CN109053867B - 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法 - Google Patents

一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，所述方法包括种子活化、接种种子罐、移种发酵罐培养、流加补料培养、诱导表达以及离心收菌、破碎澄清的步骤，该方案可有效提升重组大肠杆菌在高密度培养条件下可溶性重组蛋白的表达量，较普通的培养方案在提升菌体密度的同时，明显提升可溶性蛋白的表达量，且具有无需调控pH，操作方便，可控性强，稳定性好、生产成本低以及可规模放大的特点。

Description

一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法。
背景技术
大肠杆菌高密度发酵诱导表达外源基因，因其使用的载体和表达的蛋白的不同，方法差异较大。目前主要是通过改变载体，添加增溶标签(苏鹏，龚国利.优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展.生物技术通报，2017)，来增加蛋白可溶性表达，但是这种方法并不适用于生产，药用重组蛋白制品，通常是不可以添加标签的，这就大幅度降低了增溶标签的应用价值。另一个优化方向，是在发酵领域，通过不同的发酵策略，来提升外源蛋白的可溶性表达(宋浩，重组大肠杆菌表达外源蛋白的共性发酵调控策略研究.华东理工大学，2016)，但是不同的载体，不同的细胞，发酵条件各异，还有其他相关的专利技术文献，例如：
CN201310517277.7一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，
CN201410541799.5一种高密度培养重组大肠杆菌产脯氨酸氨肽酶的方法，
CN201310534045.2一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法。
因此需要开发新技术，来调整外源蛋白表达量，尤其是满足工业化应用的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种简单有效、可防止包涵体产物形成的方法，能够提高重组轮状病毒P2-ΔVP8*抗原(*代表非天然蛋白)可溶性表达的高密度培养方案，具有操作简便、生产成本低以及可规模放大的特点。
本发明所述的一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其包括如下步骤：
(1)种子活化：将重组蛋白大肠杆菌工程菌接入培养基中活化；
(2)接种种子罐：再将步骤(1)所得活化后的菌液接种种子罐培养至OD600≥4；
(3)移种发酵罐培养：将种子罐中所有菌液转移至50L发酵罐，温度37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4；培养期间，pH会略有上升，不会超过7.5，无需调控；
(4)流加补料培养：按照3.5mL/min的速度起始，每小时递增3.5mL/min的速度，缓慢流加25％的葡萄糖，继续维持上述条件培养；此时补充的葡萄糖作为碳源，维持菌体生长，pH会逐渐降低，但不会低于6.8，无需调控。
(5)诱导表达：培养至OD600≥30，停止补葡萄糖，30min后，流加诱导培养基，按照10mL/min的速度起始，约30min后降温至18℃，添加0.5mM IPTG，每3h递增7mL/min的速度持续流加诱导培养基；诱导12h，停止培养；诱导表达期间，降低温度、添加迟效氮源培养基、使用较低浓度IPTG，目的都是控制蛋白表达处于较低速度，有利于蛋白质正确折叠，提升可溶性表达。整个诱导表达期间补充了一定的氮源成分(诱导期间流加的大豆蛋白胨和酵母提取物)，pH会逐渐上升，但是不会高于8，无需调控。
(6)离心收菌、破碎澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液。
上文所述的技术方案中，步骤(1)所述重组蛋白大肠杆菌工程菌为携带重组轮状病毒抗原基因序列的pET26b(+)-P[8]、pET26b(+)-P[6]、pET26b(+)-P[4]质粒，所述质粒由申请人构建；该工程菌的宿主菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)，宿主菌株购买自中国农业微生物保藏中心，菌株编号ACCC 03721。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，步骤(1)所述的种子活化为：将重组蛋白大肠杆菌工程菌按体积百分比1％的接种量接入培养基中；于37℃，150～220rpm摇床中培养过夜；
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，步骤(1)所述的培养基为：大豆蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、硫酸卡那霉素100μg/mL。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，步骤(2)所述的接种种子罐为：按体积百分比3％的接种量接种10L种子罐，37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4；整个种子培养期间，pH会略有上升，不会超过7.5，无需调控。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，步骤(2)所述的培养基为5L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L、100μg/mL硫酸卡那霉素。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，步骤(3)所述的培养基为25L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L，十二水合磷酸氢二钠28.65g/L。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，所述的诱导培养基为：大豆蛋白胨48g/L、酵母提取物96g/L、甘油20％、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，所述的离心收菌为6000r/min，离心10min，收获菌体。
进一步优选的情况下，上文所述的技术方案中，所述的破碎澄清为用pH8.5的50mMTris-HCl重悬菌体，高压均质机800-1000psi破碎菌体，用中空纤维柱澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液。
发明所述的高密度发酵培养方案，用于表达轮状病毒P2-ΔVP8*抗原，该方案可有效提升重组大肠杆菌在高密度培养条件下可溶性重组蛋白的表达量，较普通的培养方案在提升菌体密度的同时，明显提升可溶性蛋白的表达量，且具有无需调控pH，操作方便，可控性强，稳定性好等优点。
附图说明
图1各种发酵方法表达量比较；其中：1.摇瓶培养；2.本发明方法培养；3.仅葡萄糖流加补料培养；4.仅浓缩基础培养基流加补料培养；5.标准分子量。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
申请人强调以下述重组轮状大肠杆菌工程菌为举例，本发明所述“高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法”广泛适用于各种工程菌的发酵，不仅仅限于以下几种。
1、实施例1种子活化：将-80℃冻存的重组轮状大肠杆菌工程菌(共有三株不同价型的轮状疫苗工程菌，分别为携带重组轮状病毒抗原基因序列的pET26b(+)-P[8]、pET26b(+)-P[6]、pET26b(+)-P[4]质粒，所述质粒由申请人构建；该工程菌的宿主菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)，宿主菌株购买自中国农业微生物保藏中心，菌株编号ACCC 03721)在无菌环境下按照体积百分比1％的接种量接入培养基中(大豆蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、硫酸卡那霉素100μg/mL)，于37℃，150～220rpm摇床中培养过夜。
2、接种种子罐：按照体积百分比3％的接种量接种10L种子罐(培养基5L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L、硫酸卡那霉素100μg/mL)，温度37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4。整个种子培养期间，pH会略有上升，不会超过7.5，无需调控。
3、移种发酵罐培养：将种子罐中所有菌液转移至50L发酵罐(培养基25L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L)，温度37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4。培养期间，pH会略有上升，不会超过7.5，无需调控。
4、流加补料培养：按照3.5mL/min的速度起始，每小时递增3.5mL/min的速度，缓慢流加25％的葡萄糖，继续维持上述条件培养。此时补充的葡萄糖作为碳源，维持菌体生长，pH会逐渐降低，但不会低于6.8，无需调控。
5、诱导表达：培养至OD600≥30，停止补葡萄糖，30min后，流加诱导培养基(大豆蛋白胨48g/L、酵母提取物96g/L、甘油20％、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L)按照10mL/min的速度起始，约30min后降温至18℃，添加0.5mM IPTG，每3h递增7mL/min的速度持续流加诱导培养基。诱导12h，停止培养。诱导表达期间，降低温度、添加迟效氮源培养基、使用较低浓度IPTG，目的都是控制蛋白表达处于较低速度，有利于蛋白质正确折叠，提升可溶性表达。整个诱导表达期间补充了一定的氮源成分(诱导期间流加的大豆蛋白胨和酵母提取物)，pH会逐渐上升，但是不会高于8，无需调控。
6、离心收菌：6000r/min，离心10min，收获菌体。
7、破碎澄清：用50mM Tris-HCl(pH＝8.5)重悬菌体，高压均质机800-1000psi破碎菌体，用中空纤维柱澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液。
实施例2
1、将实施例1所获得的蛋白原液进行电泳，分析蛋白质表达效果。
2、菌体密度显著高于对照实验组的结果，对照组为仅使用浓缩基础培养基或仅使用葡萄糖进行流加补料；仅使用葡萄糖或浓缩基础培养基时菌体密度OD600仅能达到35左右(约35g/L左右湿菌体)，而本实验所述方案的菌体密度OD600可达到70以上(约140g/L以上湿菌体)，湿菌体量提升4倍以上。
3、表达量也显著高于对照实验组(如图1所示各种发酵方法表达量比较)；仅使用葡萄糖或浓缩基础培养基时可溶性蛋白单位表达量约为0.36g/L，而两者相结合优化后方案的表达量可达3.2g/L左右，总体产量可提升约9倍以上。
4、降温诱导，使得诱导的可溶性表达量显著提升；高温诱导时产物大部分以包涵体的形式存在，降温诱导后可溶性蛋白量显著提升。
5、前期补葡萄糖，pH降低，后期补氮源和甘油混合培养基，pH缓慢上升，使得整个发酵过程pH无需补充酸碱调控，使操作更方便。
6、发酵前期单独补充葡萄糖可提升菌体生长速率，可缩短前期发酵时间，当菌体浓度达到OD600约30时中断补料，使葡萄糖充分消耗；诱导前30min开始流加浓缩基础培养基，当菌体适应生长环境后降温诱导，可提前激活诱导表达机制，使表达量提升。
通常的方案，在培养期间流加葡萄糖，或浓缩基础培养基，均无法实现高密度培养的同时获得高表达量。
利用本发明所述方法，发酵了三株不同价型的轮状疫苗工程菌，分别为携带重组轮状病毒抗原基因序列的pET26b(+)-P[8]、pET26b(+)-P[6]、pET26b(+)-P[4]质粒，均获得较好的表达效果，且批次间实验条件可重复，实验稳定性好。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (6)

1.一种高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)种子活化：将重组蛋白大肠杆菌工程菌接入培养基中活化；所述的种子活化具体为：将重组蛋白大肠杆菌工程菌按体积百分比1％的接种量接入培养基中；于37℃，150～220rpm摇床中培养过夜；
(2)接种种子罐：再将步骤(1)所得活化后的菌液接种种子罐培养至OD600≥4；
(3)移种发酵罐培养：将种子罐中所有菌液转移至50L发酵罐，温度37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4；
(4)流加补料培养：按照3.5mL/min的速度起始，每小时递增3.5mL/min的速度，缓慢流加25％的葡萄糖，继续维持上述条件培养；
(5)诱导表达：培养至OD600≥30，停止补葡萄糖，30min后，流加诱导培养基，按照10mL/min的速度起始，约30min后降温至18℃，添加0.5mM IPTG，每3h递增7mL/min的速度持续流加诱导培养基；诱导12h，停止培养；所述的诱导培养基为：大豆蛋白胨48g/L、酵母提取物96g/L、甘油20％、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L；
(6)离心收菌、破碎澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液；
所述的破碎澄清为用pH8.5的50mM Tris-HCl重悬菌体，高压均质机800-1000psi破碎菌体，用中空纤维柱澄清，收集澄清后的液体即为重组轮状病毒ΔVP8*抗原的蛋白原液。
2.根据权利要求1所述的高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：步骤(1)所述的培养基为：大豆蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、硫酸卡那霉素100μg/mL。
3.根据权利要求1所述的高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的接种种子罐为：按体积百分比3％的接种量接种10L种子罐，37℃，通空气并搅拌，维持溶氧在30％以上，培养至OD600≥4。
4.根据权利要求1或3所述的高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：步骤(2)所述的培养基为5L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L、硫酸卡那霉素100μg/mL。
5.根据权利要求1所述的高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：步骤(3)所述的培养基为25L：大豆蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、二水合磷酸二氢钠2.21g/L、十二水合磷酸氢二钠28.65g/L。
6.根据权利要求1所述的高密度发酵表达重组轮状病毒ΔVP8*抗原的培养方法，其特征在于：所述的离心收菌为6000r/min，离心10min，收获菌体。
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