实现了外源蛋白的大规模重组表达。
对重组毕赤酵母三级种子培养、发酵罐培养、诱导表达等步骤的培养基、溶氧、OD600等参数条件进行优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的技术效果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然实施例中给出了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例：毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺
1、一级种子培养
将检定合格的种子液以0.05％-0.1％接种量接种至300±6g YPD培养基中，30±1℃，250±5rpm摇床培养。测定OD600为10-20，镜检细胞应呈圆形或椭圆形，出芽，无其他杂菌。
2、二级种子培养
将检定合格的摇瓶种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的6.7±0.5kg种子罐中培养。培养温度设定在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上。培养至OD600达25-45，镜检细胞应呈圆形或椭圆形，无杂菌。
3、三级种子培养
将检定合格的摇瓶种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的63±3kg种子罐中培养。培养温度设定在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上。培养至OD600达25-45，镜检细胞应呈圆形或椭圆形，无杂菌。
4、发酵罐甘油培养
移种完成后进入甘油培养阶段，控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，根据实际情况调节搅拌转速和空气流量，必要时通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过约10-18h培养甘油耗尽，进入下一步流加补料培养。
5、发酵罐甘油流加补料培养
发酵罐甘油培养中甘油耗完，出现溶氧峰后，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，OD600达225-275，停止流加，进入下一步甲醇诱导培养阶段。
6、甲醇诱导培养
甘油流加阶段结束后，等溶氧和pH均明显上升后，将温度控制为18-25℃，pH值控制为5.3-6.0。连接补料管和甲醇，开始以甲醇进行诱导。甲醇适应后(约5h)温度控制为18-25℃继续诱导，一次性补加PTM1 3080±61.6g，诱导48h再次补加PTM1 3080±61.6g，诱导60-72h放罐，进入离心收集工序。
7、放罐、离心收集、送检
甲醇诱导培养结束后放罐，离心上清取样送检SDS-PAGE。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：
(1)一级种子培养；
(2)二级种子培养；
(3)三级种子培养；
(4)发酵罐甘油培养；
(5)发酵罐甘油流加补料培养；
(6)甲醇诱导培养；
(7)放罐、离心收集、送检；
其特征在于，(4)发酵罐甘油培养步骤中控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，进行(5)发酵罐甘油流加补料培养步骤，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，至OD600达225-275。
2.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(1)一级种子培养步骤包括将检定合格的种子液以0.05％-0.1％接种量接种至300±6g YPD培养基中，30±1℃，250±5rpm摇床培养，测定OD600至10-20，镜检细胞呈圆形或椭圆形、出芽、无杂菌。
3.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(2)二级种子培养步骤包括将摇瓶种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的6.7±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。
4.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(3)三级种子培养步骤包括将二级种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的63±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。
5.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(6)甲醇诱导培养步骤包括甘油流加阶段结束后，等溶氧和pH均明显上升后，将温度控制为18-25℃，pH值控制为5.3-6.0，开始以甲醇进行诱导，甲醇适应5h后，一次性补加PTM1 3080±61.6g，诱导48h再次补加PTM1 3080±61.6g，诱导60-72h，进行(7)放罐、离心收集、送检。
6.一种毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于毕赤酵母的发酵罐培养包括两个阶段：菌体增殖阶段和外源蛋白诱导表达阶段；其中菌体增殖阶段以甘油为碳源在30℃实现毕赤酵母中高密度发酵，外源蛋白诱导表达阶段以甲醇为诱导剂在20℃实现外源蛋白的诱导表达。
7.如权利要求6所述毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于所述发酵罐培养为吨级发酵罐，优选2000L发酵罐。
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