CN104995298A - 通过发酵由可再生资源生产苯酚的方法 - Google Patents

通过发酵由可再生资源生产苯酚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生成用于生产苯酚的重组宿主菌株的方法，其包括下述步骤：a)提供包含分支酸的宿主，b)用包含编码分支酸裂解酶的ubiC　(SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列转化所述宿主，所述分支酸裂解酶将分支酸转化为4-羟基苯甲酸，和c)用编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列转化所述宿主，所述4-羟基苯甲酸脱羧酶将4-羟基苯甲酸(4-HB)转化为苯酚，从而生成能够在好氧条件下生产苯酚的重组宿主，其中步骤b)和步骤c)同时或顺次进行。本发明还提供了可通过上述方法获得的用于生产苯酚的重组宿主菌株，以及在所述重组宿主菌株中生产苯酚的方法。

Description

通过发酵由可再生资源生产苯酚的方法
技术领域
本发明涉及在合适的重组宿主中由可再生资源(例如生物质)生产苯酚的领域。
前言
苯酚目前主要通过枯烯过程即化学过程，以每年几百万吨由化石原材料产生。与可再生的原材料例如可再生资源“生物质”相反，此类化石原材料是不可再生的。基于可再生资源例如生物质的生产过程将实现与化石资源的独立，并且具有免除大量CO2排放的潜力。
苯酚是酚醛树脂、双酚A己内酰胺及其他化学制品的工业生产中使用的化学中间产物。在本发明的背景下，在此处称为“生物苯酚”的基于可再生资源的苯酚是强烈需要的，以便降低生产成本且变得不依赖于化石资源。更重要的是，化学公司已经承诺对其自身过程以及通过在其原材料中增加可再生资源的使用两者而降低CO2排放。据此，生物苯酚具有避免化石资源以及节省CO2排放的高潜力。
分支酸在细菌中的生产描述于
中。
苯酚在细菌中的生产已由Wierckx NJP等人， 进行描述。
然而，由Wierckx等人使用的生物合成途径首先通过掺入来自谷氨酸盐的氨基由分支酸构建分子酪氨酸，并且随后将其分解为苯酚，再释放氨基。该途径包括更多反应步骤，并且由于导致谷氨酸盐脱氨基的更长途径，在能量上不如根据本发明的方法有利。使用酪氨酸作为苯酚生物合成的中间产物也是缺点，因为酪氨酸是芳香族氨基酸途径中的基因活性的强抑制剂。所述抑制发生在基因组水平(基因阻遏)、转录组水平和代谢组水平(反馈抑制)。相比之下，如下所述，根据本发明的方法将分支酸直接转化为苯酚，其复杂性较低，能量上更有效的且具有获得苯酚的高生产率的更高潜力。
除经过酪氨酸在细菌中生产苯酚的上述途径之外，还已知苯酚可以通过莽草酸的化学转化进行生产，其中所述莽草酸通过发酵产生(Gibson JM等人，Benzene-Free Synthesis of Phenol，Angew. Chem. 2001 113(10):1999-2002)。
还报道了经过酪氨酸的4-羟基苯甲酸的生物合成。Meinen等人使用经过酪氨酸的生物合成途径(Meijnen JP等人， )。
WO2012063862描述了通过发酵生产苯酚的方法。通过将分支酸-丙酮酸裂解酶和4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因引入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株中，使用经过分支酸和4-羟基苯甲酸的途径。然而，苯酚对于谷氨酸棒杆菌是有毒的，并且该菌株在低苯酚浓度下停止生长。生长期和生产期因此被分离在两步过程中，其中第二步在与第一步不同的培养基中执行，并且氧化还原电位降低至-450 mV。根据WO2012063862中报道的发明，仅使用一个发酵容器的组合生长和生产是不可能的。出于相同原因，不能伴随原位产物取出运行连续发酵，其中生物质通过生长使其自身再生。
　定义
在本发明的含义内的术语“宿主”可以包含能够天然地、仅在转化后，或除天然存在的分支酸之外在转化后生产分支酸的任何宿主。根据本发明的“宿主”可以选自细菌、酵母和真菌。
在本发明的含义内的术语“遗传修饰”可以包含缺失以及转化。例如，遗传修饰可以是引起宿主过度生产分支酸的缺失或转化。此类分支酸在宿主中的过度生产可以通过将一种或多种遗传修饰引入宿主来实现。相应地，宿主可以包含一种或多种遗传修饰以过度生产分支酸。这些遗传修饰可以具有下述效应，即宿主以升高的、超过天然地在宿主中存在的正常内源生理水平的水平生产分支酸。
在本发明的含义内的术语“转化”包含质粒转化以及染色体转化。在质粒转化中，所转化的DNA是未切割和环状的，并且因此在宿主中保持在染色体外。在染色体转化中，所转化的DNA是切割的和因此是线性的，并且因此可以整合到待转化宿主的染色体基因组中。基本上，对于染色体转化，宿主可以用线性DNA的短链片段进行转化，所述线性DNA的短链片段可以整合到待转化宿主的染色体基因组中。
在本发明的含义内的术语“原位产物回收”指在发酵液继续用于发酵的同时，通过使用合适技术直接从发酵液中取出苯酚。这可以包括在发酵液部分再循环回发酵罐之前，使发酵液循环通过外部仪器，在所述外部仪器中将苯酚从发酵液中取出。在这种情况下，细胞可以保留或不保留在发酵罐中。另一个选择是在发酵液保留在发酵罐中的同时，从发酵液中取出苯酚。
描述
本发明涉及用于从作为原材料的生物质，全细胞生物合成苯酚的方法。通常，含有显著比例的可发酵糖的资源可以用于根据本发明的方法中。这些糖可以包括多糖例如二糖，例如蔗糖，或三糖例如蔗果三糖，以及C-6单糖例如葡萄糖、果糖或甘露糖，以及C-5单糖例如木糖和阿拉伯糖。能够将糖转化为苯酚的微生物菌株，优选细菌菌株或酵母菌株，将允许由广泛范围的可再生资源生产苯酚，所述可再生资源包括甜菜和甘蔗，含淀粉植物例如玉米、小麦和黑麦，以及木质纤维素例如稻草、木材或甘蔗渣。
考虑到本领域已知的上述方法通常在能量方面效率较低并且就苯酚合成而言也更复杂的主要缺点，本领域存在用于生产苯酚的改良方法的需要。因此本发明的问题是提供用于由可再生资源生产苯酚的方法，其避免本领域已知的方法在能量方面效率较低并且就苯酚合成而言更复杂的缺点。
本发明已通过提供生成如本文所述用于生产苯酚的重组宿主菌株的方法来解决所述问题。本发明已通过提供如本文所述能够生产苯酚的重组宿主菌株来进一步解决所述问题。本发明已通过提供在重组宿主菌株中生产苯酚的方法来进一步解决所述问题。本发明已通过提供方法和相关重组菌株来进一步解决所述问题，所述重组菌株包含氧耐受性羟基苯甲酸脱羧酶，其对氧不敏感且在正常氧化还原条件下是完全活性的，因此允许在好氧条件下的苯酚生产。本发明已通过提供对苯酚抗性的宿主菌株来进一步解决所述问题，因此允许将生长和苯酚生产在足够高的苯酚浓度下组合，其足以允许通过连续发酵进行生产以及原位产物回收的选择。
特别地，本发明已通过提供生成用于生产苯酚的重组宿主菌株的方法来解决所述问题，所述方法包括下述步骤：
a)　提供包含分支酸(CHO)的宿主，
b)　用包含编码分支酸裂解酶的ubiC (SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列转化所述宿主，和
c)　用编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列转化所述第一转化体，从而生成能够在好氧条件下生产苯酚的重组宿主，
其中步骤b)和步骤c)同时或顺次进行。
该方法的步骤a)可以利用宿主中存在的分支酸(CHO)。分支酸是所实现途径中的关键中间产物(参见图 1和图 2)。它是所有三种芳香族氨基酸的共享前体，并且因此天然存在于能够产生芳香族氨基酸的所有生物中，所述生物包括所有常见微生物。因此，可以由所有可发酵糖产生细胞内分支酸。
该方法的步骤b)提供了具有第一核酸序列(优选为基因)的宿主，所述第一核酸序列的产物将分支酸(CHO)转化为4-羟基苯甲酸(4-HB)。ubiC (SEQ ID NO: 1)编码分支酸裂解酶，其将分支酸转化为4-羟基苯甲酸(4-HB)，从而生成过表达分支酸裂解酶的重组宿主(参见图 2和图 3)。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述第一核酸序列是SEQ ID NO: 1。
通过将编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的核酸引入宿主内，根据本发明的方法的步骤c)向宿主另外提供了第二核酸序列，优选基因簇，所述第二核酸序列的产物将4-羟基苯甲酸(4-HB)转化为苯酚(参见例如图 2和图 3)。步骤b)中的所述核酸可以包括表达4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因簇hbdBCD (SEQ ID NO 2)。步骤c)的基因簇hbdBCD可以衍生自大肠杆菌(E. coli)菌株大肠杆菌O111:B4。
因此，在根据本发明的方法的进一步实施方案中，所述第二核酸序列包含基因簇hbdBCD，如SEQ ID NO 2中定义的。由SEQ ID NO: 2编码的酶是氧耐受性的4-羟基苯甲酸脱羧酶。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述第二核酸序列是SEQ ID NO: 2。
因此，本发明已通过提供生成用于生产苯酚的重组宿主菌株的方法来解决上述问题，所述方法包括下述步骤：
a)提供包含分支酸(CHO)的宿主，
b)用包含编码分支酸裂解酶的ubiC (SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列转化所述宿主，所述分支酸裂解酶将分支酸(CHO)转化为4-羟基苯甲酸(4-HB)，和
c)用编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列转化所述第一转化体，所述4-羟基苯甲酸脱羧酶将4-羟基苯甲酸(4-HB)转化为苯酚，从而生成能够在好氧条件下生产苯酚的重组宿主，
其中步骤b)和步骤c)同时或顺次进行。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一核酸序列是SEQ ID NO: 1。
在根据本发明的方法的进一步实施方案中，所述第二核酸序列包含基因簇hbdBCD，如SEQ ID NO 2中定义的。由SEQ ID NO: 2编码的酶是氧耐受性的4-羟基苯甲酸脱羧酶。即，在本发明的一个优选实施方案中，所述第二核酸序列是SEQ ID NO: 2。
因此，根据本发明在重组宿主中生产苯酚的最低限度需求是宿主中的分支酸以及包含ubiC (SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列，和第二核酸序列的存在，所述第二核酸序列编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶，其优选是hbdBCD，如SEQ ID NO: 2中定义的。宿主中存在的分支酸可以是由宿主天然产生的内源分支酸，或者，如果所述宿主包含一种或多种遗传修饰以过度生产分支酸，它可以是由宿主过度生产的分支酸。
在步骤b)和c)中转化到宿主内的第一和第二核酸序列可以在相同质粒，不同质粒或染色体上(染色体整合，例如实施例 5)。如果转化到宿主内的第一和第二核酸序列在相同质粒上，则该方法的步骤b)和c)可以同时进行(例如参见实施例 1)。如果转化到宿主内的第一和第二核酸序列在不同质粒上，则该方法的步骤b)和c)可以顺次进行。例如，基因ubiC (SEQ ID NO: 1)可以在第一质粒上转化到宿主内，并且基因簇hbdBCD (SEQ ID NO: 2)可以在第二质粒上转化到宿主内(参见例如实施例 3)。在一个实施方案中，用存在于相同质粒上的ubiC和hbdBCD转化宿主菌株(例如参见实施例 1，pJF119ubiChbdBCD)。在另一个实施方案中，用在第一质粒pJF119上的ubiC (SEQ ID NO: 1)和在第二质粒pACYC上的hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化宿主菌株(例如参见实施例 3)。
本发明的方法超过上文描述的现有技术方法的技术优点在于在大规模生产设施中的苯酚生产的经济可行性得到改善。本发明允许使用在好氧条件下的连续发酵伴随原位产物去除，在单个容器中糖至苯酚的一步转化。这显著改善糖产率和时空产率。与补料分批发酵相比较，连续发酵具有好得多的总体糖产率，因为需要更少的糖以生成生物质，在补料分批发酵的情况下，需要对于每一个新批次生成生物质。总体时空产率是改善的，因为在生产期之间没有如补料分批发酵的情况下的时间损失(例如用于收获产物、清洁且灭菌发酵罐、生成生物质)。此外，一步转化允许仅使用一个发酵容器的生产。这降低过程的复杂性和生产设施的资本支出。
与由Wierckx等人报道的经过酪氨酸的合成途径相比较，所实现的合成途径复杂性较低，更能量有效的且避免酪氨酸的大细胞内浓度，这将抑制对苯酚的生物合成途径。因此，根据本发明的方法有效得多，因为与本领域已知的方法相比较，它能够实现更佳的糖产率(由于能量效率)和更佳的时空产率(由于更短的途径和避免酪氨酸作为中间产物)。
在根据本发明的方法的进一步实施方案中，步骤a)的宿主可以过度生产分支酸(CHO)。此类分支酸在宿主中的过度生产可以通过将一种或多种遗传修饰引入宿主来实现。相应地，在本发明的方法的进一步实施方案中，宿主可以包含一种或多种遗传修饰以过度生产分支酸。这些遗传修饰具有下述效应，即宿主以升高的、超过正常内源生理水平的水平生产分支酸。因为提供更多底物用于步骤b)中(通过ubiC基因产物，分支酸CHO至4-羟基苯甲酸4-HB)和步骤c)中(通过hbdBCD基因产物，4-HB至苯酚)的后续反应，所以产生更多最终产物，即苯酚。
此类一种或多种遗传修饰可以包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失，所述tyrR、pheA和tyrA可以引入宿主内。
由基因tyrR编码的TyrR蛋白质通过与被称为TyrR盒的识别序列结合，阻遏芳香族氨基酸途径的共同部分中的几种基因的表达。TyrR蛋白质通过芳香族氨基酸的存在进行调节。特别地，酪氨酸和ATP的存在允许它自结合成六聚体，其还可以与弱TyrR盒结合，所述弱TyrR盒中的一些与芳香族氨基酸途径中的基因的启动子重叠。在一些情况下，阻遏机制涉及从启动子中排除RNA聚合酶，而在其他情况下，它干扰结合的RNA聚合酶形成开放式复合物或离开启动子的能力。通过缺失tyrR，可以完全避免由TyrR引起的调节效应，如图 2中所示。tyrR的缺失可以通过使用λred重组酶来实现，根据由Datsenko和Wanner的方案，如实施例1中所述。此处，tyrR可以通过使用SEQ ID NO:3中显示的tyrR::FRT-kan盒进行缺失，且如实施例 1中所述。
基因pheA编码双功能酶，其催化分支酸至预苯酸的转化(分支酸变位酶)以及预苯酸至酮-苯丙酮酸的转化。基因tyrA也编码双功能酶，其也催化分支酸至预苯酸的转化(分支酸变位酶)以及预苯酸至4-羟基苯基丙酮酸的转化(预苯酸脱氢酶)。通过缺失pheA和tyrA基因两者，从分支酸到苯丙氨酸和酪氨酸的途径可以完全失活，因为所有分支酸活性以及预苯酸脱水酶和预苯酸脱氢酶活性都被去除，如图 2中所示。pheA和tyrA的缺失可以通过使用SEQ ID NO:4中显示的pheAtyrA::FRT-CAT盒来实现，且如实施例 1中所述。
在本发明的进一步实施方案中，tyrR、pheA和tyrA中的一种、两种或所有三种可以在使用的宿主菌株中缺失。在本发明的一个优选实施方案中，所有三种基因tyrR、pheA和tyrA在宿主中缺失(ΔtyrRpheAtyrA)，从而使得分支酸过度生产。携带所有三个缺失的此类重组菌株的一个例子是表 1中列出的大肠杆菌BW25113 ΔtyrRpheAtyrA。大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA的生成描述在实施例 1中。
在该方法的进一步的实施方案中，过度生产分支酸的所述一种或多种遗传修饰可以包含用aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。宿主可以用aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的每一种单独地转化。宿主还可以用aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)的每种组合进行转化，从而实现分支酸的最佳过度生产。
由aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)的基因产物催化的反应描绘在图 2中。它们均导致分支酸在宿主中的过度生产。
　 aroG (SEQ ID NO: 9)的基因产物催化从E4P到DAHP的反应，如图 2中所示。
　 aroGfbr (SEQ ID NO: 10)编码相同酶，除了G至A突变，这使得酶对反馈抑制具有抗性，如由Kikuchi等人( )报道且在图6中显示的。
　 aroB (SEQ ID NO: 11)的基因产物催化从DAHP到3DQ的反应，如图 2中所示。
　 aroL (SEQ ID NO: 12)的基因产物催化从SHI到SHI3P的反应，如图 2中所示。
这些基因中的一种或多种的转化导致宿主中分支酸的过度生产。因此，在本发明的方法的一个实施方案中，宿主可以包含一种或多种遗传修饰，以过度生产分支酸，其中所述一种或多种遗传修饰可以是用aroG (SEQ ID NO: 9)，aroGfbr (SEQ ID NO: 10)，aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
用aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种转化宿主可以作为单个转化步骤完成，其中转化到宿主内的基因在相同质粒上。然而，这些转化还可以以这样的途径执行，从而使得引入宿主内的基因在分开质粒上或直接整合到染色体上。
在该方法的进一步的实施方案中，可以存在于宿主中的所述一种或多种遗传修饰可以包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失，并且可以进一步包含用aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
在该方法的特别优选的实施方案中，对步骤a) 的宿主实施所有三种基因tyrR、pheA和tyrA的缺失，从而生成宿主ΔtyrRpheAtyrA，优选在表 1中列出且在实施例 1中描述的大肠杆菌BW25113 Δ tyrRpheAtyrA，从而使得分支酸过度生产。宿主ΔtyrRpheAtyrA随后可以同时或顺次地在步骤b) 中用ubiC (SEQ ID NO: 1)和在步骤c)中用hbdBCD (SEQ ID NO: 2)进行转化，从而生成用ubiC和hbdBCD转化的宿主ΔtyrRpheAtyrA。此类菌株的一个例子是用ubiC和hbdBCD转化的大肠杆菌BW25113 Δ tyrRpheAtyrA，如表 1中列出且如实施例 1中进一步描述的(大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA)。
在该方法的进一步特别优选的实施方案中，可以对步骤a)的宿主实施所有三种基因tyrR、pheA和tyrA的缺失，从而生成宿主ΔtyrRpheAtyrA，从而使得分支酸过度生产，其随后用aroL (SEQ ID NO:12)转化，并且在根据本发明的方法的步骤b)中用ubiC (SEQ ID NO: 1)以及在步骤c)中用hbdBCD (SEQ ID NO: 2)进行转化，从而生成用aroL、ubiC和hbdBCD转化的宿主ΔtyrRpheAtyrA。此类菌株的一个例子是用aroL、ubiC和hbdBCD转化的大肠杆菌BW25113 Δ tyrRpheAtyrA，如表 1中列出且如实施例 2中进一步描述的。
在特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)、aroL (SEQ ID NO: 12)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案可以生成用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)、aroL (SEQ ID NO: 12)和 ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
在另一个特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案可以生成用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、以及ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
在另一个特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroL (SEQ ID NO: 12)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案可以生成用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroL (SEQ ID NO: 12)和 ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
可以用于根据本发明的方法的宿主可以选自细菌、酵母和真菌。在优选实施方案中，所述细菌是大肠杆菌菌株。大肠杆菌菌株可以选自大肠杆菌BW25113、大肠杆菌DH10b和大肠杆菌LJ110。在根据本发明的方法的特别优选的实施方案中，使用大肠杆菌BW25113 Δ tyrRpheAtyrA，如表 1中列出且如实施例 1中描述的。
在根据本发明的方法的进一步实施方案中，宿主可以是苯酚抗性宿主，优选苯酚抗性细菌，更优选苯酚抗性恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株，更优选恶臭假单胞菌S12且最优选恶臭假单胞菌S12 Δ pheApobA。
在根据本发明的方法中执行的转化步骤b)和c)可以包括质粒转化或染色体转化。在质粒转化中，所转化的DNA是未切割和环状的，并且因此在宿主中保持在染色体外。在染色体转化中，所转化的DNA是切割的和因此是线性的，并且因此可以整合到待转化宿主的染色体基因组中。
本发明进一步提供了可通过根据本发明的方法获得的重组宿主菌株，如上所述。
在一个实施方案中，重组宿主菌株包含分支酸且进一步包括包含ubiC (SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列，和编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列，其中所述重组菌株能够在好氧条件下生产苯酚。
在根据本发明的宿主菌株的进一步实施方案中，所述第二核酸序列包含hbdBCD，如SEQ ID NO: 2中定义的。
在进一步的实施方案中，重组宿主菌株可以过度生产分支酸。此类分支酸在宿主中的过度生产可以通过将一种或多种遗传修饰引入宿主来实现。相应地，在进一步实施方案中，宿主菌株可以包含一种或多种遗传修饰以过度生产分支酸。这些遗传修饰具有以下效应，即宿主以比正常更高的速率生产分支酸。因为底物以更高速率提供用于步骤b)中(通过ubiC基因产物，分支酸CHO至4-羟基苯甲酸4HB)和步骤c)中(通过hbdBCD基因产物，4-羟基苯甲酸4-HB至苯酚)的后续反应，所以以更高速率产生最终产物，即苯酚。
在一个实施方案中，重组宿主菌株包含一种或多种遗传修饰，其中所述遗传修饰包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失。这些基因及其基因产物以及其缺失已在上文得到描述。
在本发明的进一步实施方案中，tyrR、pheA和tyrA中的一种、两种或所有三种可以在本发明的重组宿主菌株中缺失。在本发明的优选实施方案中，所有三种基因tyrR、pheA和tyrA在宿主中缺失，从而使得分支酸过度生产(Δ tyrRpheAtyrA)。携带所有三个缺失的此类重组菌株的一个例子是大肠杆菌BW25113 ΔtyrRpheAtyrA，其在表 1中列出且如实施例 1中描述。
在进一步的实施方案中，重组宿主菌株包含一种或多种遗传修饰，其中所述遗传修饰包含用核酸序列的转化，所述核酸序列包含aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种。这些基因及其基因产物已在上文得到描述。
在进一步的实施方案中，重组宿主菌株包含一种或多种遗传修饰，其中所述遗传修饰包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失；并且进一步包含用aroG(SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)和aroL (SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。这些基因及其基因产物已在上文得到描述。
在本发明的重组宿主菌株的特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)、aroL (SEQ ID NO: 12)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的重组宿主菌株的一个特别优选的实施方案是用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)、aroL (SEQ ID NO: 12)和 ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
在本发明的重组宿主菌株的另一个特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroL (SEQ ID NO: 12)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的重组宿主菌株的一个特别优选的实施方案是用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroL (SEQ ID NO: 12)和 ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
在本发明的重组宿主菌株的另一个特别优选的实施方案中，过度生产分支酸的遗传修饰包含用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)的转化。因此，根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案可以生成用aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、以及ubiC (SEQ ID NO: 1)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)转化的重组菌株ΔtyrR ΔpheAtyrA。
在进一步的实施方案中，重组宿主菌株可以选自细菌、酵母和真菌。在优选实施方案中，所述细菌是大肠杆菌菌株。在进一步的实施方案中，所述大肠杆菌菌株可以选自大肠杆菌BW25113、大肠杆菌DH10b和大肠杆菌LJ110。在根据本发明的重组宿主菌株的特别优选的实施方案中，使用大肠杆菌BW25113 Δ tyrRpheAtyrA，如表 1中列出且如实施例 1中所述。
在根据本发明的重组菌株的进一步实施方案中，所述宿主可以是苯酚抗性宿主，优选苯酚抗性细菌，更优选苯酚抗性恶臭假单胞菌菌株，更优选恶臭假单胞菌S12且最优选恶臭假单胞菌S12 Δ pheApobA。
如由Δ pheA指示的，恶臭假单胞菌中的pheA缺失使分支酸至预苯酸的转化(分支酸变位酶反应，CHO至PREPH，参见图 2)失活，从而使至苯丙氨酸和酪氨酸的途径失活。与大肠杆菌不同，恶臭假单胞菌不具有用于分支酸变位酶反应的两种同工酶，因此，缺失恶臭假单胞菌中的pheA基因足以使酪氨酸和苯丙氨酸途径失活。基因pobA催化4-羟基苯甲酸至原儿茶酸(protocatechuate)的转化(4-羟基苯甲酸羟化酶)，其使得恶臭假单胞菌能够降解4-羟基苯甲酸。如由Δ pheApobA指示的，因为竞争途径被失活，缺失pheA和pobA因此增加4-羟基苯甲酸对于苯酚生产的可用性。大肠杆菌不具有对羟基苯甲酸羟化酶，因此如果大肠杆菌用作宿主，则不作出相应缺失。
本发明进一步提供了在重组宿主中生产苯酚的方法，其包括下述步骤：
a)提供如上所述的根据本发明的重组宿主菌株，和
b)在发酵条件下温育所述重组宿主菌株，从而生产苯酚。
在根据本发明方法的方法的进一步实施方案中，可以诱导苯酚生产。此类苯酚生产的诱导可以是在不存在或存在氧(O2)的情况下。苯酚生产可以通过特异性化学化合物的存在或不存在或者通过物理条件的变化进行诱导。例如，诱导物的存在可以活化对苯酚的生物合成途径中的某些基因的转录(例如IPTG作用于lac操纵子，以表达位于质粒上的基因)，或例如酪氨酸的不存在可以活化参与衍生出苯酚的芳香族氨基酸途径的基因的表达。物理条件例如温度、pH或O2浓度的变化也可以活化参与苯酚合成的基因的表达。
在进一步的实施方案中，在重组菌株中生产苯酚的方法可以进一步包括步骤c)从重组宿主菌株中收获所生产的苯酚。
在根据本发明的重组菌株中生产苯酚的方法的步骤b)可以作为分批发酵、补料分批发酵或连续发酵执行。
在本发明的背景下，分批发酵指发酵方法，其中在发酵开始时提供完全发酵培养基。在发酵结束时收获产物(即苯酚)。
在本发明的背景下，补料分批发酵指发酵方法，其中发酵培养基的一部分在发酵开始时提供，并且一部分在发酵期间进料给发酵罐。在发酵结束时收获产物(即苯酚)。
在本发明的背景下，连续发酵指发酵方法，其中在发酵期间连续添加底物且取出产物(即苯酚)。
在重组菌株中生产苯酚的方法的进一步实施方案中，步骤b)的发酵条件可以包含好氧条件。这意指摇瓶以及发酵罐中的反应两者均可以在好氧条件下执行。此类好氧条件可以例如通过用空气给摇瓶和/或发酵罐充气来实现。
在重组菌株中生产苯酚的方法的进一步实施方案中，发酵条件可以包含粗甘蔗汁的存在，其中所述粗甘蔗汁可以优选包含高浓度的1-蔗果三糖。该实施方案的一个例子显示于实施例 6中。此类甘蔗汁可以用作此类发酵中的底物，并且可以包含例如葡萄糖14 g/l、果糖24 g/l、蔗糖130 g/l、蔗果三糖119 g/l和蔗果四糖5 g/l，如通过HPLC测量的。
对于本领域技术人员显而易见的是可以对本发明的方法和重组宿主菌株作出多种改变。因此，预期本发明涵盖此类改变和变化，只要它们在所附权利要求及其等同方案的范围内。
　图、表和序列
图 1显示了从葡萄糖到苯酚的生物合成途径。
E4P = 赤藓糖-4-磷酸
DAHP = 3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸
3DQ = 3-脱氢奎尼酸
3DS = 3-脱氢莽草酸
SHI = 莽草酸
SHI3P =莽草酸-3-磷酸
ESHI3P = 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸
CHO = 分支酸
4HB = 4-羟基苯甲酸
PREPH = 预苯酸。
图 2显示了通过本发明的方法在宿主中的细胞反应网络中的代谢工程，以制备过度生产苯酚的根据本发明的重组宿主菌株。
图 3显示了在苯酚合成途径中的最后两个反应，其由ubiC (SEQ ID NO: 1)基因产物(CHO至4-HB)和hbdBCD (SEQ ID NO: 2)基因产物羟基苯甲酸脱羧酶(4-HB至苯酚)催化。
图 4显示了如实施例 1中所述，发酵液的HPLC分析。
图 5显示了如实施例 2中所述，发酵液的HPLC分析。
图 6显示了基因aroG (SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB (SEQ ID NO: 11)、aroL (SEQ ID NO: 12)和ubiC (SEQ ID NO: 1)，其全部合成为具有对于BglII和BamHI的限制位点(有下划线的)，以允许整合到质粒内。ATG起始密码子和TAA终止密码子是粗体。aroGfbr (SEQ ID NO: 10)中的G至A反馈抗性突变是粗体和有下划线的。
图 7显示了基因簇hbdBCD (SEQ ID NO: 2)，其从大肠杆菌O111:B4中分离，且通过适当限制性酶整合到已经携带ubiC的相同质粒内。如所示，基因簇具有如下组成：hbdB: 0.6 kbp、hbdC: 1.4 kbp、hbdD: 0.2 kbp。
图 8显示了如实施例 3中所述，发酵液的HPLC分析。
图 9显示了如实施例 5中所述，发酵液的HPLC分析。
图 10显示了如实施例 6中所述，摇瓶发酵液的HPLC分析。
表 1显示了根据本发明使用的大肠杆菌菌株、质粒和基因列表。
表 2显示了实施例 1和实施例 2的结果。
SEQ ID NO: 1显示了ubiC的序列。衍生出该序列的天然基因ubiC见于NCBI数据库中，登记号CP000948，4350225至4350722位。ubiC编码分支酸裂解酶，其催化从分支酸(CHO)到4-羟基苯甲酸(4-HB)的反应，如图 2和图 3中所示。
SEQ ID NO: 2显示了衍生自大肠杆菌O111:B4的基因簇hbdBCD的序列。如图 7中所示，基因簇具有组成hbdB: 0.6 kbp、hbdC: 1.4 kbp、hbdD: 0.2 kbp。所述序列可见于NCBI数据库中，登记号NC_013364，3434167至3431906位。该基因簇编码催化从4-羟基苯甲酸(4-HB)到苯酚的反应的4-羟基苯甲酸脱羧酶，如图 2和图 3中所示。
SEQ ID NO: 3显示了用于缺失tyrR的tyrR::FRT-kan盒的序列。
SEQ ID NO: 4显示了用于缺失pheAtyrA的pheAtyrA::FRT-CAT盒的序列。
SEQ ID NO: 5显示了用于缺失tyrR的敲除引物tyrR，5'引物的序列。
SEQ ID NO: 6显示了用于缺失tyrR的敲除引物tyrR，3'引物的序列。
SEQ ID NO: 7显示了用于缺失pheAtyrA的敲除引物pheAtyrA，5'引物的序列。
SEQ ID NO: 8显示了用于缺失pheAtyrA的敲除引物pheAtyrA，3'引物的序列。
SEQ ID NO: 9显示了aroG的序列。衍生出该序列的天然基因aroG见于NCBI数据库中，登记号CP000948，837448至838500位。aroG基因产物催化从E4P到DAHP的反应，如图 2中所示。
SEQ ID NO: 10显示了aroGfbr 的序列。按照SEQ ID NO: 7的序列不同于SEQ ID NO: 9的事实在于在位置436处的G变为A，从而生成aroG的fbr (反馈抗性)突变体。
SEQ ID NO: 11显示了aroB的序列。衍生出该序列的天然基因aroB见于NCBI数据库中，登记号CP000948，3613165至3614253位。aroB基因产物催化从DAHP到3DQ的反应，如图 2中所示。
SEQ ID NO: 12显示了aroL的序列。衍生出该序列的天然基因aroL见于NCBI数据库中，登记号CP000948，344960至345484位。aroL基因产物催化从SHI到SHI3P的反应，如图 2中所示。
SEQ ID NO: 13显示了插入盒的序列，所述插入盒具有在aroBaroGfbr 序列上游的Ptac启动子和核糖体结合位点，以及在aroBaroGfbr 序列下游的FRT侧接的氯霉素抗性以及转录终止子，如实施例 5中所述。
SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15显示了用于扩增如SEQ ID NO: 13中所示的插入盒的扩增引物对的序列。
SEQ ID NO: 16显示了所述盒整合在fucP和fucI基因之间的fuc基因座中之后，在染色体上的克隆位点的序列，如实施例 5中所述。该序列包括直接在盒上游和下游的染色体DNA序列。该盒见于SEQ ID NO: 16的位置5148 - 9112之间。
SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18显示了用于测试盒的成功染色体整合的引物对的序列，如实施例 5中所述。具有fuc基因座中的缺陷的突变体不能以L-岩藻糖作为碳源生长，并且在含有1%岩藻糖的MacConkey培养基上形成苍白色菌落(与形成红色菌落的野生型细胞相反，如由Albermann等人2010描述的)。在含有氯霉素的琼脂平板上选择后，阳性菌落在具有1%岩藻糖的MacConkey培养基上进一步测试。岩藻糖阴性菌落通过PCR进一步测试，使用引物SEQ ID NO: 17用于5'测试和SEQ ID NO 18用于3'测试。
实施例
实施例 1 ：制备重组菌株大肠杆菌 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119ubiChbdBCD 且将其用于通过发酵的苯酚生产
鉴定了经由分支酸(CHO)由糖合成苯酚的新型生物合成途径(参见图 1和图 2)。该途径在大肠杆菌菌株中实现，并且执行制备苯酚生产菌株所需的进一步遗传修饰(参见图 2)。以这种方式，苯酚的全细胞生物合成变成可能。所制备的重组菌株在摇瓶实验中产生0.5 mM - 1.5 mM之间苯酚，并且在1升生物反应器发酵中产生高达5 mM苯酚。所使用的大肠杆菌菌株、质粒和基因列表在表 1中提供。
除宿主菌株大肠杆菌BW25113的内源分支酸之外，执行下述遗传修饰以过度生产分支酸：缺失基因pheA和tyrA，以便去除消耗分支酸的分支酸变位酶反应，从而使得分支酸过度生产。这些缺失使得菌株对于苯丙氨酸和酪氨酸是营养缺陷的。另外，使调节基因tyrR缺失，该基因编码对于Tyr调节子表达的阻遏物蛋白。tyrR的辅阻遏物是酪氨酸或苯丙氨酸加上色氨酸。
a. 制备宿主菌株大肠杆菌 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA
根据Datsenko和Wanner 的方法，通过使用噬菌体λred重组酶的重组，执行基因pheA、tyrA和tyrR基因的敲除缺失。pheA和tyrA正好彼此紧靠地位于染色体，并且在一步中失活。tyrR位于染色体上的不同位置，并且通过相同方法在第二步中失活。
用于破坏的插入盒含有侧面为FRT (翻转酶识别靶)位点的抗生素抗性基因。与待失活基因邻近的区域同源的序列位于盒的任一末端处，如由Datsenko和Wanner描述的。插入盒通过PCR (聚合酶链反应)由具有抗生素抗性基因和FRT位点的模板质粒扩增。PCR引物含有同源区和引发位点。用于pheAtyrA破坏的插入盒pheAtyrA::FRT-CAT具有氯霉素抗性，并且由SEQ ID NO: 4给出。用于扩增pheAtyrA敲除盒(pheAtyrA::FRT-CAT盒，SEQ ID NO: 4)的引物由SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8给出。质粒pCO1-FRT-CAT用作pheAtyrA::FRT-CAT盒的模板质粒。用于tyrR破坏的插入盒tyrR::FRT-kan具有卡那霉素抗性，并且由SEQ ID NO: 3给出。用于扩增tyrR敲除盒(tyrR::FRT-kan，SEQ ID NO: 3)的引物由SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6给出。质粒pCO1-FRT-kan用作tyrR::FRT-kan盒的模板质粒。
通过λred重组酶将tyrR::FRT-kan盒整合到大肠杆菌BW25113的染色体内，因此获得大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR。在含有卡那霉素的琼脂平板上选择破坏已成功的细胞。此外，进行对照PCR以证实成功破坏。以相同方式，通过λred重组酶将盒pheAtyrA::FRT-CAT整合到大肠杆菌BW25113 ΔtyrR的染色体内，因此获得大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA (参见表 1)。在含有氯霉素的琼脂平板上选择破坏已成功的细胞。再次使用对照PCR以证实pheAtyrA的成功破坏。另外，检查所制备突变体的苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型。突变体仅能够在苯丙氨酸和酪氨酸的存在下生长。在两种染色体整合中，辅助质粒pKD46用于表达λ red重组酶。通过使用辅助质粒pCP20表达翻转酶，从大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA中去除抗生素抗性。
b. 制备大肠杆菌菌株 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119ubiChbdBCD
选择质粒pJF119 作为用于ubiC和hbdBCD过表达的载体。
基因ubiC设计为具有用于NdeI和BglII的5'限制位点以及用于BamHI的3'限制位点，并且通过公司Geneart (Life Technologies的一部分)合成。递送质粒pMA在大肠杆菌DH10b中进行扩增，并且通过NdeI和BamHI限制性酶切下所述基因。制备型琼脂糖凝胶电泳用于扩增基因。通过首先用NdeI和随后为BamHI的顺次消化打开在pJF119上的克隆位点。通过T4连接酶将ubiC基因和载体连接(参见图 6和SEQ ID NO: 1)。通过经由NdeI/BamHI消化来消化pJF119ubiC，且通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段，检查在pJF119质粒上的ubiC基因的成功整合。通过在大肠杆菌DH10b中表达pJF119ubiC和细胞提取物的后续SDS-PAGE分析，检查蛋白质表达概况。通过使大肠杆菌DH10b pJF119ubiC的原始酶提取物与分支酸一起温育，且通过HPLC测量所得到的4-羟基苯甲酸生产，证实基因产物UbiC的活性。最后，通过公司Qiagen测序质粒pJF119ubiC，并且所检测到的序列与原始ubiC基因序列比对且控制同源性。所有分析均证实ubiC成功整合到pJF119内。
使用具有用于HindIII/EcoRI的限制位点的引物，通过PCR从大肠杆菌菌株O111:B4 (ATCC 33780)的染色体扩增基因簇hbdBCD。随后，通过用HindIII/EcoRI消化pUC19，并且使用T4连接酶将引物产物与开放的pUC19连接，将引物产物并入到质粒pUC19上(参见图 7和SEQ ID NO: 2)。
随后用DrdI消化质粒pUC19hbdBCD。所得到的大约3 kb的DNA片段含有hbdBCD基因簇。该片段通过制备型琼脂糖凝胶电泳进行纯化。通过用DrdI消化该载体且使用T4连接酶将片段与载体连接，将片段掺入pJF119ubiC内。通过用bglII和RsrII消化pJF119ubiChbdBCD，且使用琼脂糖凝胶电泳分离所得到的片段，检查hbdBCD的正确克隆。所观察到的条带匹配预期的DNA片段。通过使大肠杆菌DH10b pJF119hbdBCD的原始酶提取物与4-羟基苯甲酸一起温育，且通过HPLC测量所得到的苯酚生产，证实基因产物HbdBCD的活性。
pJF119质粒含有用于选择的氨苄青霉素抗性。通过用卡那霉素抗性替换氨苄青霉素抗性制备质粒pJF119ubiChbdBCD的第二变体。这通过用BspHI消化pJF119hbdBCD以去除氨苄青霉素抗性且随后将线性pJF119hbdBCD片段与卡那霉素抗性的基因连接来完成。
最后，通过电穿孔将pJF119ubiChbdBCD转移到大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA内，以制备大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiChbdBCD (参见表 1)。制备在质粒上具有氨苄青霉素抗性的变体以及在质粒上具有卡那霉素抗性的变体两者。
c. 使用大肠杆菌菌株 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119ubiChbdBCD 由糖生产苯酚
具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiChbdBCD在10 ml摇瓶培养和1L生物反应器/发酵罐中生长，两者均在好氧条件下。此类好氧条件通过用空气给摇瓶和/或生物反应器/发酵罐充气来实现。
用于摇瓶培养的发酵培养基基于由Riesenberg等人公开的大肠杆菌培养基 。它含有下述化合物：13.3 g/L KH2PO4、4 g/L(NH4)2PO4、1.7 g/L柠檬酸盐、2.5 g/l Luria Broth、17.5 g/L葡萄糖、0.024 g/L L-苯丙氨酸、0.016 g/L L-酪氨酸、10 ml/l痕量元素溶液、0.6 g/L MgSO4 * 7 H2O、0.2 mM CaCl2 * 2 H2O、0.1 g/l氨苄青霉素。
生物反应器中使用的发酵培养基含有下述组分：15.5 g/L KH2PO4、4.67 g/L (NH4)2PO4、1.98 g/L柠檬酸盐、17.5 g/L葡萄糖、0.5 g/L硫胺素、0.037 g/L L-苯丙氨酸、0.024 g/L L-酪氨酸、10 ml/l痕量元素溶液、0.6 g/L MgSO4 * 7 H2O、0.2 mM CaCl2 * 2 H2O、0.1 g/l氨苄青霉素。
痕量元素溶液具有下述组成：75 mg/L 柠檬酸Fe(III) * H2O，3.75 mg/L H3BO3、18.75 mg/L Mn(II)Cl2 * 4 H2O、10.5 mg/L EDTA (Titriplex III)、1.88 mg/L CuCl2 * 2 H2O、3.13 mg/L Na2MoO4 * 2 H2O、3.13 mg/L Co(II)Cl2 * 6 H2O、10 mg/L 乙酸锌 * 2 H2O。
在生物反应器中，将溶解氧的浓度控制在pO2 = 5 %，并且通过添加25% NH4溶液，将pH控制在pH = 7.0。这意指使用好氧条件，其中好氧条件例如通过用空气给摇瓶和/或发酵罐/生物反应器充气来实现。
一旦细菌已达到其指数生长期，就通过将IPTG加入培养物来诱导在pJF119上的基因表达。
作为阴性对照，用大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119Δ和大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pUC19hbdBCD执行摇瓶发酵。pJF119Δ表示没有添加任何基因的pJF119质粒。对阴性对照使用相同摇瓶发酵培养基，并且发酵操作是相同的，包括添加IPTG。
用大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiChbdBCD的摇瓶发酵在24小时后获得1.4 mM苯酚。在生物反应器中的发酵在40小时后获得4.9 mM苯酚。在阴性对照的培养物中无法检测到苯酚(参见表 2)。使用30分钟的梯度法和在280 nm处的UV检测，通过HPLC-UV测定浓度。在样品中的苯酚峰具有与苯酚标准溶液相同的保留时间和UV谱(参见图 4)。使用HPLC-MS检测苯酚质量，作为苯酚生产的进一步证实(参见表 2)。
实施例 2 ：制备重组菌株大肠杆菌 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119aroLubiChbdBCD 且将其用于通过发酵的苯酚生产
宿主菌株大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA 如实施例1中所述进行开发。
基因aroL (SEQ ID NO: 12)设计为具有用于NdeI和BglII的5'限制位点以及用于BamHI的3'限制位点，并且通过公司Geneart (Life Technologies的一部分)合成。还参见图 6。它随后通过与用于实施例1中的ubiC克隆所述相同的方法克隆到质粒pJF119中，以制备质粒pJF119aroL (参见表 1)。
将ubiC (SEQ ID NO: 1)克隆到所制备的质粒pJF119aroL上的aroL基因下游。用BamHI和ubiC消化pJF119aroL，并且随后通过用BglII和BamHI消化来切掉递送质粒。使用T4连接酶将ubiC与打开的载体连接，以获得质粒pJF119aroLubiC。通过用NdeI消化来检查aroL和ubiC在pJF119上的正确整合。这获得两个片段；aroL基因(0.5 kb)和具有ubiC的载体(5.8 kb)。ubiC的错误取向获得不同片段。一个片段是整个插入片段aroLubiC(1.0 kb)，并且另一个是不含插入片段的载体(5.3 kb)。插入片段还通过Qiagen进行测序，并且结果与预期序列比对。两个分析均证实aroL和ubiC在pJF119中的正确整合。
通过实施例1中所述的方法，将hbdBCD基因簇(SEQ ID NO: 2)克隆到pJF119aroLubiC质粒上，且转化到大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA内，以制备大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119aroLubiC (参见表 1)。
使用与上文实施例 1中所述相同的方法和相同的发酵培养基，在摇瓶中完成用大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119aroLubiC的发酵。
该摇瓶发酵在24小时后获得0.59 mM苯酚。在阴性对照的培养物中无法检测到苯酚(参见表 2)。使用30分钟的梯度法和在280 nm处的UV检测，通过HPLC-UV测定浓度。在样品中的苯酚峰具有与苯酚标准溶液相同的保留时间和UV谱(参见图 5)。使用HPLC-MS检测苯酚质量，作为苯酚生产的进一步证实(参见表 2)。
实施例 3 ：制备重组菌株大肠杆菌 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119ubiC pACYChbdBCD 且将其用于通过发酵的苯酚生产
大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiC如实施例 1中所述进行制备。
如实施例 1中所述，通过PCR从大肠杆菌菌株O111:B4 (ATCC 33780)的染色体中扩增基因簇hbdBCD，且克隆到质粒pUC19上。用EcoRI和HindIII消化质粒pUC19hbdBCD，以释放hbdBCD基因簇。通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化该DNA片段。用EcoRI和HindIII消化质粒pACYC。通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化线性化载体，并且与hbdBCD片段连接。将所得到的质粒pACYC hbdBCD转化到大肠杆菌DH10b内，并且在含有氯霉素的琼脂平板上选择(pACYC含有氯霉素抗性)。通过用EcoRI和HindIII消化且通过琼脂糖凝胶电泳分析所得到的片段，控制hbdBCD在pACYC上的正确掺入。该分析证实hbdBCD在pACYC上的正确克隆。将质粒pACYChbdBCD转化到大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA内，并且用来自经转化的菌株的质粒重复用EcoRI和HindIII的对照消化。该分析再次证实hbdBCD在pACYC上的正确克隆。将实施例 1中所述的质粒pJF119ubiC转化到大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pACYChbdBCD内，以获得菌株大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiC pACYChbdBCD。
在1升生物反应器中执行用大肠杆菌BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiC pACYChbdBCD的发酵。操作和发酵培养基与实施例1中所述的相同，除了发酵培养基含有0.1 g/l羧苄青霉素和0.05 g/l氯霉素代替氨苄青霉素。
该生物反应器发酵在90小时后获得2.3 mM苯酚。在阴性对照的培养物中无法检测到苯酚(参见表 2)。使用30分钟的梯度法和在280 nm处的UV检测，通过HPLC-UV测定浓度。在样品中的苯酚峰具有与苯酚标准溶液相同的保留时间和UV谱(参见图 8)。使用HPLC-MS检测苯酚质量，作为苯酚生产的进一步证实(参见表 2)。
实施例 4 ：制备重组菌株大肠杆菌 BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA pJF119hbdBCDubiC 且将其用于通过发酵的苯酚生产
在实施例1中，hbdBCD基因簇位于ubiC基因下游，并且具有其自身的lac启动子。ubiC基因具有tac启动子。在该实施例中，hbdBCD基因簇移动至紧邻在ubiC基因前，正好在其tac启动子后的位置，从而使得hbdBCD和ubiC基因两者均通过tac启动子表达。
使用限制性酶NdeI和HindIII，从实施例1中所述的pJF119ubiChbdBCD构建体中切割hbdBCD，并且通过制备型琼脂糖凝胶电泳进行纯化。用相同限制性酶切割pACYC质粒，脱磷酸且与hbdBCD基因连接，获得构建体pACYChbdBCD。
随后用EcoRI消化构建体pACYChbdBCD，以释放具有EcoRI突出端的hbdBCD基因。用EcoRI消化实施例1中所述的构建体pJF119ubiC，脱磷酸且与hbdBCD基因连接，以获得构建体pJF119hbdBCDubiC。通过琼脂糖凝胶电泳证实在用IPTG诱导后的hbdBCD表达。
将质粒构建体pJF119hbdBCDubiC转化到在实施例1中所述的菌株BW25113 Δ tyrR Δ pheAtyrA中。根据实施例1中所述的方法执行具有IPTG诱导的摇瓶发酵，获得0.093 mM苯酚。
实施例 5 ：制备重组菌株大肠杆菌 BW25113 ∆ pheAtyrA ∆ tyrR fuc::Ptac-aroBaroGfbr pJF119ubiChbdBCD 且将其用于苯酚发酵
使用具有在aroBaroGfbr 序列上游的Ptac启动子和核糖体结合位点，和aroBaroGfbr 序列下游的FRT侧接的氯霉素抗性以及转录终止子的插入盒，将基因aroB(序列号)和aroGfbr (序列号)整合到菌株大肠杆菌BW25113 ∆pheAtyrA ∆tyrR的染色体上(染色体整合)。插入盒的序列由SEQ ID NO: 13给出。用于扩增插入盒的引物序列由
给出。如实施例 1中所述，使用噬菌体λ red重组酶方法整合所述盒。该盒整合到染色体上fucP和fucI基因之间的fuc基因座中，且破坏这些基因。在染色体上的克隆位点序列由SEQ ID NO 16给出。该序列包括直接在盒上游和下游的染色体DNA序列。该盒见于位置5148 - 9112之间。
具有fuc基因座中的缺陷的突变体不能以L-岩藻糖作为碳源生长，并且在含有1%岩藻糖的MacConkey培养基上形成苍白色菌落(与形成红色菌落的野生型细胞相反，如由Albermann等人2010描述的)。在含有氯霉素的琼脂平板上选择后，阳性菌落在具有1%岩藻糖的MacConkey培养基上进一步测试。岩藻糖阴性菌落通过PCR进一步测试，使用引物用于5'测试和用于3'测试。如实施例1中所述，通过表达翻转酶去除氯霉素抗性，从而制备大肠杆菌菌株BW25113 ∆pheAtyrA ∆tyrR fuc::Ptac-aroBaroGfbr 。实施例1中所述的质粒构建体pJF119ubiChbdBCD的转化随后获得大肠杆菌BW25113 ∆pheAtyrA ∆tyrR fuc::Ptac-aroBaroGfbr pJF119ubiChbdBC。如实施例 1中所述，执行具有IPTG诱导的摇瓶发酵。在24小时后通过HPLC测量1.2 mM的苯酚浓度。使用实施例1中所述的HPLC方法。在样品中的苯酚峰具有与苯酚标准溶液相同的保留时间和UV谱(参见图9)。
实施例 6 ：通过使用含有高比例蔗果三糖的粗甘蔗汁的发酵的苯酚生产
使用粗甘蔗汁作为唯一能源和碳源，执行在摇瓶和生物反应器中的使用大肠杆菌菌株BW25113 ΔtyrR ΔpheAtyrA pJF119ubiChbdBCD的发酵。从含有高比例的1-蔗果三糖以及蔗糖、果糖、葡萄糖和蔗果四糖的转基因甘蔗植物中提取甘蔗汁。这些糖在甘蔗汁中的浓度已通过HPLC进行测量，并且具有下述浓度：葡萄糖14 g/l、果糖24 g/l、蔗糖130 g/l、蔗果三糖119 g/l、蔗果四糖5 g/l。没有分析甘蔗汁中的进一步化合物。随后，使用这种汁代替葡萄糖用作实施例 1中所述的Riesenberg培养基中的能源和碳源。加入甘蔗汁以获得在最终培养基中15 g/l的总糖浓度。因此，用于摇瓶发酵的培养基给出如下：13.3 g/L KH2PO4、4 g/L(NH4)2PO4、1.7 g/L柠檬酸盐、2.5 g/l Luria Broth、0.051 l/l甘蔗汁、0.024 g/L L-苯丙氨酸、0.016 g/L L-酪氨酸、10 ml/l痕量元素溶液、0.6 g/L MgSO4 * 7 H2O、0.2 mM CaCl2 * 2 H2O、0.1 g/l氨苄青霉素。用于生物反应器中的发酵的培养基给出如下：15.5 g/L KH2PO4、4.67 g/L (NH4)2PO4、1.98 g/L柠檬酸盐、0.051 l/l甘蔗汁、0.5 g/L硫胺素、0.037 g/L L-苯丙氨酸、0.024 g/L L-酪氨酸、10 ml/l痕量元素溶液、0.6 g/L MgSO4 * 7 H2O、0.2 mM CaCl2 * 2 H2O、0.1 g/l氨苄青霉素。痕量元素溶液在实施例 1中定义。
摇瓶中的发酵在所有糖完全耗尽后获得3.1 mM的苯酚浓度，而生物反应器中的发酵在所有糖耗尽后获得0.9 mM的苯酚浓度。这些结果证实能够由含有糖混合物包括高比例的1-蔗果三糖的粗糖汁生产苯酚。苯酚HPLC测量的层析图和摇瓶中的发酵的UV谱在图 10中给出。
“否”表示浓度低于1 mg/l。“是”表示浓度超过1 mg/l。

Claims (21)

1.生成用于生产苯酚的重组宿主菌株的方法，其包括下述步骤：
a) 提供包含分支酸的宿主，
b) 用包含编码分支酸裂解酶的ubiC(SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列转化所述宿主，和
c) 用编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列转化所述宿主，从而生成能够在好氧条件下生产苯酚的重组宿主，
其中步骤b)和步骤c)同时或顺次进行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第二核酸序列包含hbdBCD(SEQ ID NO:2)。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤a)的所述宿主过度生产分支酸，其中所述宿主优选包含一种或多种遗传修饰，以过度生产分支酸。
4.根据权利要求3的方法，其中所述遗传修饰包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失。
5.根据权利要求3的方法，其中所述遗传修饰包含用aroG(SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB(SEQ ID NO: 11)和aroL(SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
6.根据权利要求3的方法，其中所述遗传修饰包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失，且进一步包含用aroG(SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB(SEQ ID NO: 11)和aroL(SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
7.根据权利要求1-6的方法，其中所述宿主选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选是大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株优选选自大肠杆菌BW25113、大肠杆菌DH10b和大肠杆菌LJ110。
8.根据权利要求1-6的方法，其中所述宿主是苯酚抗性宿主，优选苯酚抗性细菌，更优选苯酚抗性恶臭假单胞菌菌株，更优选恶臭假单胞菌S12且最优选恶臭假单胞菌S12 ΔpheApobA。
9.权利要求1-8的方法，其中步骤b)和c)中的转化包含质粒转化和/或染色体转化。
10.可通过权利要求1-9的方法获得的重组宿主菌株。
11.重组宿主菌株，其包含分支酸且进一步包括包含ubiC(SEQ ID NO: 1)的第一核酸序列，和编码氧耐受性4-羟基苯甲酸脱羧酶的第二核酸序列，其中所述重组菌株能够在好氧条件下生产苯酚。
12.权利要求11的重组宿主菌株，其中所述第二核酸序列包含hbdBCD(SEQ ID NO: 2)。
13.权利要求11或12的重组宿主菌株，其中所述宿主菌株过度生产分支酸，其中所述宿主菌株优选包含一种或多种遗传修饰，以过度生产分支酸，其中所述遗传修饰优选包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失。
14.权利要求13的重组宿主菌株，其中所述遗传修饰包含用aroG(SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB(SEQ ID NO: 11)和aroL(SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
15.根据权利要求13的重组菌株，其中所述遗传修饰包含tyrR、pheA和tyrA中的一种或多种的缺失，且进一步包含用aroG(SEQ ID NO: 9)、aroGfbr (SEQ ID NO: 10)、aroB(SEQ ID NO: 11)和aroL(SEQ ID NO: 12)中的一种或多种的转化。
16.权利要求13-15中一项或多项的重组菌株，其中所述宿主选自细菌、酵母和真菌，其中所述细菌优选是大肠杆菌菌株，其中所述大肠杆菌菌株优选选自大肠杆菌BW25113、大肠杆菌DH10b和大肠杆菌LJ110。
17.权利要求13-15中一项或多项的重组菌株，其中所述宿主是苯酚抗性宿主，优选苯酚抗性细菌，更优选苯酚抗性恶臭假单胞菌菌株，更优选恶臭假单胞菌S12且最优选恶臭假单胞菌S12 ΔpheApobA。
18.在重组宿主中生产苯酚的方法，其包括下述步骤：
a) 提供根据权利要求10或权利要求11-17的重组宿主菌株，和
b) 在发酵条件下温育所述重组宿主菌株，从而生产苯酚。
19.权利要求18的方法，其中诱导苯酚生产，并且其中所产生的苯酚优选在从所述重组宿主菌株中收获所述苯酚的进一步的步骤c)中进行收获，并且其中优选地，至少步骤b)作为分批发酵、补料分批发酵或连续发酵执行。
20.权利要求18或权利要求19的方法，其中所述发酵条件包含好氧条件。
21.权利要求18-20的方法，其中所述发酵条件包含粗甘蔗汁的存在，其中所述粗甘蔗汁优选包含高浓度的1-蔗果三糖。
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