CN111004761A - 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法和应用 - Google Patents

一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种L‑酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L‑酪氨酸合成相关基因进行对应改造，仅包括莽草酸途径的强化，解除tyrAB关键酶的转录负调控两步分子操作。本发明基因工程菌的菌株遗传背景清晰，需要操作的基因较少且基因操作简单高效，菌株改造周期明显缩短，同时，无需对L‑酪氨酸合成途径中的关键基因tyrAB进行任何修饰，打破L‑酪氨酸生产菌株构建的常规操作。此外菌株不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素，同时无需添加任何诱导剂，降低了生产成本，避免了IPTG等诱导剂对细胞的伤害。

Description

一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法和应用。
背景技术
芳香族化合物，如芳香族氨基酸、石油化工芳香族化合物甚至芳香族聚合物，是非常重要的工业原料。其中，L-酪氨酸及其各种衍生物在医药和化学工业中的广泛应用，长期以来受到人们的关注。L-酪氨酸是各种次生代谢产物，包括苄基异喹啉生物碱、黄酮类化合物和苯乙烯类化合物、帕金森病药物3，4-二羟基-L-苯丙氨酸(L-多巴)和黑色素。尽管之前有大量关于L-酪氨酸生物合成途径的研究，由于L-酪氨酸生物合成所需的反应相对较多(以3-脱氧-D-阿拉伯-7-磷酸为底物开始的9次酶促转化)以及转录和代谢水平上的复杂调控，微生物生产L-酪氨酸的过量仍然具有挑战性。因此，各种代谢工程方法已用于开发微生物菌株，以提高L-酪氨酸的产量。
L-酪氨酸的生产方法包括蛋白水解法、化学合成法、酶法和直接发酵法。现在的L-酪氨酸生产方法主要是蛋白水解法和酶法，但这些方法容易受到原料来源的限制、反应过程中酶活性和稳定性差、工艺繁琐、产品成分复杂等。而微生物发酵法生产氨基酸具有操作简单、原料轻易可得、生产环境较为稳定、生产成本较低等优点。随着代谢工程技术的不断发展，对微生物中L-酪氨酸的合成途径进行合理设计和优化以实现L-酪氨酸的发酵生产成为研究热点。
目前，大肠杆菌中L-酪氨酸的生物合成途径已被全面研究，而经分子生物学手段得到可积累L-酪氨酸菌株的策略主要集中在解除途径调控、增加前体供应、阻断竞争途径和调节转运系统等几个方面。虽然已报道的关于L-酪氨酸代谢工程的研究已经充分阐释了其代谢途径中的关键基因、调控机理和改造靶点等，但L-酪氨酸的发酵生产依然存在产量低或糖酸转化率低的问题。同时多数研究通常把关键酶tyrAB的解反馈和强化表达作为首要任务，未曾对仅缺失阻遏蛋白TyrR来积累L-酪氨酸进行研究。这可能是L-酪氨酸生产菌株构建过程中的一个误区。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法和应用，该工程菌的菌株遗传背景清晰，需要操作的基因较少且基因操作简单高效，菌株改造周期明显缩短。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种L-酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，仅包括莽草酸途径的强化，解除tyrAB关键酶的转录负调控两步分子操作。
而且，所述工程菌在制备时，首先，为避免添加诱导剂IPTG，敲除了大肠杆菌基因组上乳糖操纵子中的调节基因lacI，接着将受trc启动子控制的aroG(S180F)整合到yjiv假基因位点，再次，敲除了对L-酪氨酸合成基因tyrAB有阻遏作用的基因tyrR。
而且，所述基因工程菌以E.coli W3110为出发菌株。
如上所述的L-酪氨酸基因工程菌的构建方法，步骤如下：
⑴采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术，以E.coli W3110为出发菌株，敲除lacI基因；
⑵构建Ptrc启动子和aroG(S180F)的连接片段，并将其整合至yjiv假基因位点；
⑶敲除tyrR基因，即得L-酪氨酸基因工程菌。
利用如上所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，步骤如下：
利用摇瓶发酵生产L-酪氨酸：
按10-15％的接种量进行发酵培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加氨水控制pH在7.0-7.2，发酵过程中补加葡萄糖溶液。
利用如上所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，步骤如下：
⑴种子培养：当种子培养液OD600达到10-15时，准备接入发酵培养基；
⑵发酵培养：按10％-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲流加80％的葡萄糖溶液，并通过测定发酵液中的葡糖糖浓度调整脉冲比，保证发酵液中的葡萄糖浓度控制在0.2-2g/L，发酵时间控制在24-26h。
而且，所述发酵培养基的配方为：
葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.5mg/L，pH7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
而且，所述微量元素混合液包括：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2 H2O 10g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5g/L，CuCl2·2 H2O 0.25g/L，H3BO3 0.125g/L。
如上所述的L-酪氨酸基因工程菌在L-酪氨酸生产方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明提供的L-酪氨酸基因工程菌的菌株遗传背景清晰，需要操作的基因较少且基因操作简单高效，菌株改造周期明显缩短，同时，无需对L-酪氨酸合成途径中的关键基因tyrAB进行任何修饰，打破L-酪氨酸生产菌株构建的常规操作。此外菌株不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素，同时无需添加任何诱导剂，降低了生产成本，避免了IPTG等诱导剂对细胞的伤害，发酵工艺简单、可控性强，摇瓶发酵22h，产量达11.8g/L，5L发酵罐发酵25h，产量可达41.2g/L，适合于工业化大规模生产。
2、本发明基因工程菌为通过分子生物学技术，在基因组层面对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行改造优化，仅包括莽草酸途径中成功解反馈抑制的aroG的强化表达和对tyrAB基因有阻遏作用的tyrR基因的敲除，未对L-酪氨酸合成途径中的关键基因tyrAB进行强化或解反馈修饰，打破了常规的L-酪氨酸生产育种思路，更大大简化了L-酪氨酸生产菌株构建的分子策略。最终得到的菌株经25h 5L发酵罐发酵可积累L-酪氨酸41.2g/L，大大提高了产酸水平，缩短了发酵周期。所述基因工程菌不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素和诱导剂，避免了诱导剂对细胞的伤害，降低了生产成本，完全可替代目前L-酪氨酸的工业化生产方式。
附图说明
图1为本发明中酪氨酸生产菌株的代谢途径修饰示意图；
图2为本发明中lacI敲除的验证图，其中，M:marker，1:上游同源臂，2:下游同源臂，3:重叠片段，4:原基因组条带，5:敲除后条带；
图3为本发明中Ptrc-aroG(S180F)::yjiv验证图，其中，M:marker，1:上游同源臂，2:Ptrc-aroG(S180F)片段，3:下游同源臂，4:重叠片段，5:整合后片段，6:原基因组片段；
图4为本发明中tyrR敲除验证图，其中，M:marker，1:上游同源臂，2:下游同源臂，3:重叠片段，4:原基因组条带，5:敲除后条带；
图5为本发明中菌株TY03发酵曲线图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种L-酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，仅包括莽草酸途径的强化，解除tyrAB关键酶的转录负调控两步分子操作。
较优地，所述工程菌在制备时，首先，为避免添加诱导剂IPTG，敲除了大肠杆菌基因组上乳糖操纵子中的调节基因lacI，接着将受trc启动子控制的aroG(S180F)整合到yjiv假基因位点，再次，敲除了对L-酪氨酸合成基因tyrAB有阻遏作用的基因tyrR。
较优地，所述基因工程菌以E.coli W3110为出发菌株。
如上所述的L-酪氨酸基因工程菌的构建方法，步骤如下：
⑴采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术，以E.coli W3110为出发菌株，敲除lacI基因；
⑵构建Ptrc启动子和aroG(S180F)的连接片段，并将其整合至yjiv假基因位点；
⑶敲除tyrR基因，即得L-酪氨酸基因工程菌。
利用如上所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，步骤如下：
利用摇瓶发酵生产L-酪氨酸：
按10-15％的接种量进行发酵培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加氨水控制pH在7.0-7.2，发酵过程中补加葡萄糖溶液。
利用如上所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，步骤如下：
⑴种子培养：当种子培养液OD600达到10-15时，准备接入发酵培养基；
⑵发酵培养：按10％-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲流加80％的葡萄糖溶液，并通过测定发酵液中的葡糖糖浓度调整脉冲比，保证发酵液中的葡萄糖浓度控制在0.2-2g/L，发酵时间控制在24-26h。
较优地，所述发酵培养基的配方为：
葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.5mg/L，pH7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
较优地，所述微量元素混合液包括：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2 H2O 10g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5g/L，CuCl2·2 H2O 0.25g/L，H3BO3 0.125g/L。
如上所述的L-酪氨酸基因工程菌能够应用在L-酪氨酸生产方面中。
相关制备如下：
一、大肠杆菌L-酪氨酸基因工程菌株的构建
以下基因的敲除与整合均采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术。
(1)lacI基因的敲除
①以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据lacI基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物(lacI-1、lacI-2)和下游同源臂引物(lacI-3、lacI-4)，通过HS酶PCR扩增获得lacI基因的上、下游同源臂；
②以步骤①中获得的扩增片段为模板，通过HS酶重叠PCR获得lacI基因敲除片段，所述基因敲除片段由lacI基因上、下游同源臂组成；
③以pGRB-lacI-F和pGRB-lacI-R为引物，通过退火构建pGRB-lacI使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-lacI；
④将步骤②和③中获得的lacI基因敲除片段和pGRB-lacI质粒同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pGRB-lacI、pREDCas9后获得菌株E.coli TR01。
lacI敲除验证图见图2。
(2)Ptrc-aroG(S180F)基因整合至yjiv位点
①以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据aroG基因序列，分别在基因两端设计aroG(S180F)突变上游同源臂引物(aroG(S180F)-1、aroG(S180F)-2)和aroG(S180F)突变下游同源臂引物(aroG(S180F)-3、aroG(S180F)-4)，其中aroG(S180F)-2和aroG(S180F)-3同时含突变序列(TCT突变为TTT)且反向互补，通过HS酶PCR技术扩增获得aroG(S180F)基因的上、下游同源臂，再以其上、下游同源臂为模板，通过Ex.taq酶重叠PCR获得含aroG(S180F)突变的片段，所述突变片段由aroG(S180F)突变上游同源臂和aroG(S180F)突变下游同源臂组成。将突变片段与T载体连接后化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒后测序确定成功构建T载-aroG(S180F)；
②以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据yjiv基因序列，分别在基因两端设计yjiv上游同源臂引物(yjiv-1、yjiv-2)和yjiv下游同源臂引物(yjiv-3、yjiv-4)，以步骤①中构建的T载-aroG(S180F)为模板，根据aroG基因序列设计引物(aroG(S180F)-5、aroG(S180F)-6)，其中trc启动子序列设计在yjiv-2和aroG(S180F)-5上，通过HS酶PCR扩增获得各基因片段，再以其为模板，通过HS酶重叠PCR获得Ptrc-aroG(S180F)基因整合片段，所述基因整合片段由yjiv上游同源臂、Ptrc-aroG(S180F)和yjiv下游同源臂组成；
③以pGRB-yjiv-F和pGRB-yjiv-R为引物，通过退火构建PGRB-yjiv使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-yjiv；
④将步骤②和③中获得的Ptrc-aroG(S180F)基因整合片段和pGRB-yjiv质粒同时电转化至含有pREDCas9的E.coli TYR03电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pGRB-yjiv、pREDCas9后获得菌株E.coli TY02。
Ptrc-aroG(S180F)::yjiv的验证图见图3。
(3)tyrR基因的敲除
①以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据tyrR基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物(tyrR-1、tyrR-2)和下游同源臂引物(tyrR-3、tyrR-4)，通过HS酶PCR扩增获得tyrR基因的上、下游同源臂；
②以步骤①中获得的扩增片段为模板，通过HS酶重叠PCR获得tyrR基因敲除片段，所述基因敲除片段由tyrR基因上、下游同源臂组成；
③以pGRB-tyrR-F和pGRB-tyrR-R为引物，通过退火构建pGRB-tyrR使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-tyrR；
④将步骤②和③中获得的tyrR基因敲除片段和pGRB-tyrR质粒同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pGRB-tyrR、pREDCas9后获得菌株E.coli TR03。
tyrR敲除验证图见图4。
上述实验过程所用引物见下表：
Figure BDA0002297995070000071
Figure BDA0002297995070000081
二、摇瓶发酵
(1)种子培养：将斜面菌种接种至装液量为30mL的500mL圆底三角瓶中，九层纱布封口，37℃、200r/min培养12h；
(2)发酵培养：按10％的接种量接种至装液量为30mL的500mL挡板三角瓶中，九层纱布封口，37℃、220r/min培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加25％的氨水控制pH在7.0-7.2，通过补加60％的葡萄糖溶液维持发酵进行。发酵22h，L-酪氨酸产量为11.8g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，微量元素混合液(Na2MoO4·2H2O2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO30.125g/L)1mL/L，VB10.5mg/L，VH0.1mg/L，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
三、5L发酵罐发酵具体方法如下：
(1)种子培养：在无菌条件下，将适量无菌水倒入茄形斜面中，用接种环悬浮菌体，然后采用火焰接种的方式将菌悬液接种于种子培养基中进行培养。培养温度为37℃，初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为200r/min，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，当溶氧低于25％时，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，每隔2h测样、记录数据，当OD600达到10-15时，准备接入发酵培养基。
(2)发酵培养：按15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，以一定的脉冲比流加80％的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖残糖浓度为0.05-2g/L。发酵25h，L-酪氨酸产量为41.2g/L。
发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，微量元素混合液(Na2MoO4·2H2O2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO30.125g/L)1.5mL/L，VB10.5mg/L，VH0.5mg/L，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
菌株TY03发酵曲线见图5。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法和应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> lacI-1(Unknown)
<400> 1
cttctgaaaa ccgcctcggg cc 22
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> lacI -2(Unknown)
<400> 2
cgcgcgggga gaggcggttt gttcacattc accaccctga attgac 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> lacI -3(Unknown)
<400> 3
gtcaattcag ggtggtgaat gtgaacaaac cgcctctccc cgcgcg 46
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> lacI -4(Unknown)
<400> 4
cgagtaacaa cccgtcggat tctcc 25
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-lacI-F(Unknown)
<400> 5
agtcctaggt ataatactag taacggtctg ataagagaca cgttttagag ctagaa 56
<210> 6
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-lacI-R(Unknown)
<400> 6
ttctagctct aaaacgtgtc tcttatcaga ccgttactag tattatacct aggact 56
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-1(Unknown)
<400> 7
caccgctggc aaggcttaga gt 22
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-2(Unknown)
<400> 8
gaagccgacc ggacaaaaaa gccctgatgc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-3(Unknown)
<400> 9
gcatcagggc ttttttgtcc ggtcggcttc 30
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-4(Unknown)
<400> 10
caaaccaggg taaagcgaag ta 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> yjiv-1(Unknown)
<400> 11
gtgctggagg gatgattgtt g 21
<210> 12
<211> 76
<212> DNA
<213> yjiv-2(Unknown)
<400> 12
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacgca 60
gtacttcctg ctggct 76
<210> 13
<211> 47
<212> DNA
<213> yjiv-3(Unknown)
<400> 13
tgcagtaaaa gcgcgtcgcg ggtaacgaat taccggcgtt cactata 47
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> yjiv-4(Unknown)
<400> 14
tcacctccac cagcacatcc 20
<210> 15
<211> 82
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-5(Unknown)
<400> 15
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgaattatc agaacgacga tt 82
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> aroG(S180F)-6(Unknown)
<400> 16
tatagtgaac gccggtaatt cgttacccgc gacgcgcttt tactgca 47
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-yjiv-F(Unknown)
<400> 17
agtcctaggt ataatactag tatcccgcat ttcttaaagt cgttttagag ctagaa 56
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-yjiv-R(Unknown)
<400> 18
ttctagctct aaaacgactt taagaaatgc gggatactag tattatacct aggact 56
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> tyrR-1(Unknown)
<400> 19
agccgtttgc gtctgtttaa g 21
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> tyrR-2(Unknown)
<400> 20
actcagacca tattcccgca acgggcactt cggcgtaaag at 42
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> tyrR-3(Unknown)
<400> 21
atctttacgc cgaagtgccc gttgcgggaa tatggtctga gt 42
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> tyrR-4(Unknown)
<400> 22
agtgctgaac attttcccga gt 22
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-tyrR-F(Unknown)
<400> 23
agtcctaggt ataatactag tctcgatcta ctcgtgctaa ggttttagag ctagaa 56
<210> 24
<211> 56
<212> DNA
<213> pGRB-tyrR-F(Unknown)
<400> 24
ttctagctct aaaaccttag cacgagtaga tcgagactag tattatacct aggact 56

Claims (9)

1.一种L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，仅包括莽草酸途径的强化，解除tyrAB关键酶的转录负调控两步分子操作。
2.根据权利要求1所述的L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述工程菌在制备时，首先，为避免添加诱导剂IPTG，敲除了大肠杆菌基因组上乳糖操纵子中的调节基因lacI，接着将受trc启动子控制的aroG(S180F)整合到yjiv假基因位点，再次，敲除了对L-酪氨酸合成基因tyrAB有阻遏作用的基因tyrR。
3.根据权利要求1或2所述的L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以E.coliW3110为出发菌株。
4.如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：
⑴采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术，以E.coliW3110为出发菌株，敲除lacI基因；
⑵构建Ptrc启动子和aroG(S180F)的连接片段，并将其整合至yjiv假基因位点；
⑶敲除tyrR基因，即得L-酪氨酸基因工程菌。
5.利用如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：
利用摇瓶发酵生产L-酪氨酸：
按10-15％的接种量进行发酵培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加氨水控制pH在7.0-7.2，发酵过程中补加葡萄糖溶液。
6.利用如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴种子培养：当种子培养液OD600达到10-15时，准备接入发酵培养基；
⑵发酵培养：按10％-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲流加80％的葡萄糖溶液，并通过测定发酵液中的葡糖糖浓度调整脉冲比，保证发酵液中的葡萄糖浓度控制在0.2-2g/L，发酵时间控制在24-26h。
7.根据权利要求6所述的生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：
葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，VB10.5 mg/L，VH0.5 mg/L，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
8.根据权利要求7所述的生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：所述微量元素混合液包括：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO30.125 g/L。
9.如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌在L-酪氨酸生产方面中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080102499A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-01 Lori Jean Templeton Method of enhancing L-tyrosine production in recombinant bacteria
US20080118958A1 (en) * 2006-06-07 2008-05-22 Gatenby Anthony A Method for producing an L-tyrosine over-producing bacterial strain
US20150044734A1 (en) * 2011-09-02 2015-02-12 The Regents Of The University Of Califonia Metabolic engineering of the shikimate pathway
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN106282078A (zh) * 2015-06-10 2017-01-04 上海医药工业研究院 一种生产莽草酸的重组菌株及其制备方法与应用
CN108753860A (zh) * 2018-04-03 2018-11-06 天津科技大学 大肠杆菌基因工程菌的构建及其生产l-色氨酸的用途
CN109266592A (zh) * 2018-08-23 2019-01-25 天津科技大学 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法
CN109415684A (zh) * 2016-03-02 2019-03-01 Ptt全球化学公众有限公司 从基因工程微生物改进的黏康酸生产
CN109628365A (zh) * 2019-01-09 2019-04-16 江南大学 一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080118958A1 (en) * 2006-06-07 2008-05-22 Gatenby Anthony A Method for producing an L-tyrosine over-producing bacterial strain
US20080102499A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-01 Lori Jean Templeton Method of enhancing L-tyrosine production in recombinant bacteria
US20150044734A1 (en) * 2011-09-02 2015-02-12 The Regents Of The University Of Califonia Metabolic engineering of the shikimate pathway
CN104946575A (zh) * 2014-03-26 2015-09-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
CN106282078A (zh) * 2015-06-10 2017-01-04 上海医药工业研究院 一种生产莽草酸的重组菌株及其制备方法与应用
CN109415684A (zh) * 2016-03-02 2019-03-01 Ptt全球化学公众有限公司 从基因工程微生物改进的黏康酸生产
CN108753860A (zh) * 2018-04-03 2018-11-06 天津科技大学 大肠杆菌基因工程菌的构建及其生产l-色氨酸的用途
CN109266592A (zh) * 2018-08-23 2019-01-25 天津科技大学 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法
CN109628365A (zh) * 2019-01-09 2019-04-16 江南大学 一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TINA LÜTKE-EVERSLOH 等: "L-Tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli", 《APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY》 *
Y M GER等: "A Single Ser-180 Mutation Desensitizes Feedback Inhibition of the Phenylalanine-Sensitive 3-Deoxy-D-Arabino-Heptulosonate 7-Phosphate (DAHP) Synthetase in Escherichia coli", 《J BIOCHEM》 *
姚元锋 等: "L-酪氨酸代谢工程研究进展", 《食品与发酵工业》 *
鄢方清 等: "大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展", 《生物加工过程》 *
陈伟 等: "pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用", 《生物工程学报》 *

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