CN109628365A - 一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法 - Google Patents

一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM‑PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM‑PD)的基因tyrAfbr，大大提高了大肠杆菌的酪氨酸产量；将利用本发明的方法得到的大肠杆菌工程菌诱导发酵40h，可使发酵液中酪氨酸的含量高达55.4g/L，生产强度高达1.285g/L/h。

Description

一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)的化学名称为2-氨基-3-对羟苯基丙酸，是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，也是一种人体的条件必需氨基酸。
它常被用作苯丙酮尿症患者的营养补充剂，多肽类激素、抗生素、L-多巴等医药化工产品的制备原料，以及合成如白藜芦醇、柚皮素、生松素等高附加值酪氨酸衍生物的前体，在食品、饲料、医药、化工等领域均有很重要的应用。
目前，工业上主要由酶法来制备酪氨酸，利用酶法制备酪氨酸具有周期短、选择性强、转化率高和分离纯化步骤简单的优点，但是，天然酶活性低和稳定性差等缺点限制了酶法的应用。而与酶法相比，微生物发酵法可以利用生物质原料实现酪氨酸的从头合成，从而降低酪氨酸的生产成本；同时，微生物发酵法在稳定性方面具有明显对的优势。因此，利用微生物发酵法生产酪氨酸以代替酶法生产酪氨酸极具市场潜力。
但是，现有的酪氨酸生产菌，如E.coli DPD4193(Olson,M.M.,Templeton,L.J.,Suh,W.,Youderian,P.,Sariaslani,F.S.,Gatenby,A.A.,Dyk,T.K.V.,2007.Productionof tyrosine from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes tophenylalanine-producing Escherichia coli strains.Appl Microbiol Biot.74,1031-1040)、E.coli ygdT KO(Santos,C.N.S.,Stephanopoulos,G.,2008.Melanin-based high-throughput screen for L-tyrosine production in Escherichia coli.Applied andEnvironmental Microbiology.74,1190-1197.)、E.coli F(Juminaga,D.,Baidoo,E.E.K.,Redding-Johanson,A.M.,Batth,T.S.,Burd,H.,Mukhopadhyay,A.,Petzold,C.J.,Keasling,J.D.,2012.Modular Engineering of L-Tyrosine Production inEscherichia coli.Applied and Environmental Microbiology.78,89-98.)等，酪氨酸产量均较低，仅有0.18g/L、0.59g/L、2.65g/L，这无疑大大阻碍了微生物发酵法生产酪氨酸的工业化进程。因此，急需找到可提高酪氨酸生产菌酪氨酸产量的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是得到一种提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，所述方法为敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。
在本发明的一种实施方式中，编码所述分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述aroGfbr和/或tyrAfbr是通过与热诱导表达载体pAP-B03质粒组装在大肠杆菌工程菌中进行表达的。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。
本发明还提供了应用上述方法制备得到大肠杆菌基因工程菌。
本发明还提供了一种生产酪氨酸的方法，所述方法为使用上述大肠杆菌基因工程菌，将上述大肠杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵为将上述大肠杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中培养至OD600＝23～27后，将温度控制在36～40℃进行诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵为将上述大肠杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中培养至OD600＝23～27后，将温度控制在38℃进行诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖35g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 3g/L、NaCl 1g/L、柠檬酸钠1.5g/L、CaCl2·2H2O 0.015g/L、CaCO3 12g/L、FeSO4·7H2O 0.1125g/L、维生素B1 0.075g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉2g/L、硫酸卡那霉素0.04g/L以及微量元素营养液(TES)1.5mL/L；所述微量元素营养液(TES)的成分包含Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L、CoSO4·7H2O 0.75g/L、CuSO4·5H2O 2.5g/L、H3BO3 0.5g/L、MnSO4·H2O 24g/L、Na2MoO4·2H2O 3.0g/L、NiSO4·6H2O 2.5g/L、ZnSO4·7H2O 15g/L。
本发明还提供了上述一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法或上述大肠杆菌基因工程菌或上述方法在制备酪氨酸方面的应用。
[有益效果]
(1)本发明通过在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr，大大提高了大肠杆菌的酪氨酸产量；利用本发明的方法得到的大肠杆菌工程菌诱导发酵40h，可使发酵液中酪氨酸的含量高达55.4g/L，生产强度高达1.285g/L/h；
(2)本发明的菌株使用了热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr，相较于其他需要添加价格昂贵的诱导剂的工程菌株，本发明的菌株可通过热诱导表达目的基因来生产酪氨酸，具有经济节约且不易染菌的优点，更适合进行工业上的大规模生产。
附图说明
图1：CM-PD酶及DS酶在大肠杆菌中的表达情况。
图2：大肠杆菌HGXP、HSP、HTP、HRP在摇瓶发酵下的酪氨酸产量。
图3：大肠杆菌HRP的恒速补料分批发酵曲线。
图4：大肠杆菌HRP的线性补料分批发酵曲线。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109以及大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)的保藏编号为CCTCC No：M2010009。
下述实施例中涉及的pAP-B03质粒记载于文献“Zhou,H.,Liao,X.,Wang,T.,Du,G.,Chen,J.,2010.Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression ofpheAfbr and aroFwt.Bioresource Technology.101(11):4151-4156.”中；下述实施例中涉及的pCas和p-Target质粒记载于文献“Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.,2015.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Applied and Environmental Microbiology.81(7):2506-2514.”中；下述实施例中涉及的重组质粒pCDF-aroGfbr-tyrAfbr记载于文献“Wu,J.,Zhou,T.,Du,G.,Zhou,J.,Chen,J.,2014.Modular optimization of heterologous pathways for de novosynthesis of(2S)-naringenin in Escherichia coli.PloS One.9(7):1-9.”中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基(LB培养基)：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。
发酵培养基：葡萄糖35g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4·7H2O 3g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L、CaCl2·2H2O 0.015g/L、CaCO3 12g/L、FeSO4·7H2O 0.1125g/L、维生素B1 0.075g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉2g/L、硫酸卡那霉素0.04g/L、微量元素营养液(TES)1.5mL/L、pH 6.8±0.1；
其中，TES溶液：Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L、CoSO4·7H2O 0.75g/L、CuSO4·5H2O2.5g/L、H3BO3 0.5g/L、MnSO4·H2O 24g/L、Na2MoO4·2H2O 3.0g/L、NiSO4·6H2O 2.5g/L、ZnSO4·7H2O 15g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
酪氨酸含量的检测方法：
HPLC检测，采用Agilent C18(250×4.6mm)色谱柱，流动相为0.1mol/L乙酸钠(冰乙酸调节pH至4.0)和甲醇，体积百分比为90％和10％，流速1.0mL/min，紫外检测器波长为280nm，柱温30℃，进样量10μL。
DCW检测方法：
测定发酵罐发酵培养中的菌体浓度需在定容前加6mol/L的HCl溶解发酵液中的酪氨酸，处理后的发酵液经12 000r/min离心10min，弃上清；菌体沉淀用去离子水洗涤2次，离心后得到的湿菌体在105℃下烘干至恒重，计算出细胞干重(Dry cell weight，DCW)；发酵液稀释至适当的范围后，使用722s型分光光度计测定其在600nm处的吸光度(OD600)，得到OD600与DCW的关系式，其中，DCW(g/L)＝0.364×OD600。
葡萄糖含量检测方法：
取1mL发酵液经12 000r/min离心5min，上清液稀释一定倍数，采用葡萄糖-乳酸生物传感分析仪(深圳西尔曼科技有限公司)测定葡萄糖浓度。
乙酸含量检测方法：
取1mL发酵液于12 000r/min下离心10min，上清经过适当的稀释处理和经水系滤膜过滤后，用于高效液相色谱检测。使用Agilent 1260高效液相色谱仪检测发酵液中乙酸的含量。采用Aminex HPX-87H色谱柱，视差折光检测器，流动相为0.005mol/L H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温40℃，进样量10μL。
底物转化率计算方法：
底物转化率(mol/mol)＝产物总摩尔数(mol)/葡萄糖消耗总摩尔数(mol)。
生产强度计算方法：
生产强度(g/L/h)＝酪氨酸产量(g/L)/发酵总时间(h)。
实施例1：大肠杆菌出发菌株HGX的构建
将大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)通过连续传代，消除其自身所携带的pAP-B03质粒，得到不含质粒的大肠杆菌HGX作为出发菌株。
实施例2：大肠杆菌pheA单基因敲除菌的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas质粒转入出发菌株HGX，构建菌株HGX(pCas)；
(2)根据pheA上下游500bp基因序列设计特异性引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，扩增上下游基因，其中，扩增引物如下：
pheA-up-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)：
5-AAACACATCTGATTAATCCACATATCATTCT-3；
pheA-up-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)：
5-CACATCATCCGGCACCTTTTCAAGTGTTGCCTTTTTGTTATCAATAAAAAAG-3；
pheA-down-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)：
5-CTTTTTTATTGATAACAAAAAGGCAACACTTGAAAAGGTGCCGGATGATGTG-3；
pheA-down-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)：
5-CATACCAATGGTTTCTGGAGCAAATT-3；
PCR条件如下：94℃变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s，72℃延伸30s；
(3)使用融合PCR技术将将(2)得到的上下游基因连接，得到pheA基因上下游同源臂；
(4)设计引物，以p-Target质粒为模板使用PCR定点突变技术构建pheA-pTarget质粒，其中，所用引物如下：
pheA-sgRNA-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)：
5-AGATTCCGTATTAACTCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3；
pheA-sgRNA-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)：
5-GCTGAGTTAATACGGAATCTACTAGTATTATACCTAGGAC-3；
(5)设计引物，通过PCR验证(4)得到的pheA-pTarget质粒，其中，所用引物如下：
pheA-sgRNA-v-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)：
5-GACCTACACCGAACTGAGATACCTA-3；
pheA-sgRNA-v-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)：
5-GCTCTAAAACGCTGAGTTAATACG-3；
(6)将(3)得到的pheA基因上下游同源臂和(5)得到的pheA-pTarget质粒电转化HGX(pCas)感受态细胞，得到大肠杆菌pheA单基因敲除菌HGXΔpheA。
实施例3：大肠杆菌tyrR单基因敲除菌的构建
具体步骤如下：
(1)将pCas质粒转入出发菌株HGX，构建菌株HGX(pCas)；
(2)根据tyrR上下游500bp基因序列设计特异性引物，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，扩增上下游基因，其中，所用引物如下：
tyrR-up-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)：
5-ATTTGGTCCAGCCAGTTTTAGATGC-3；
tyrR-up-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)：
5-CTGAAACTCTCAAACTCCAGGCAGGAAGGTTTCTGTCAACAATCA-3；
tyrR-down-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)：
5-GTTGACAGAAACCTTCCTGCCTGGAGTTTGAGAGTTTCAGCAGTC-3；
tyrR-down-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)：
5-TTTACCTGTACCTGTGTCACCCGTA-3；
PCR条件如下：94℃变性2min；98℃变性30s；60℃退火30s，72℃延伸30s；
(3)使用融合PCR技术将(2)得到的上下游基因连接，得到tyrR基因上下游同源臂；
(4)设计引物，以p-Target质粒为模板使用PCR定点突变技术构建tyrR-pTarget质粒，其中，所用引物如下：
tyrR-sgRNA-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)：
5-CTCGATCTACTCGTGCTAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA-3；
tyrR-sgRNA-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)：
5-ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTG-3；
(5)设计引物，通过PCR验证(4)得到的tyrR-pTargett质粒，其中，所用引物如下：
tyrR-sgRNA-v-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)：
5-GACCTACACCGAACTGAGATACCTA-3；
tyrR-sgRNA-v-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)：
5-CTAGCTCTAAAACCTTAGCACGAGT-3；
(6)将(3)得到的tyrR基因上下游同源臂以及(5)得到的tyrR-pTarget质粒电转化HGX(pCas)感受态细胞，得到大肠杆菌tyrR单基因敲除菌HGXΔtyrR。
实施例4：大肠杆菌aroP/tyrR双基因敲除菌的构建
具体步骤如下：
在实施例2得到的大肠杆菌单基因敲除菌HGXΔpheA的基础上使用实施例3的方法继续敲除tyrR基因构建大肠杆菌pheA/tyrR双基因敲除菌HGXΔpheA/tyrR。
实施例5：热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr的构建
使用Gibson组装技术将质粒pAP-B03上的热诱导表达原件cI857、pR、pL与质粒pCDF-aroGfbr-tyrAfbr上的aroGfbr、tyrAfbr基因进行组装，构建热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr。
具体步骤如下：
(1)使用Bgl II和Nco I双酶切质粒pAP-B03，通过胶回收试剂盒回收目的片段，获得含有Kan抗性基因、p15A复制子、cI857和pR的长度为4545bp的线性化载体；
(2)设计带有同源臂的引物，以pAP-B03质粒为模板，PCR获得片段pL，其中，扩增引物如下：
pL-up(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)：
5-CGTCGCGGGTAAGAGGTTTATTATGGTTGCTGAATTG-3；
pL-down(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)：
5-TTCAGCAACCATAGTGTTGCCTTTTTGTTATCAATAA-3；
PCR条件如下：94℃变性2min；98℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸1min；
(3)设计带有同源臂的引物，以pCDF-aroGfbr-tyrAfbr质粒为模板，PCR获得片段aroGfbr、tyrAfbr，其中，扩增引物如下：
aroG-up(核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示)：
5-GGCAAACCAAGACAGCTAAAATGAATTATCAGAACGACGATTTAC-3；
aroG-down(核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)：
5-ATAATAAACCTCTTACCCGCGACGCGCTTTTACTGCA-3；
tyrA-up(核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)：
5-GCAACACTATGGTTGCTGAATTGACCGCATTAC-3；
tyrA-down(核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)：
5-TCCAGATAGAACATCTCTTCCTTACTGGCGATTGTCATTCGCCTGA-3；
PCR条件如下：94℃变性2min；98℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸70s。
(4)将回收后的4个片段稀释适当的倍数，制备含有4个片段各1μL、AssemblyMaster Mix(2×)5μL以及H2O 1μL的体系，使用Gibson组装试剂盒将制备好的体系置于50℃反应60min，得到热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr；
(5)将热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr转化大肠杆菌JM109，菌落PCR验证得到正确的热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr，其中，PCR验证的引物如下：
pL-up(核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示)：
5-CGTCGCGGGTAAGAGGTTTATTATGGTTGCTGAATTG-3；
pL-down(核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示)：
5-TTCAGCAACCATAGTGTTGCCTTTTTGTTATCAATAA-3。
实施例6：重组大肠杆菌的构建及摇瓶发酵
具体步骤如下：
(1)将实施例5得到的热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr分别转化出发菌株HGX、单基因敲除菌HGXΔpheA、单基因敲除菌HGXΔtyrR以及双基因敲除菌HGXΔpheA/tyrR，得到重组大肠杆菌HGXP、HSP、HTP以及HRP；
(2)将(1)得到的重组大肠杆菌HGXP、HSP、HTP以及HRP在LB平板(通过在LB培养基中添加20g/L琼脂得到)上划线，于37℃培养10～14h，获得单菌落；
(3)将50mL LB培养基加入500mL的摇瓶中；
(4)挑取(2)所得的单菌落至LB培养基，37℃，200r/min培养10～14h，得到种子液；
(5)将25mL发酵培养基加入25mL的摇瓶中；
(6)将(4)得到的重组大肠杆菌HGXP、HSP、HTP以及HRP分别以10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，于33℃培养至OD600＝1.5～2.0，升温至38℃继续发酵培养至48h，得到发酵液。
检测发酵液中的酪氨酸含量，检测结果如图2。
由图2可知，重组大肠杆菌HGXP发酵得到的发酵液中酪氨酸含量为3.14g/L；重组大肠杆菌HSP、HTP以及HRP发酵得到的发酵液中酪氨酸含量分别为4.42g/L、3.98g/L以及5.84g/L，均较HGXP有了明显的提升。
实施例7：诱导发酵的时间对重组大肠杆菌HRP上罐发酵后酪氨酸产量的影响
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基加入500mL的摇瓶中；
(2)将实施例6得到的重组大肠杆菌HRP的单菌落接种至种子培养基中，于37℃培养10～14h，得到种子液；
(3)将1.1L发酵培养基加入3-L的发酵罐中；
(4)将(2)得到的种子液以10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，于33℃培养至DCW＝7.22(对数前期)、9.32(对数中期)、11.44(对数后期)时升温至38℃，继续进行诱导发酵约40h，得到发酵液。
检测整个发酵过程中发酵液中的各发酵参数的变化，检测结果见表1。
由表1可知，在DCW＝7.22时诱导，细胞生长在后期几乎停滞，菌体生长情况受到影响，DCW只能达到15.72g/L；在DCW＝9.32时诱导，酪氨酸的产量最高，为40.23g/L，比在DCW＝7.22时诱导提高了68％，比在DCW＝11.44时诱导提高了29％；在DCW＝11.44时诱导，DCW可以达到18.68g/L，低于在DCW＝9.32时诱导的DCW，但高于在DCW＝7.22时诱导的DCW，这可能是因为在对数生长前期诱导可能会使细胞较早地开始合成酪氨酸，从而给菌体后期的生长带来压力，在对数后期诱导细胞对环境的适应能力下降，从而导致细胞生理和代谢发生变化，影响了产物的合成。
表1不同诱导时间下重组大肠杆菌HRP上罐发酵后各发酵参数的变化
实施例7：补料方式对重组大肠杆菌HRP上罐发酵后酪氨酸产量的影响
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基加入500mL的摇瓶中；
(2)将实施例6得到的重组大肠杆菌HRP的单菌落接种至种子培养基中，于37℃培养10～14h，得到种子液；
(3)将1.1L发酵培养基加入3-L的发酵罐中；
(4)将(2)得到的种子液以10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，控制初始转速400r/min，于33℃培养16h至OD600＝23～27后，升温至38℃，继续培养至40～44h，得到发酵液；在整个发酵过程中，通过流加20％的氨水控制pH在6.7～6.9，DO降至20％时逐步提高转速或通气量使DO维持在20％以上，当培养基中葡萄糖浓度耗尽时，开启补料程序流加700g/L的葡萄糖进行补料分批发酵，维持葡萄糖浓度在10g/L以下；补料方式有两种，A方案为采用F＝10mL/h的恒速流加策略进行补料，B方案为采用F＝(-0.55×t+25)mL/h的线性流加策略进行补料；其中，F为葡萄糖流加速度。
检测整个发酵过程中，采用A、B方案时，发酵液中酪氨酸、DCW、乙酸等参数的变化，检测结果见图3-4。
如图3-4，当采用A方案进行补料时，葡萄糖的浓度在40h之前一直维持在很低的水平(接近于0)，在这种葡萄糖供给不足的情况下，没有检测到副产物乙酸；由于前40h内菌体生长一直处于葡萄糖供应不足的条件，使得发酵时间有所延长；最高酪氨酸产量为50.7g/L，发酵周期为44h，酪氨酸生产强度为1.150g/L/h；
当采用B方案进行补料时，葡萄糖浓度维持在10g/L以内，乙酸浓度也维持在5g/L以下；酪氨酸的发酵时间缩短，酪氨酸的最高产量为55.4g/L，生产强度提高到1.285g/L/h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa 60
ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg 120
ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgcg atttgctgga aagattaatt 180
acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc 240
attgaagatt ccgtattaac tcagcaggct ttgctccaac aacatctcaa taaaattaat 300
ccgcactcag cacgcatcgc ttttctcggc cccaaaggtt cttattccca tcttgcggcg 360
cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc 420
gatattttta atcaggtgga aaccggccag gccgactatg ccgtcgtacc gattgaaaat 480
accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt 540
gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta 600
tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt 660
aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cgtctgcggc aatggaaaag 720
gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg 780
tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt 840
gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg 900
ttaatggcga ccgggcaaca agccggtgcg ctggttgaag cgttgctggt actgcgcaac 960
cacaatctga ttatgacccg tctggaatca cgcccgattc acggtaatcc atgggaagag 1020
atgttctatc tggatattca ggccaatctt gaatcagcgg aaatgcaaaa agcattgaaa 1080
gagttagggg aaatcacccg ttcaatgaag gtattgggct gttacccaag tgagaacgta 1140
gtgcctgttg atccaacctg a 1161
<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcgtctgg aagtcttttg tgaagaccga ctcggtctga cccgcgaatt actcgatcta 60
ctcgtgctaa gaggcattga tttacgcggt attgagattg atcccattgg gcgaatctac 120
ctcaattttg ctgaactgga gtttgagagt ttcagcagtc tgatggccga aatacgccgt 180
attgcgggtg ttaccgatgt gcgtactgtc ccgtggatgc cttccgaacg tgagcatctg 240
gcgttgagcg cgttactgga ggcgttgcct gaacctgtgc tctctgtcga tatgaaaagc 300
aaagtggata tggcgaaccc ggcgagctgt cagctttttg ggcaaaaatt ggatcgcctg 360
cgcaaccata ccgccgcaca attgattaac ggctttaatt ttttacgttg gctggaaagc 420
gaaccgcaag attcgcataa cgagcatgtc gttattaatg ggcagaattt cctgatggag 480
attacgcctg tttatcttca ggatgaaaat gatcaacacg tcctgaccgg tgcggtggtg 540
atgttgcgat caacgattcg tatgggccgc cagttgcaaa atgtcgccgc ccaggacgtc 600
agcgccttca gtcaaattgt cgccgtcagc ccgaaaatga agcatgttgt cgaacaggcg 660
cagaaactgg cgatgctaag cgcgccgctg ctgattacgg gtgacacagg tacaggtaaa 720
gatctctttg cctacgcctg ccatcaggca agccccagag cgggcaaacc ttacctggcg 780
ctgaactgtg cgtctatacc ggaagatgcg gtcgagagtg aactgtttgg tcatgctccg 840
gaagggaaga aaggattctt tgagcaggcg aacggtggtt cggtgctgtt ggatgaaata 900
ggggaaatgt caccacggat gcaggcgaaa ttactgcgtt tccttaatga tggcactttc 960
cgtcgggttg gcgaagacca tgaggtgcat gtcgatgtgc gggtgatttg cgctacgcag 1020
aagaatctgg tcgaactggt gcaaaaaggc atgttccgtg aagatctcta ttatcgtctg 1080
aacgtgttga cgctcaatct gccgccgcta cgtgactgtc cgcaggacat catgccgtta 1140
actgagctgt tcgtcgcccg ctttgccgac gagcagggcg tgccgcgtcc gaaactggcc 1200
gctgacctga atactgtact tacgcgttat gcgtggccgg gaaatgtgcg gcagttaaag 1260
aacgctatct atcgcgcact gacacaactg gacggttatg agctgcgtcc acaggatatt 1320
ttgttgccgg attatgacgc cgcaacggta gccgtgggcg aagatgcgat ggaaggttcg 1380
ctggacgaaa tcaccagccg ttttgaacgc tcggtattaa cccagcttta tcgcaattat 1440
cccagcacgc gcaaactggc aaaacgtctc ggcgtttcac ataccgcgat tgccaataag 1500
ttgcgggaat atggtctgag tcagaagaag aacgaagagt aa 1542
<210> 3
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 4
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300
gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540
ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900
cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tacagcgttt tcagagtgaa 1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaacacatct gattaatcca catatcattc t 31
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacatcatcc ggcacctttt caagtgttgc ctttttgtta tcaataaaaa ag 52
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cttttttatt gataacaaaa aggcaacact tgaaaaggtg ccggatgatg tg 52
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cataccaatg gtttctggag caaatt 26
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agattccgta ttaactcagc gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctgagttaa tacggaatct actagtatta tacctaggac 40
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacctacacc gaactgagat accta 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctctaaaac gctgagttaa tacg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atttggtcca gccagtttta gatgc 25
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgaaactct caaactccag gcaggaaggt ttctgtcaac aatca 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gttgacagaa accttcctgc ctggagtttg agagtttcag cagtc 45
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tttacctgta cctgtgtcac ccgta 25
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctcgatctac tcgtgctaag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat a 51
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
actagtatta tacctaggac tgagctagct g 31
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gacctacacc gaactgagat accta 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctagctctaa aaccttagca cgagt 25
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgtcgcgggt aagaggttta ttatggttgc tgaattg 37
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ttcagcaacc atagtgttgc ctttttgtta tcaataa 37
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggcaaaccaa gacagctaaa atgaattatc agaacgacga tttac 45
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ataataaacc tcttacccgc gacgcgcttt tactgca 37
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcaacactat ggttgctgaa ttgaccgcat tac 33
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tccagataga acatctcttc cttactggcg attgtcattc gcctga 46
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cgtcgcgggt aagaggttta ttatggttgc tgaattg 37
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttcagcaacc atagtgttgc ctttttgtta tcaataa 37

Claims (10)

1.一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法为敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR。
2.如权利要求1所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法为在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和/或编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。
3.如权利要求1或2所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，编码所述分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1-3任一所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，编码所述全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求2-4任一所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，编码所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.如权利要求2-5任一所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，编码所述分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.如权利要求1-6任一所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法为在敲除大肠杆菌中用于编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(CM-PDT)的基因pheA和编码全局性调控蛋白TyrR的基因tyrR的基础上，进一步在大肠杆菌中表达抗反馈抑制的编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和抗反馈抑制的编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。
8.应用权利要求1-7任一所述的方法制备得到大肠杆菌基因工程菌。
9.一种生产酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求8所述的大肠杆菌基因工程菌，将权利要求8所述的大肠杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。
10.权利要求1-7任一所述的一种可提高大肠杆菌酪氨酸产量的方法或权利要求8所述的大肠杆菌基因工程菌或权利要求9所述的方法在制备酪氨酸方面的应用。
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CN111004761A (zh) * 2019-12-02 2020-04-14 天津科技大学 一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法和应用
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