KR102323473B1 - 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된 형질 전환체는, 당류 등을 원료로서 효율적으로 4-히드록시벤조산 또는 그의 염을 제조할 수 있다. 호기성, 또는 형질 전환체가 증식하지 않는 조건하에서 형질 전환체를 배양하는 경우에는, 특히 효율적으로 4-히드록시벤조산 또는 그의 염을 제조할 수 있다.

Description

코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법{CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT AND METHOD FOR PRODUCING 4-HYDROXYBENZOIC ACID OR SALT THEREOF USED IN SAME}

본 발명은, 4-히드록시벤조산 또는 그 염(이하, 「4-HBA」로 약칭할 수 있다)의 생산 능력을 부여하기 위해 특정 유전자 조작이 각인된 코리네형 세균의 형질 전환체, 및 이 형질 전환체를 이용한 효율적인 4-HBA의 제조 방법에 관한 것이다.

지구 온난화 및 화석 자원의 고갈 문제를 배경으로, 재생 가능한 자원을 원료로 한 화학 제품의 제조는, 바이오 연료와 함께 새로운 산업 바이오 리파이너리로서 저탄소 사회 실현을 위한 중요한 방책인 것으로 인식되어, 주목받고 있다.

4-히드록시벤조산은, 항균제인 파라벤의 합성 원료로서 사용되는 것 외에, 액정의 폴리머 원료로서 이용되는 유용한 화학 물질이다.

현재, 4-HBA는 원유를 원료로 하여 화학적으로 생산되고 있다. 화학적인 4-HBA 제조 방법으로는, 예를 들면 페놀과 수산화칼륨 및 이산화탄소를 이용하여 고압 조건하에서 반응시키는 방법 등이 있다.

이러한 방법은, 출발물질인 페놀이 화석 원료에 의존하고 있을 뿐 아니라, 반응 프로세스중에서 고온 고압 조건을 필요로 하는, 전형적인 화학 공업의 고에너지소비형 제조 프로세스이다. 이에, 에너지 절약형으로, 재생 가능 자원으로부터 제조 가능한, 저폐기물 배출의 환경 조화형 프로세스의 개발, 즉 바이오법에 의한 4-HBA 제조 기술의 확립이 요구되고 있다.

그러나, 종래의 재생 가능 자원을 원료로 한 바이오법에 의한 4-HBA의 생산은, 바이오법에 의한 유산이나 에탄올의 생산에 비해, 원료가 되는 당으로부터의 대사 반응 단계 수가 매우 많기 때문에 생산성이 낮다. 또한, 생산물인 4-HBA에 의한 균의 증식 저해나, 세포 독성 등의 난점이 있다. 이 때문에, 공업적 생산은 실현되지 않는다.

4-HBA는, 방향족 아미노산 등의 합성에 관한 시킴산 경로의 중간체인 코리스미산으로부터 ubiC에 의해 코딩되는 코리스메이트-피루베이트 리아제에 의해 합성된다는 것이 대장균을 이용하여 밝혀지고 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 1, 2).

지금까지, 대장균 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자(ubiC)를 타종 미생물인 Klebsiella pneumoniae에 도입하여 4-HBA를 생성하고자 하는 시도가 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한 시킴산 경로를 증강시킨 대장균에서의 4-HBA의 발효 생산이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 게다가, 4-HBA에 의한 증식 저해나 독성 회피를 시험해 보기 위해, 4-HBA 내성주의 선발이나, 이온 교환 수지 첨가 배양이 보고되어 있지만, 4-HBA의 생산성은 실용적으로 충분하지 않다. 한편, 본 발명자들은 코리네형 세균에 코리스메이트-피루베이트 리아제를 도입하여 글루코스로부터 페놀을 생성하는 것을 보고하고 있지만, 중간물질인 4-HBA의 생성에 관한 기재나, 코리스메이트-피루베이트 리아제의 효소 활성에 관한 기술은 없다(특허문헌 3).

또한, 대장균 이외의 ubiC에 대해서는, Rhodobacter sphaeroides 유래의 것이 보고되어 있지만, 대장균을 숙주로 하여 상기 유전자를 고발현시킨 형질 전환체, 및 Rhodobacter sphaeroides를 숙주로 하여 상기 유전자를 고발현시킨 형질 전환체의 어느 것이라도, 4-HBA를 저농도로만 생산할 수 있고, 실용상 만족할 수 있는 것은 아니다(특허문헌 4).

대장균 유래의 UbiC 효소는, 효소학적인 분석이 상세하게 이루어지고 있으며, 생성물인 4-HBA에 의해 강력하게 저해되는 것이 알려져 있다. 따라서, 공업적으로 사용할 수 있는 4-HBA 고생산주의 구축을 위해서는, 고활성인 UbiC의 취득, 4-HBA에 의한 생성물 저해에 내성인 UbiC의 취득, 및 4-HBA에 내성인 숙주의 선택이 매우 중요하다.

특허문헌 1: 미국특허 6030819 특허문헌 2: 미국특허 6114157 특허문헌 3: 국제공개 2012/063862 특허문헌 4: 일본특허공개 2013-183048

비특허문헌 1: J. Bacteriol., 174, 5309-5316 (1992) 비특허문헌 2: Microbiology, 140, 897-904 (1994) 비특허문헌 3: Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 985-988 (1995) 비특허문헌 4: Biotechnol. Bioeng., 76, 376-390 (2001)

본 발명은 당류, 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 또는 코리스미산을 원료로 하여 효율적으로 4-HBA를 제조할 수 있는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 효율적으로 4-HBA를 제조하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들이 연구를 거듭한 결과, 코리네형 세균에 코리스미산으로부터 4-HBA의 생성 반응을 촉매하는 코리스메이트-피루베이트 리아제(chorismate pyruvate-lyase) 유전자를 도입한 형질 전환체가, 글루코스 등으로부터 효율적으로 4-HBA를 생성하는 것을 발견했다.

또한, 상기 형질 전환체는 호기성, 또는 실질적으로 증식하지 않는 조건에서 반응시킬 경우, 특히 4-HBA의 생산 효율이 높은 것을 발견했다.

또한, 지금까지 4-HBA의 생산이 보고되어 있는 여러 형질 전환체의 숙주에 대해, 그들의 증식에 미치는 4-HBA의 영향을 비교한 결과, 대장균, Rhodobacter sphaeroides, Corynebacterium glutamicum, 및 용매 내성균으로 보고되어 있는 Pseudomonas putida 중에서는, Corynebacterium glutamicum가 가장 4-HBA 내성이 높은 것을 발견했다.

본 발명은 상기 지견에 따라 완성된 것으로, 이하의 형질 전환체, 및 4-HBA의 제조 방법을 제공한다.

청구항 1. 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된, 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 생산 능력을 갖는 형질 전환체.

청구항 2. 청구항 1에 있어서, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 판토에아(Pantoea)속, 프로비덴시아(Providencia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속, 크로노박터(Cronobacter)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 모루가넬라(Morganella)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 쉬와넬라(Shewanella)속, 또는 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속 유래의 유전자인, 형질 전환체.

청구항 3. 청구항 1에 있어서, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 프로비덴시아 러스티기아니(Providencia rustigianii), 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii), 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에세리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 슈도알테로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 시트로박터 욘가에(Citrobacter youngae), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens) 또는 쿠프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis) 유래의 유전자인, 형질 전환체.

청구항 4. 청구항 1에 있어서, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA인 형질 전환체.

(a) 서열번호 1~21 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA; 및

(b) (a) 중 어느 하나의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하거나, 또는 (a) 중 어느 하나의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로 이루어진 DNA이며, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

청구항 5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나에 항에 있어서, 숙주의 코리네형 세균이 코리네박테리움속 세균인 형질 전환체.

청구항 6. 청구항 5에 있어서, 숙주의 코리네박테리움속 세균이 코리네박테리움 글루타미쿰인 형질 전환체.

청구항 7. 청구항 6에 있어서, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 R(FERM BP-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 형질 전환체.

청구항 8. 코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-2(수탁번호: NITE BP-01838) 형질 전환체.

청구항 9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 포함하는 반응액 중에서 배양하는 공정과, 반응액 중 4-히드록시벤조산 또는 그 염을 회수하는 공정을 포함하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법.

청구항 10. 청구항 9에 있어서, 호기성, 또는 형질 전환체가 증식하지 않는 조건에서 형질 전환체를 배양하는, 제조 방법.

본 발명의 형질 전환체를 이용함으로써, 글루코스 등의 당류나 코리스미산, 퀸산, 시킴산 등으로부터 4-HBA를 고효율로 제조할 수 있다.

일반적으로 미생물은, 4-HBA와 같은 방향족 화합물의 세포 독성에 의해 증식이 저해되기 때문에, 미생물을 이용하여 4-HBA를 제조하는 것은 어려웠다. 또한, 미생물이 갖는 코리스메이트-피루베이트 리아제의 활성은 일반적으로 약하고, 또한, 코리스메이트-피루베이트 리아제는 4-HBA에 의한 강한 생성물 저해를 받기 때문에, 충분한 4-HBA의 생산이 어려웠다. 그러나, 본 발명에 의하면, 4-HBA 내성이 우수한 미생물을 이용하여, 실용상 충분히 효율적으로 4-HBA를 제조할 수 있다.

도 1은 4-히드록시벤조에이트가 4종의 미생물(Corynebacterium glutamicum R, Escherichia coli JM109, Pseudomonas putida S12 ATCC700801, 및 Rhodobacter sphaeroides NBRC12203)의 증식에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

(1) 4- HBA 생산 능력을 갖는 형질 전환체

본 발명의 4-HBA 생산 능력을 갖는 형질 전환체는, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네형 세균에 도입된, 형질 전환체이다.

숙주

코리네형 세균은, 버지 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올로지[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8,599 (1974)]에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 통상의 호기성 조건에서 증식하는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적인 예를 들면, 코리네박테리움속균, 브레비박테리움속균 아스로박터속균, 미코박테리움속균, 마이크로코쿠스속균 등을 들 수 있다. 코리네형 세균 중에서는 코리네박테리움속균이 바람직하다.

코리네박테리움속균으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerance), 코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum) 등을 들 수 있다.

그 중에서도, 안전하고 4-HBA 생산성이 높은 점에서, 코리네박테리움 글루타미쿰이 바람직하다. 적합한 균주로서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R주(FERM BP-18976), ATCC13032주, ATCC13869주, ATCC13058주, ATCC13059주, ATCC13060주, ATCC13232주, ATCC13286주, ATCC13287주, ATCC13655주, ATCC13745주, ATCC13746주, ATCC13761주, ATCC14020주, ATCC31831주, MJ-233(FERM BP-1497), MJ-233AB-41(FERM BP-1498) 등을 들 수 있다. 이들 주는, 부다페스트 조약하에 국제기탁되어, 공개적으로 이용 가능하다.

그 중에서도, R주(FERM BP-18976), ATCC13032주, ATCC13869주가 바람직하다.

또한, 분자 생물학적 분류에 의해, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) 등의 코리네형 세균도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 균명이 통일되어 있다 [참조: Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum"DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260 (1991), 코마가타 카즈오, 코리네형 세균의 분류, 발효 및 공업, 45: 944-963 (1987)].

브레비박테리움속균으로는, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) (예를 들면, ATCC6872주) 등을 들 수 있다.

아스로박터속균은, 아스로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)(예를 들면, ATCC8010주, ATCC4336주, ATCC21056주, ATCC31250주, ATCC31738주, ATCC35698주) 등을 들 수 있다.

미코박테리움속균은, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(예를 들면, ATCC19210주, ATCC27289주) 등을 들 수 있다.

마이크로코쿠스속균은, 마이크로코쿠스 프류덴레이치이(Micrococcus freudenreichii)(예를 들면, No. 239주(FERM P-13221)), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus leuteus)(예를 들면, No. 240주(FERM P-13222)), 마이크로코쿠스 우레아에(Micrococcus ureae)(예를 들면, IAM1010주), 마이크로코쿠스 로제우스(Micrococcus roseus)(예를 들면, IFO3764주) 등을 들 수 있다.

또한, 코리네형 세균은 야생주 외에, 그 변이주나 인위적인 유전자 재조합체일 수 있다. 예를 들면, 락테이트(젖산) 데히드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH), 포스포에놀피루브산 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 말산데히드로게나제(malate dehydrogenase) 등의 유전자의 파괴주를 들 수 있다. 그 중에서도, 락테이트 데히드로게나제 유전자의 파괴주가 바람직하다. 이 유전자 파괴주는, 젖산 데히드로게나제 유전자가 파괴됨으로써, 피루브산에서 젖산으로의 대사 경로가 차단되어 있다. 그 중에서도, 코리네박테리움 글루타미쿰의, 특히 R(FERM BP-18976)주의 락테이트 데히드로게나제 유전자의 파괴주가 바람직하다.

이러한 유전자 파괴주는, 유전자 공학적 수법에 의해 통상적인 방법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들면, WO2005/010182A1에, 젖산 데히드로게나제 파괴주, 및 그 제작방법이 기재되어 있다.

도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명자들은 코리네형 세균이 다른 세균에 비해 4-HBA에 대한 내성이 매우 높은 것을 발견했다. 이 점에서, 코리네형 세균은 본 발명의 방법에 의한 4-HBA 제조에 적합하다.

코리스메이트 - 피루베이트 리아제 효소 유전자

코리스메이트-피루베이트 리아제는, 코리스산으로부터 4-HBA와 피루브산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다.

코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 유래는, 특별히 한정되지 않고, 판토에아(Pantoea)속, 프로비덴시아(Providencia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속, 크로노박터(Cronobacter)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 모루가넬라(Morganella)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 쉬와넬라(Shewanella)속, 또는 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속 미생물 유래의 유전자를 들 수 있다.

효소 비활성이 높은 점에서는, 판토에아속, 프로비덴시아속, 에세리키아속, 슈도알테로모나스속, 크로노박터속, 시트로박터속, 또는 엔테로박터속 미생물 유래의 유전자가 바람직하고, 4-HBA에 의한 생성물 저해를 받기 어려운 점에서는, 프로비덴시아속, 엔테로박터속, 쉬와넬라속, 또는 카프리아비두스속 미생물 유래의 유전자가 바람직하고, 형질 전환체에 의한 4-HBA 생산성이 좋은 점에서는, 판토에아속, 프로비덴시아속, 에세리키아속, 또는 크로노박터속 미생물 유래의 유전자가 바람직하다. 종합적으로 보면, 프로비덴시아속, 또는 크로노박터속 유래의 유전자가 보다 바람직하다.

구체적으로는, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 프로비덴시아 러스티지아니이(Providencia rustigianii), 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii), 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에세리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 슈도알테로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 시트로박터 얀가에(Citrobacter youngae), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 모루가넬라 모루가니이(Morganella morganii), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 쿠프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis) 유래의 유전자를 들 수 있다.

판토에아 아나나티스 유래의 유전자로는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 러스티 지아니이 유래의 유전자로는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 스투아르티 유래의 유전자로는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 스니비아 유래의 유전자로는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 레트게리 유래의 유전자로는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 알칼리파시엔스 유래의 유전자로는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 프로비덴시아 버호도그라나리에아 유래의 유전자로는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 에세리키아 콜라이 유래의 유전자로는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 에세리키아 페르구소니 유래의 유전자로는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 슈도알테로모나스 피시시아 유래의 유전자로서는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 슈도알테로모나스 할로플랑크티스 유래의 유전자로는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 크로노박터 사카자키 유래의 유전자로는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 시트로박터 얀가에 유래의 유전자로는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 시트로박터 코세리 유래의 유전자로는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 엔테로박터 아에로게네스 유래의 유전자로는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 엔테로박터 클로아케 유래의 유전자로는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 슈도모나스 푸티다 유래의 유전자로서는 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 모루가넬라 모루가니이 유래의 유전자로는 서열번호의 염기서열 18의 유전자를 들 수 있으며, 아조토박터 비넬란디이 유래의 유전자로는 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 쉬와넬라 푸트레파시엔스 유래의 유전자로는 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 유전자를 들 수 있으며, 카프리아비두스 타이와넨시스 유래의 유전자로는 서열번호의 염기서열 21의 유전자를 들 수 있다.

또한, 염기서열 1~21 중 어느 하나의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하는 DNA이며, 한편 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(유연체)도 사용할 수 있다.

본 발명에서 「스트린젠트한 조건」은, 6×SSC의 염농도의 하이브리디제이션 용액 중, 50~60℃의 온도 조건에서 16시간 하이브리디제이션을 실시하고, 0.1×SSC의 염농도의 용액에 세정을 실시하는 조건을 말한다.

또한, 염기서열 1~21 중 어느 하나의 염기서열과 90% 이상, 그 중에서도 95% 이상, 그 중에서도 98% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로 이루어진 DNA이며, 한편 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(유연체)도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 염기서열의 동일성은, GENETYX ver.8(GENETYX주식회사제네틱스제)에 의해 산출한 값이다.

코리스메이트-피루베이트 리아제 활성은, 「Microbiology, 140, 897-904 (1994)」에 기재된 방법을 개질하여 측정할 수 있다. 쉽게 설명하면, 시험용액에 피험효소를 첨가하고, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.5mM chorismate Ba salt, 0.2mM NADH 0.2M NaCl, 5Unit 락테이트 데히드로게나제를 포함시키고, 33℃에서 반응시키고, NADH에서 유래한 340nm의 흡광도의 감소를 추적함으로써 반응 초속도를 측정한다. chorismate Ba salt를 첨가하지 않은 계에 대해서도 마찬가지로 반응시키고, 백그라운드치로 한다. 두 측정치의 차이를 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성으로 하여, 효소 및 기질 첨가에 의존하는 NADH 유래의 340nm의 경시적, 직선적인 흡광도 감소가 인정된 경우에, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 가진다고 판정한다. 효소 활성의 1unit은, 1분당 1마이크로몰의 4-HBA를 생산하게 하는 효소량으로 정의하고, 효소 반응의 초속도로부터 산출한다.

염기서열 1~21 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA의 유연체는, 예를 들면, 이들 염기서열에 근거하여 통상적인 방법에 따라 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용한 PCR 또는 하이브리디제이션에 의해, 다른 생물종의 DNA 라이브러리로부터 선택할 수 있으며, 이로 인해 높은 확률로 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 얻어진다.

또한, 본 발명의 형질 전환체는, 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자가 도입되어있지 않은 것이 바람직하다. 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제는, 4-HBA를 페놀로 변환하는 효소이다. 코리네형 세균은 내재성 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자를 가지고 있지 않기 때문에, 외래성의 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자를 도입하지 않는 경우, 코리네형 세균은 4-HBA로부터 페놀로의 변환을 실시하지 않는다. 한편, 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자에 추가로 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자를 도입하면, 형질 전환체는 글루코스 등의 당류에서 4-HBA를 통해 페놀을 생산하게 된다.

그러나, 일반적으로 페놀은 4-HBA보다 효소에 대한 저해력이 현격히 강하기 때문에, 당류에서 다단계의 반응을 거쳐 페놀을 제조하려고 하면, 페놀이 다수의 효소를 저해시켜, 페놀 제조 효율이 나빠진다. 한편, 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자가 도입되어 있지 않고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자가 도입된 형질 전환체를 이용하여 당류로부터 독성이 비교적 낮은 4-HBA를 일단 제조하고, 별도로, 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자가 도입된 형질 전환체 또는 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 효소 자체를 이용하여 4-HBA에서 페놀을 제조하는 경우는, 페놀의 영향을 받는 효소가 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제뿐이기 때문에, 페놀 제조 효율이 비교적 좋아진다.

또한, 일반적으로 페놀은 4-HBA보다 세포 독성도 현격히 강하다. 미생물을 이용하여 당류에서 페놀을 제조하는 경우, 다단계의 반응을 거치기 때문에, 페놀 제조에 시간이 걸린다. 이로 인해, 미생물이 생성된 페놀에 장시간 노출되어 독성의 영향을 받아, 페놀 제조 효율이 나빠진다. 한편, 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자가 도입되어 있지 않고, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자가 도입된 형질 전환체를 이용하여, 당류에서 세포 독성이 비교적 낮은 4-HBA를 생성하면, 다단계의 반응을 거침으로써 장시간을 필요로 해도 형질 전환체가 받는 데미지는 적다. 게다가, 별도로 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 유전자가 도입된 형질 전환체 또는 4-히드록시벤조에이트 데카복실라아제 효소 자체를 이용하여 4-HBA에서 페놀을 제조함으로써, 효율적으로 당류에서 페놀을 제조할 수 있다.

형질 전환체를 위한 벡터의 구축

PCR로 증폭한 코리스메이트-피루베이트 리아제 효소를 코딩하는 DNA는, 각각 숙주에서 증폭할 수 있는 적절한 벡터에 클로닝하면 괜찮다.

플라스미드 벡터로는, 코리네형 세균내에서 자율 복제 기능을 담당하는 유전자를 포함하는 것이면 괜찮다. 그 구체적인 예로는, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 2256 유래의 pAM330[일본특허공개 소58-67699호 공보], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] 및 [Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267 (1985)], 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC3058 유래의 pHM1519[Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] 및 pCRY30[Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 759-764 (1991)], 코리네박테리움 글루타미쿰 T250 유래의 pCG4[일본특허공개 소57 -183799호 공보], [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14, pAG50[일본특허공개 소62-166890], pEK0, pEC5, pEKEx1[Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene 102: 93-98 (1991)] 등을 들 수 있다.

바람직한 프로모터로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데히드로게나제A 유전자(gapA)의 프로모터 PgapA, 말레이트 데히드로게나제 유전자(mdh)의 프로모터 Pmdh, 락테이트 데히드로게나제A 유전자(ldhA)의 프로모터 PldhA 등을 들 수 있고, 그 중에서도 PgapA가 바람직하다.

바람직한 터미네이터로는, 대장균 rRNA 오페론의 rrnB T1T2 터미네이터, 대장균의 trpA 터미네이터, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 trp 터미네이터 등을 들 수 있고, 그 중에서도 rrnB T1T2 터미네이터가 바람직하다.

형질 전환

형질 전환 방법은, 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 공지의 방법으로, 예를 들면, 염화칼슘ㆍ염화루비듐법, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란 개재 트란스펙션, 전기천공법 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 코리네형 세균은 전기펄스법이 적합하고, 전기펄스법은 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다(Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)).

형질 전환체는, 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 이용하여 배양할 수 있다. 이 배지로는, 통상적으로 탄소원, 질소원, 무기염류, 및 그 외 영양물질을 함유하는 천연 배지, 또는 합성 배지를 이용할 수 있다.

탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 만노스, 말토스, 만니톨, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 전분, 당밀, 소르비톨, 글리세린 등의 당질 또는 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산 또는 글루콘산 등의 유기산; 에탄올, 프로판올 등의 알코올을 들 수 있다. 탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수 있고, 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 배지 중 이들 탄소원의 농도는, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄 등의 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 들 수 있다. 또한, 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 이용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용해도 괜찮고, 또한 2종 이상을 혼합하여 사용해도 괜찮다. 배지 중 질소원 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는, 예를 들면 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산코발트, 또는 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 이들 무기염은, 1종을 단독으로 사용해도 좋고, 또한 2종 이상을 혼합해서 사용해도 괜찮다. 배지 중 무기염류 농도는, 사용하는 무기염에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~1(w/v%)일 수 있다.

영양물질로서, 예를 들면 육즙, 펩톤, 폴리펩톤, 효모 추출물, 건조 효모, 콘 스티프 리쿼, 탈지분유, 탈지대두 염산 가수분해물, 또는 동식물이나 미생물 균체의 추출물이나 그들의 분해물 등을 얻을 수 있지만, 통상적으로, 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다. 또한, 필요에 따라 비타민을 첨가 할 수도 있다. 비타민류로는, 예를 들면 비오틴, 티아민, 피리독신, 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

바람직한 미생물 배양 배지로는, A배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)], BT배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)] 등을 들 수 있다.

배양 온도는 약 15~45℃으로 하면 괜찮고, 배양 시간은 약 1~7일일 수 있다.

숙주 염색체 유전자의 파괴 또는 결실

숙주의 코리네형 세균은, 그 염색체상에 존재하는 4-히드록시벤조에이트 히드록시라아제 유전자가 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 바람직하다. 4-히드록시벤조에이트 히드록시라아제를 파괴함으로써 생성된 4-HBA의 대사가 억제되고, 4-HBA의 생산성이 향상됨과 동시에 부생성물이 적어진다.

유전자의 부분 배열을 결실하고, 제대로 기능하는 효소 단백질을 생산하지 않도록 개변한 결실형 유전자를 제작하고, 상기 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질 전환하고, 결실형 유전자와 염색체상의 유전자로 상동 재조합을 일으킴으로써, 염색체상의 유전자를 결실형 또는 파괴형 유전자로 치환할 수 있다. 결실형 또는 파괴형 유전자에 의해 코딩되는 효소 단백질은, 생성했다고 해도, 야생형 효소 단백질과는 다른 입체 구조를 가지며, 기능이 저하 또는 소실되어 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 결실 또는 파괴는 이미 확립되어 있으며, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 이용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 이용하는 방법 등이 있다(미국특허 제6303383호, 일본특허공개 평05-007491호).

(2) 4- HBA의 제조 방법

상기에 설명한 본 발명의 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 함유하는 반응액 중에서 반응시키는 공정과, 반응액 중의 4-HBA를 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해 4-HBA를 제조할 수 있다.

원료 화합물은 형질 전환체가 세포 내에 도입할 수 있는 화합물인 것이 필요하며, 또한, 식물에 많이 포함되어 있는 등, 공업적으로 이용하기 쉬운 것이 바람직하다.

당류로는 글루코스가 적합하지만, 대사에 의해 글루코스를 생성할 수 있는 당류도 사용할 수 있다. 이러한 당류에는 글루코스 단위를 갖는 올리고당 또는 다당류가 포함된다. 이러한 당류로는 프럭토스, 만노스, 아라비노스, 자일로스, 갈락토스 등의 단당류; 셀로비오스, 자당, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 자이로비오스 등의 2당류; 덱스트린 또는 가용성 전분 등의 다당류 등을 들 수 있다.

또한, 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물로는 퀸산, 시킴산 등을 들 수 있다.

또한, 예를 들면 이들의 원료 화합물을 포함하는 원료로, 당밀도 이용할 수 있다. 또한, 짚(볏짚, 큰 밀짚, 작은 밀짚, 라이밀짚, 오트밀짚 등), 버개스, 콘 스토버 등의 비가식(非可食) 농산폐기물이나 스위치그래스, 네피아그래스, 미스칸사스 등의 에너지 작물 및 톱밥, 파지 등을 당화 효소 등으로 당화시킨, 글루코스 등의 복수의 당을 포함하는 당화액을 이용할 수도 있다. 그 중에서도, 원료 화합물로는 글루코스, 코리스미산, 퀸산, 시킴산이 바람직하다.

미생물의 증식

반응에 앞서, 형질 전환체를 호기성 조건하에서 온도 25~38℃로, 약 12~48시간 배양하여 증식시키는 것이 바람직하다.

배양용 배지

반응에 앞서, 형질 전환체의 호기성 배양에 이용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외 영양물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지를 이용할 수 있다.

탄소원으로서 당류(글루코스, 프럭토스, 만노스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스 같은 단당; 수크로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 자이로비오스, 트레할로스와 같은 2당; 전분과 같은 다당; 당밀 등), 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세린과 같은 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 이용할 수 있다.

탄소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄과 같은 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한, 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 질소원의 배지 중 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산코발트, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 무기염은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 무기염류의 배지 중 농도는, 사용하는 무기염에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.01~1(w/v%)일 수 있다.

영양물질로는 육즙, 펩톤, 폴리펩톤, 효모 추출물, 건조 효모, 콘 스티프 리쿼, 탈지분유, 탈지대두 염산 가수분해물, 동식물 또는 미생물 균체 추출물이나 그들의 분해물 등을 들 수 있다. 영양물질의 배지 중 농도는, 사용하는 영양물질에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로는 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

구체적인 바람직한 코리네형 세균용 배지로는 A배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)], BT배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)] 등을 들 수 있다. 이들 배지에서, 당류 농도를 상기 범위로 하여 이용하면 괜찮다.

반응액

반응액으로는 탄소원, 질소원 및 무기염류 등을 함유하는 천연 반응액 또는 합성 반응액을 이용할 수 있다.

탄소원으로는, 상기 설명한 원료 화합물 또는 이를 포함하는 당밀이나 당화액 등을 이용할 수 있다. 또한, 탄소원으로서 당류 외에 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 글리세린과 같은 당알코올; 아세트산, 구연산, 젖산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올과 같은 알코올; 노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 이용할 수 있다.

탄소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

반응액 중의 원료 화합물의 농도는 약 1~20(w/v%)가 바람직하고, 약 2~10(w/v%)이 보다 바람직하고, 약 2~5(w/v%)가 더욱 바람직하다.

또한, 원료 화합물을 포함하는 전체 탄소원의 농도는, 약 2~5(w/v%)일 수 있다.

질소원으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄과 같은 무기 또는 유기암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산나트륨, 질산칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한 콘 스티프 리쿼, 육즙, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 함질소 유기화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 질소원의 반응액 중의 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.1~10(w/v%)일 수 있다.

무기염류로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 질산제1철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 무기염은 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 무기염류의 반응액 중의 농도는, 사용하는 무기염 따라 다르지만, 통상적으로 약 0.01~1(w/v%)일 수 있다.

또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로는 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 들 수 있다.

반응액의 pH는 약 6~8이 바람직하다.

구체적인 바람직한 코리네형 세균용 반응액으로는, 상술한 BT배지 등을 들 수 있다. 이들 배지에 있어서, 당류 농도를 상기 범위로 하여 이용하면 괜찮다.

반응 조건

반응 온도, 즉 형질 전환체의 생존 온도는, 약 20~50℃가 바람직하고, 약 25~47℃가 보다 바람직하다. 상기 온도 범위이면, 효율적으로 4-HBA를 제조할 수 있다.

또한, 반응 시간은, 약 1~7일간이 바람직하며, 약 1~3일간이 보다 바람직하다.

배양은 배치(batch)식, 유가식, 연속식의 어느 것이어도 괜찮다. 그 중에서도, 배치식이 바람직하다.

반응은 호기성 조건에서 실시해도 괜찮고, 환원 조건에서 실시해도 괜찮다. 본 발명의 형질 전환체 자체의 4-HBA 생산 능력은 호기성 조건 쪽이 높다. 그러나, 호기성 조건하에서는 형질 전환체가 증식하기 때문에, 원료 화합물이 증식을 위해 소비되고, 그만큼 4-HBA 제조 효율이 저하된다.

따라서, 호기성, 또한 형질 전환체가 증식하지 않는 조건하에서 반응시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증식하지 않는 것에는, 실질적으로 증식하지 않는 것, 또는 거의 증식하지 않는 것이 포함된다. 예를 들면, 미생물의 증식에 필수 화합물인 비오틴, 티아민 등 비타민류, 질소원 등의 1종 이상을 결핍, 혹은 제한시킨 반응액을 이용함으로써, 형질 전환체의 증식을 회피 또는 억제할 수 있다.

또한, 환원 조건에서는, 코리네형 세균은 실질적으로 증식하지 않기 때문에, 원료 화합물이 증식을 위해 소비되지 않는 만큼, 4-HBA 제조 효율이 높아진다.

환원 조건은, 반응액의 산화 환원 전위로 규정된다. 반응액의 산화 환원 전위는, 약 -200mV~ -500mV가 바람직하고, 약 -150mV~ -500mV이 보다 바람직하다.

반응액의 환원 상태는 간편하게는 레자주린 지시약(환원 상태라면, 파란색에서 무색으로 탈색)으로 추정할 수 있지만, 정확하게는 산화 환원 전위차 합(예를 들면, BROADLEY JAMES사제, ORP Electrodes)를 이용해서 측정할 수 있다.

환원 조건에서 반응액의 조정 방법은, 공지의 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응액의 액체 매체로서, 증류수 등 대신 반응액용 수용액을 사용해도 괜찮고, 반응액용 수용액의 조정 방법은, 예를 들면 황산 환원 미생물 등의 절대 혐기성 미생물의 배양액 조정 방법(Pfennig, N. et al. (1981): The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats Isolation and Identification of bacteria, Ed.by Starr, M. P. et al., p926- 940, Berlin, Springer Verlag)이나 「농예 화학 실험서 제3권, 교토대학 농학부 농예 화학 교실편, 1990년 제26쇄, 산업도서 주식회사 출판」등을 참조하여 목적하는 환원 조건하의 수용액을 얻을 수 있다.

구체적으로는, 증류수 등을 가열 처리나 감압 처리하여 용해 가스를 제거함으로써, 환원 조건의 반응액용 수용액을 얻을 수 있다. 이 경우, 약 10mmHg 이하, 바람직하게는 약 5mmHg 이하, 보다 바람직하게는 약 3mmHg 이하의 감압 하에서, 약 1~60분 정도, 바람직하게는 약 5~40분 정도, 증류수 등을 처리함으로써 용해 가스, 특히 용해 산소를 제거하여 환원 조건의 반응액용 수용액을 만들 수 있다.

또한, 적당한 환원제(예를 들면, 티오글리콜산, 아스코르빈산, 시스테인염산염, 메르캅토아세트산, 티오아세트산, 글루타티온, 황화 소다 등)를 첨가하여 환원 조건의 반응액용 수용액을 조정할 수도 있다.

이들 방법을 적절히 조합하는 것도 유효한 환원 조건의 반응액용 수용액의 조정 방법이다.

환원 조건하에서 반응시키는 경우, 반응 중 반응액을 환원 조건으로 유지하는 것이 바람직하다. 반응 도중에서의 환원 조건을 유지하기 위해, 반응계 밖에서 산소의 혼입을 가능한 한 방지하는 것이 바람직하며, 구체적으로는, 반응계를 질소 가스 등의 불활성 가스나 탄산 가스 등으로 봉입하는 방법을 들 수 있다. 산소 혼입을 보다 효과적으로 방지하는 방법으로는, 반응 도중에 본 발명의 호기성 세균의 균체 내의 대사 기능을 효율적으로 기능시키기 위해, 반응계의 pH 유지 조정액의 첨가나 각종 영양소 용해액을 적절하게 첨가할 필요가 생기는 경우도 있지만, 이러한 경우에는 첨가 용액에서 산소를 미리 제거해 두는 것이 유효하다.

4- HBA의 회수

상기와 같이 하여 배양함으로써, 반응액 중에 4-HBA가 생산된다. 반응액을 회수함으로써 4-HBA를 회수할 수 있지만, 공지의 방법으로 4-HBA를 반응액으로부터 분리할 수도 있다. 이러한 공지의 방법으로서, 이온 교환 수지법, 농축법, 결정석출법, 막 분리법, 유기 용매 추출법, 각종 흡착법 등을 들 수 있다.

[실시예 1]

4- 히드록시벤조에이트 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자)의 클로닝과 발현

(1) 미생물로부터의 염색체 DNA의 추출

판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) LMG 20103로부터의 염색체 DNA 추출은, LMG Bacteria Culture Medium No.1 배지[Beef extract 1g, Yeast extract 2g, Peptone 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.4로 조정]에, 백금이(白金耳)를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 28℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사(Amersham社)제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 러스티지아니이(Providencia rustigianii) JCM 3953로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) ATCC 25827로부터의 염색체 DNA 추출은, ATCC Medium No.3 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 6.8로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia) JCM 16941로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.27 배지[Peptone 15g, Soya peptone 5g, Sodium Chloride 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 28℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) JCM 1675로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens) JCM 1673로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

프로비덴시아 버호도그라나리에아(Providencia burhodogranariea) JCM 16940로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.27 배지[Peptone 15g, Soya peptone 5g, Sodium Chloride 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 28℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

에세리키아 콜라이(Escherichia coli) K12 MG1655로부터의 염색체 DNA 추출은, LB배지[Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

에세리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii) NBRC 102419로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[Polypepton 10g, Yeast extract 2g, MgSO47H2O 1g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 30℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

슈도알테로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida) JCM 20779로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.118 배지[MARINE BROTH-2216(벡톤디킨슨사제) 37.4g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 30℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis) NBRC 102225로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.304 배지[MARINE BROTH-2216(벡톤디킨슨사제) 37.4g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 25℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii) JCM 1233로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.12 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

시트로박터 얀가에(Citrobacter youngae) ATCC 29220로부터의 염색체 DNA 추출은, ATCC Medium No.3 배지[Peptone 5g, Beef extract 3g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 6.8로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895로부터의 염색체 DNA 추출은, ATCC Medium No.18 배지[Peptone 15g, Soya peptone 5g, Sodium Chloride 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 취급 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes) NBRC 13534로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[Polypepton 10g, Yeast extract 2g, MgSO₄ㆍ7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) NBRC 13535로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[Polypepton 10g, Yeast extract 2g, MgSO₄ㆍ7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 47054로부터의 염색체 DNA 추출은, ATCC Medium No.1065 배지[Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 37℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

모루가넬라 모루가니이 (Morganella morganii) NBRC 3848로부터의 염색체 DNA 추출은 NBRC Medium No.802 배지 [Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 1 g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0으로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 30℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii) ATCC 9104로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.805 배지[Yeast extract 1g, Mannitol 5g, K₂HPO₄ 0.7g, KH₂PO₄ 0.1g, MgSO₄ㆍ7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0-7.2로 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 26℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

슈와네라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens) JCM 20190로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.22 배지[Peptone 10g, Beef extract 10g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해한 후, pH를 7.0- 7.2 조정]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 25℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

쿠프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis) LMG 19424로부터의 염색체 DNA 추출은, JC Medium No.27 배지[Peptone 15g, Soya peptone 5g, Sodium Chloride 5g을 증류수 1L에 용해]에, 백금이를 이용하여 식균한 후, 대수생장기까지 25℃에서 진탕배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아머샴사제)를 이용하여, 설명서에 따라, 수집한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

(2) 4- 히드록시벤조에이트 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자)의 클로닝

4-히드록시벤조에이트 생산 유전자(코리스메이트-피루베이트 리아제 유전자)를 코딩하는 ubiC 유전자를 포함하는 DNA단편을 이하의 PCR법에 따라 증폭했다.

PCR 시, ubiC 유전자를 클론화할 수 있도록 ubiC 유전자를 포함하는 유전자 배열, 서열번호 1(Pantoea ananatis ubiC 유전자), 서열번호 2(Providencia rustigianii ubiC 유전자), 서열번호 3(Providencia stuartii ubiC 유전자), 서열번호 4(Providencia sneebia ubiC 유전자), 서열번호 5(Providencia rettgeri ubiC 유전자), 서열번호 6(Providencia alcalifaciens ubiC 유전자), 서열번호 7(Providencia burhodogranariea ubiC 유전자), 서열번호 8(Escherichia coli ubiC 유전자), 서열번호 9(Escherichia fergusonii ubiC 유전자), 서열번호 10(Pseudoalteromonas piscicida ubiC 유전자), 서열번호 11(Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC 유전자), 서열번호 12(Cronobacter sakazakii ubiC 유전자), 서열번호 13(Citrobacter youngae ubiC 유전자), 서열번호 14(Citrobacter koseri ubiC 유전자), 서열번호 15(Enterobacter aerogenes ubiC 유전자), 서열번호 16(Enterobacter cloacae ubiC 유전자), 서열번호 17(Pseudomonas putida ubiC 유전자), 서열번호 18(Morganella morganii ubiC 유전자), 서열번호 19(Azotobacter vinelandii ubiC 유전자), 서열번호 20(Shewanella putrefaciens ubiC 유전자), 서열번호 21(Cupriavidus taiwanensis ubiC 유전자)를 근거로 하여, 각각 하기 한 쌍의 프라이머를 합성해서 사용했다.

Pantoea ananatis ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-1); 5'-CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT-3' (서열번호 22)

(b-1); 5'-CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG-3' (서열번호 23)

또한, 프라이머(a-1) 및 (b-1)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia rustigianii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-2); 5'-CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC-3' (서열번호 24)

(b-2); 5'-CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG-3' (서열번호 25)

또한, 프라이머(a-2) 및 (b-2)는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia stuartii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-3); 5'-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3' (서열번호 26)

(b-3); 5'-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3' (서열번호 27)

또한, 프라이머(a-3) 및 (b-3)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia sneebia ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-4); 5'-CTCTCATATGGATGATACGCTTTTTACCTCTC-3' (서열번호 28)

(b-4); 5'-CTCTCATATGCTTCCCTTCACTTGTCATGC-3' (서열번호 29)

또한, 프라이머(a-4) 및 (b-4)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia rettgeri ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-5); 5'-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACTTCTCAG-3' (서열번호 30)

(b-5); 5'-CTCTCATATGTTAACGATATGCAGGTGATTCAGG-3' (서열번호 31)

또한, 프라이머(a-5) 및 (b-5)는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia alcalifaciens ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-6); 5'-CTCTCATATGCATGAAACGATTTTTACCTCTCATC-3' (서열번호 32)

(b-6); 5'-CTCTCATATGGTTATCTATATGCAGGTGATTCAGG-3' (서열번호 33)

또한, 프라이머(a-6) 및 (b-6)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Providencia burhodogranariea ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-7); 5'-CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACCTCTC-3' (서열번호 34)

(b-7); 5'-CTCTCATATGATACTTCCCTCCACTTGTCG-3' (서열번호 35)

또한, 프라이머(a-7) 및 (b-7)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Escherichia coli ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-8); 5'-CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA-3' (서열번호 36)

(b-8); 5'-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3' (서열번호 37)

또한, 프라이머(a-8) 및 (b-8)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Escherichia fergusonii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-9); 5'-CTCTCATATGCTGATTTTGCAACAACTGGTG-3' (서열번호 38)

(b-9); 5'-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGATGCAGG-3' (서열번호 39)

또한, 프라이머(a-9) 및 (b-9)는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Pseudoalteromonas piscicida ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-10); 5'-CTCTCATATGCCTTTGCAATTACCCTTAGAG-3' (서열번호 40)

(b-10); 5'-CTCTCATATGAAGCCTGCCATTTCTGGTGG-3' (서열번호 41)

또한, 프라이머(a-410) 및 (b-10)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-11); 5'-CTCTCATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC-3' (서열번호 42)

(b-11); 5'-CTCTCATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG-3' (서열번호 43)

또한, 프라이머(a-11) 및 (b-11)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-12); 5'-CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG-3' (서열번호 44)

(b-12); 5'-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3' (서열번호 45)

또한, 프라이머(a-12) 및 (b-12)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Citrobacter youngae ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-13); 5'-CTCTCATATGCCACACCCTGCGTTAA-3' (서열번호 46)

(b-13); 5'-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGCA-3' (서열번호 47)

또한, 프라이머(a-13) 및 (b-13)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Citrobacter koseri ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-14); 5'-CTCTCATATGTCACACCCTGCGTTAAC-3' (서열번호 48)

(b-14); 5'-CTCTCATATGTTAATACAACGGTGATGCGGG-3' (서열번호 49)

또한, 프라이머(a-14) 및 (b-14)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Enterobacter aerogenes, ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-15); 5'-CTCTCATATGCCACATCCTGCGCTTAC-3' (서열번호 50)

(b-15); 5'-CTCTCATATGTTAATACAATGGCGATGCAGGC-3' (서열번호 51)

또한, 프라이머(a-15) 및 (b-15)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Enterobacter cloacae ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-16); 5'-CTCTCATATGTCACACCCTGCGCTAA-3' (서열번호 52)

(b-16); 5'-CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGC-3' (서열번호 53)

또한, 프라이머(a-16) 및 (b-16)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Pseudomonas putida ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-17); 5'-CTCTCATATGTCGTACGAATCCCCG-3' (서열번호 54)

(b-17); 5'-CTCTCATATGTCAGCGGTTTTCCTCCTTG-3' (서열번호 55)

또한, 프라이머(a-17) 및 (b-17)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Morganella morganii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-18); 5'-CTCTCATATGACACAAACAGTGATAACACCC-3' (서열번호 56)

(b-18); 5'-CTCTCATATGCCACGTTATTCTTCTCCGAG-3' (서열번호 57)

또한, 프라이머(a-18) 및 (b-18)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Azotobacter vinelandii ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-19); 5'-CTCTCATATGACCGCTGCTCCCG-3' (서열번호 58)

(b-19); 5'-CTCTCATATGTTATAGGGTGTCCGGGTC -3 (서열번호 59)

또한, 프라이머(a-19) 및 (b-19)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Shewanella putrefaciens, ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-20); 5'-CTCTCATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC-3' (서열번호 60)

(b-20); 5'-CTCTCATATGTCACTGGCAAATTGCTCGC-3' (서열번호 61)

또한, 프라이머(a-20) 및 (b-20)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

Cupriavidus taiwanensis ubiC 유전자 증폭용 프라이머

(a-21); 5'-CTCTCATATGAGCGCGCAGTCCGTG-3' (서열번호 62)

(b-21); 5'-CTCTCATATGCAGTTTCATCTCGTGGTCTC-3' (서열번호 63)

또한, 프라이머(a-21) 및 (b-21)에는 NdeI 제한효소 부위가 부가되어 있다.

주형(型) DNA는, Pantoea ananatis LMG 20103, Providencia rustigianii JCM 3953, Providencia stuartii ATCC 25827, Providencia sneebia JCM 16941, Providencia rettgeri JCM 1675, Providencia alcalifaciens JCM 1673, Providencia burhodogranariea JCM 16940, Escherichia coli MG 1655, Escherichia fergusonii NBRC 102419, Pseudoalteromonas piscicida JCM 20779, Pseudoalteromonas haloplanktis NBRC 102225, Cronobacter sakazakii JCM 1233, Citrobacter youngae ATCC 29220, Citrobacter koseri ATCC BAA-895, Enterobacter aerogenes NBRC 13534, Enterobacter cloacae NBRC 13535, Pseudomonas putida ATCC 47054, Morganella morganii NBRC 3848, Azotobacter vinelandii ATCC 9104, Shewanella putrefaciens JCM 20190 및 Cupriavidus taiwanensis LMG 1942에서 추출한 염색체 DNA를 이용했다..

*) 균주 구입 기관의 약칭은 다음과 같다.

<기관 약칭>

ATCC: American Type Culture Collection

JCM: Japan Collection of Microorganisms

LMG: Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms/Laboratory for Microbiology of the Faculty of Sciences of Ghent University (BCCM/LMG)

NBRC: NITE Biological Resource Center

실제 PCR은, Veriti 써머 사이클러(Thermal cycler)(어플라이드바이오시스템즈사제)를 이용하고, 반응 시약으로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라바이오주식회사제)를 이용하여, 아래의 조건에서 실시했다.

반응액:

PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl

5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 10μl

dNTP Mixture (2.5mM each) 4μl

주형 DNA 1μl (DNA 함유량 1μg 이하)

상기 기재된 2종 프라이머*) 각각 1μl (최종 농도 0.2μM)

멸균 증류수 32μl

이상을 혼합하여, 50μl의 반응액을 PCR에 걸었다.

*) Pantoea ananatis ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-1)와 (b-1)의 조합, Providencia rustigianii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-2)와 (b-2)의 조합, Providencia stuartii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-3)와 (b-3)의 조합, Providencia sneebia ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-4)와 (b-4)의 조합, Providencia rettgeri ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-5)와 (b-5)의 조합, Providencia alcalifaciens ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-6)와 (b-6)의 조합, Providencia burhodogranariea ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-7)와 (b-7)의 조합, Escherichia coli ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-8)와 (b-8)의 조합, Escherichia fergusonii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-9)와 (b-9)의 조합, Pseudoalteromonas piscicida ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-10)와 (b-10)의 조합, Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC 유전자를 증폭하는 경우 프라이머(a-11)와 (b-11)의 조합, Cronobacter sakazakii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-12)와 (b-12)의 조합, Citrobacter youngae ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-13)와 (b-13)의 조합, Citrobacter koseri ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-14)와 (b-14)의 조합, Enterobacter aerogenes ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a -15)와 (b-15)의 조합, Enterobacter cloacae ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-16)와 (b-16)의 조합, Pseudomonas putida ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-17)와 (b-17)의 조합, Morganella morganii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-18)와 (b-18)의 조합, Azotobacter vinelandii ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-19)와 (b-19)의 조합, Shewanella putrefaciens ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-20)와 (b-20)의 조합, Cupriavidus taiwanensis ubiC 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머(a-21)와 (b-21)의 조합으로 실시했다.

PCR 사이클:

변성 과정: 98℃ 10초

어닐링 과정: 50℃ 5초

확장 과정: 68℃

Pantoea ananatis ubiC 유전자 31초

Providencia rustigianii ubiC 유전자 31초

Providencia stuartii ubiC 유전자 32초

Providencia sneebia ubiC 유전자 32초

Providencia rettgeri ubiC 유전자 30초

Providencia alcalifaciens ubiC 유전자 30초

Providencia burhodogranariea ubiC 유전자 33초

Escherichia coli ubiC 유전자 30초

Escherichia fergusonii ubiC 유전자 40초

Pseudoalteromonas piscicida ubiC 유전자 33초

Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC 유전자 33초

Cronobacter sakazakii ubiC 유전자 32초

Citrobacter youngae ubiC 유전자 30초

Citrobacter koseri ubiC 유전자 30초

Enterobacter aerogenes ubiC 유전자 30초

Enterobacter cloacae ubiC 유전자 30초

Pseudomonas putida ubiC 유전자 33초

Morganella morganii ubiC 유전자 32초

Azotobacter vinelandii ubiC 유전자 33초

Shewanella putrefaciens ubiC 유전자 34초

Cupriavidus taiwanensis ubiC 유전자 40초

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 실시했다.

상기에서 생성한 반응액 10μl을 0.8% 아가로스겔에 의해 전기영동을 실시하여, Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia sneebia주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia rettgeri주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia alcalifaciens주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Providencia burhodogranariea주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Escherichia fergusonii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.7-kb, Pseudoalteromonas piscicida주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb, Pseudoalteromonas haloplanktis주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb, Citrobacter youngae주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Citrobacter koseri주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Enterobacter aerogenes주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Enterobacter cloacae주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Pseudomonas putida주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb, Morganella morganii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.5-kb, Azotobacter vinelandii주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb, Shewanella putrefaciens주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.6-kb, Cupriavidus taiwanensis주 유래의 ubiC 유전자의 경우 약 0.7-kb의 DNA단편을 검출할 수 있었다. 각 DNA단편은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up(다카라바이오주식회사제)에 의해 정제했다.

(3) 4- 히드록시벤조에이트 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 발현 플라스미드의 구축

상기 항 (2)에 나타낸 PCR에 따라 증폭한 Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia sneebia주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia rettgeri주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia alcalifaciens주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Providencia burhodogranariea주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Escherichia fergusonii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.7-kb DNA단편, Pseudoalteromonas piscicida주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.6-kb DNA단편, Pseudoalteromonas haloplanktis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.6-kb DNA단편, Citrobacter youngae주 유래의 ubiC 유전자를 포함 약 0.5-kb DNA단편, Citrobacter koseri주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Enterobacter aerogenes주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Enterobacter cloacae주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Pseudomonas putida주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.6-kb DNA단편, Morganella morganii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.5-kb DNA단편, Azotobacter vinelandii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.6-kb DNA단편, Shewanella putrefaciens주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.6-kb DNA단편, Cupriavidus taiwanensis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 약 0.7-kb DNA단편 10μl 및 PgapA 프로모터를 포함하는 클로닝 벡터 pCRB209[국제공개 WO2012/033112] 2μl를 각각 제한효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리함으로써 제한효소를 실활시킨 후, 양자를 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가제 10×완충액 1μl, T4 DNA 리가제(다카라바이오주식회사제) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수에서 10μl으로 하여, 15℃에서 3시간 반응시켜 결합시켰다. 이것을 라이게이션 A액, B액, C액, D액, E액, F액, G액, H액, I액, J액, K액, L액, M액, N액, O액, P액, Q액, R액, S액, T액 및 U액으로 했다.

얻어진 21종의 라이게이션 A액, B액, C액, D액, E액, F액, G액, H액, I액, J액, K액, L액, M액, N액, O액, P액, Q액, R액, S액, T액 및 U액 각각을, 염화칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 따라 에세리키아 콜라이 HST02를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

각각 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 따라 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 각각 절단하여, 삽입단편을 확인했다. 이 결과, 플라스미드 pCRB209 약 5.1-kb의 DNA단편 외에, Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 A액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 B액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 C액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia sneebia주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 D액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia rettgeri주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 E액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia alcalifaciens주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 F액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Providencia burhodogranariea주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 G액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 H액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Escherichia fergusonii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 I액)의 경우, 길이 약 0.7-kb 삽입단편이, Pseudoalteromonas piscicida주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 J액)의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이, Pseudoalteromonas haloplanktis주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 K액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 L액)의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이, Citrobacter youngae주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 M액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Citrobacter koseri주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 N액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Enterobacter aerogenes주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 O액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Enterobacter cloacae주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 P액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Pseudomonas putida주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 Q액)의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이, Morganella morganii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 R액)의 경우, 길이 약 0.5-kb 삽입단편이, Azotobacter vinelandii주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 S액)의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이, Shewanella putrefaciens주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 T액)의 경우, 길이 약 0.6-kb 삽입단편이, Cupriavidus taiwanensis주 유래의 ubiC 유전자(라이게이션 U액)의 경우, 길이 약 0.7-kb 삽입단편이 인정되었다.

Pantoea ananatis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA1, Providencia rustigianii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA2, Providencia stuartii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA3, Providencia sneebia주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA4, Providencia rettgeri주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA5, Providencia alcalifaciens주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA6, Providencia burhodogranariea주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA7, Escherichia coli주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA8, Escherichia fergusonii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA9, Pseudoalteromonas piscicida주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA10, Pseudoalteromonas haloplanktis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA11, Cronobacter sakazakii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA12, Citrobacter youngae주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA13, Citrobacter koseri주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA14, Enterobacter aerogenes주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA15, Enterobacter cloacae주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA16, Pseudomonas putida주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA17, Morganella morganii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA18, Azotobacter vinelandii주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA19, Shewanella putrefaciens주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA20, Cupriavidus taiwanensis주 유래의 ubiC 유전자를 포함하는 플라스미드를 pHBA21로 각각 명명했다(표 1).

[표 1]

(4) 4- 히드록시벤조에이트 생산 유전자( 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 유전자) 도입주의 구축

상기 플라스미드 pHBA1~pHBA21을 이용하여, 전기펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447 (1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185 (1993)]에 따라, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 형질 전환하여, 카나마이신 50μg/ml을 포함하는 A 한천배지에 도포했다.

이 배지상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출, 상기 플라스미드를 제한효소로 절단하여, 삽입 플라스미드를 확인했다. 이 결과, 상기에서 제작된 플라스미드 pHBA1~pHBA21의 도입이 인정되었다.

얻어진 주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HBA-1~HBA-21로 명명했다. 또한, 본 주의 유전자 재조합의 개요는, 표 2에 정리하여 나타냈다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HBA-2는, 일본 치바현 기사 라즈시 카즈사카마타리 2-5-8(우편번호 292-0818)의 독립행정법인 제품 평가 기술 기반기구 특허 미생물 기탁센터에 기탁했다(일본 내 기탁의 수탁일: 2014년 3월 27일, 부다페스트 조약에 의한 국제 기탁의 수탁일: 2015년 2월 23일, 수탁번호: NITE BP-01838). 이 주는, 37 CFR1.808에 규정된 조건하에서 공개적으로 이용 가능하다.

[표 2]

[실시예 2]

코리네박테리움 글루타미쿰 4- 히드록시벤조에이트 생성 유전자 도입주 유래의 코리스메이트 -피루베이트 리아제 활성 비교

실시예 1에서 제작한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주(표 1)를 참조하여, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치(置)했다.

상기 플레이트상에서 증식한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해] 10ml가 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃에서 15시간, 호기성으로 진탕배양했다.

이렇게 하여 배양 증식된 각각의 균체를, 원심 분리(4℃, 8,000rpm, 10분)에 의해 회수했다. 초음파 처리로 균체 세포를 파쇄한 후, 원심 분리(4℃, 15,000rpm, 20분)에 의해 얻은 세포 파쇄 상청을 조효소액으로 이용하고, 이하의 방법에 따라 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 측정했다.

조효소액, 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5mM chorismate Ba salt, 0.2mM NADH, 0.2M NaCl, 5 Unit lactate dehydrogenase를 혼합하고, 33℃에서 반응시켜, NADH에서 유래한 340nm의 흡광도 감소를 추적하여, 반응 초속도를 분석했다. 반응 초속도와 단백질 농도에서 비활성을 산출했다(1분당, 1마이크로몰의 4-HBA를 생산시키는 효소량을 1 unit으로 정의했다). (또한, 반응액을 필터여과 후, 발생한 4-HBA는 HPLC에 의해 4-HBA의 피크를 직접 검출하여(Cosmosil C18 ARII (Nacalai Tesque), 이동상(移動相) 20% 메탄올, 0.07% 과염소산), 양 검정법에 의한 정량성이 차이가 없음을 별도로 확인했다.)

이 결과, HBA1~HBA21주에 대해서, 표 3과 같이 목적으로 하는 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성이 검출되었다. 특히 높은 활성을 나타낸 것은, Pantoea ananatis 유래의 ubiC 유전자와, Cronobacter sakazakii 유래의 ubiC 유전자였다.

그 외에, Providencia rustigianii, Providencia stuartii, Providencia sneebia, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia burhodogranariea, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Pseudoalteromonas piscicida, Pseudoalteromonas haloplanktis, Cronobacter sakazakii, Citrobacter youngae, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida, Morganella morganii, Azotobacter vinelandii, Shewanella putrefaciens, Cupriavidus taiwanensis 유래의 4-히드록시벤조에이트 생성 유전자에 대해서도 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성이 검출되었다. 여기에서, 동일한 실험을 Corynebacterium glutamicum 야생주(빈 벡터만을 갖는)에 대해 실시한 결과, 4-HBA 생성은 인정되지 않았다.

[표 3]

[실시예 3]

코리네박테리움 글루타미쿰 4- HBA 생성 유전자 도입주 유래의 코리스메이트 - 피루베이트 리아제 활성에 대한 생성물 저해의 IC ₅₀ 비교

실시예 2에서 제조한 HBA-1~HBA-21주 유래의 세포 파쇄 상청을 이용하여, 생성물인 4-HBA에 의한 저해를 검토했다.

그 결과, Providencia속에 속하는 Providencia rustigianii, Providencia stuartii, Providencia sneebia, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia burhodogranariea 유래의 코리스메이트-피루베이트 리아제가 다른 속 유래의 것과 비교하여, 특히 4-HBA에 대해 낮은 저해성이었다(표 4).

[표 4]

[실시예 4]

코리네박테리움 글루타미쿰 4- 히드록시벤조에이트 생성 유전자 도입주의 글루코스로부터의 4- 히드록시벤조에이트 생성 실험

실시예 1에서 제조한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주(표 1)를 참조하여, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄ㆍ7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄ㆍ2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트상에서 증식한 Corynebacterium glutamicum/4-HBA 생산 유전자 도입주를 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄ㆍ7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄ㆍ2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해] 10ml에, 2% 탄산칼슘이 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃에서 24시간 호기성으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식하여 얻어진 배양액을 원심 분리(4℃, 15,000rpm, 10분)하고, 얻어진 상청액을 이용하여 4-HBA를 HPLC에 의해 정량했다.

그 결과, Corynebacterium glutamicum HBA-1, HBA-2, HBA-3, HBA-8 및 HBA-12주는, 표 5에 나타낸 바와 같이 목적으로 하는 4-HBA를 생성했다. 그 중에서도, Providencia rustigianii, Providencia stuartii, 또는 Cronobacter sakazakii 유래의 4-HBA 생성 효소 유전자 도입주에 의한 4-HBA 생성 능력은, E. coli, 또는 Pantoea ananatis 유래의 4-HBA 생성 효소 유전자 도입주보다도 높고, 우수했다. 가장 4-HBA 생성 능력이 우수한 것은, Providencia rustigianii 유래의 4-HBA 생성 효소 유전자 도입주였다. 또한, 동일한 실험을 Corynebacterium glutamicum 야생주(빈 벡터만을 갖는 컨트롤)에 대해 실시했을 때, 4-HBA 생성은 인정되지 않았다.

[표 5]

[실시예 5]

4- HBA 생산 숙주로서의 적성 시험(4- HBA에 의한 호기성 증식에 미치는 영향)

Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Pseudomonas putida, 및 Rhodobacter sphaeroides에 대해서, 호기성 배양에 있어서의 4-HBA의 증식 저해 실험을 실시했다. 또한, 본 시험에 이용된 Pseudomonas putida S12은, 용매 내성균으로서 보고되어 있고, 지금까지 티로신을 통해 4-HBA의 생산이 보고되어 있다.

Corynebacterium glutamicum을 A 한천배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe2SO47H2O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁]에 도포하고, 33℃, 15시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트상에서 증식한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 A 액체배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄7H₂O+0.042%(w/v) MnSO₄2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해] 10ml가 들어있는 시험관에 한 백금이로 식균하고, 33℃에서 15시간 호기성으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를, A 액체배지 10ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 4-HBA가 최종 농도 0, 100, 200, 250, 300mM이 되도록 첨가하고, 33℃에서 호기성으로 진탕배양을 실시했다. 균체의 증식은, OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 실시했다.

Escherichia coli JM109를 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨 및 1.5% 한천]에 도포하고, 37℃, 15시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트에서 증식한 Escherichia coli JM109를 LB 액체배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 0.5% 염화나트륨]에 도포하고, 37℃, 13시간 호기적으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식한 Escherichia coli JM109를 LB 액체배지 100ml에 초기 균체 농도 OD=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 4-HBA 농도가 최종 농도 0, 100, 200mM이 되도록 첨가하고, 37℃에서 호기적으로 진탕배양을 실시했다. 균체의 증식은, OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 실시했다.

Pseudomonas putida S12를 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 30℃, 15시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트에서 증식한 Pseudomonas putida S12를 LB 액체배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 0.5% 염화나트륨]에 도포하고, 30℃, 13시간 호기적으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식한 Pseudomonas putida S12를 LB 액체배지 100ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 4-HBA 농도가 최종 농도 0, 100, 200, 300mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 호기적으로 진탕배양을 실시했다. 균체의 증식은, OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 실시했다.

Rhodobacter sphaeroides를 LB 한천배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 30℃, 20시간 어두운 곳에 정치했다.

상기 플레이트에서 증식한 Rhodobacter sphaeroides를 LB 액체배지[1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 및 0.5% 염화나트륨]에 도포하고, 30℃, 13시간 호기적으로 진탕배양을 실시했다.

상기 조건에서 증식한 Rhodobacter sphaeroides를 LB 액체배지 100ml에 초기 균체 농도 OD=0.1이 되도록 식균하고, 동시에 4-HBA 농도가 최종 농도 0, 100, 200mM이 되도록 첨가하고, 30℃에서 호기적으로 진탕배양을 실시했다. 균체의 증식은, OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 실시했다.

배지중에의 4-HBA 첨가에 의한 호기성 증식에 미치는 영향의 분석 결과를 도 1에 도시한다.

Escherichia coli는, 100mM 4-HBA 존재하에서 현저하게 증식 저해를 받고, 200mM 4-HBA에서는 완전히 증식이 저해되었다.

Pseudomonas putida S12(용매 내성으로서 보고되어 있는 주)는, 200mM 4-HBA에서는 완전히 증식이 저해됐다.

Rhodobacter sphaeroides는, 100mM 4-HBA에서는 완전히 증식이 저해됐다.

이에 대해, Corynebacterium glutamicum은, Escherichia coli, Pseudomonas putida S12, 및 Rhodobacter sphaeroides의 증식이 완전히 저해된 200mM의 4-HBA 존재하에서도 증식이 가능했다. 또한, Corynebacterium glutamicum은 250mM의 4-HBA 존재하에서도 증식이 가능하며, 여기에는 나타나지 않으나 배양 개시 후 28시간에는 200mM의 4-HBA 존재하에서의 증식과 동등(야생주 OD₆₁₀의 약 65%)까지 증식했다.

이와 같이, Corynebacterium glutamicum은, Escherichia coli, Pseudomonas putida S12, 및 Rhodobacter sphaeroides와 비교하여, 4-HBA에 대해 높은 내성을 가지며, 4-HBA 생산의 숙주로서 높은 적합성을 갖는 것이 나타났다.

본 발명의 방법에 의하면, 미생물을 이용하여 실용적인 효율로 글루코스 등으로 4-HBA를 제조할 수 있다.

<110> Green Phenol Technology Research Association <120> CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT AND METHOD FOR PRODUCING 4-HYDROXYBENZOIC ACID OR SALT THEREOF USED IN SAME <130> P16-4126 <150> JP 2014079504 <151> 2014-04-08 <160> 63 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 513 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <400> 1 atgacgcaag acccgctccg ttcgttacgt tcacttaact ggctggcgct ggacgatgcc 60 gcattgacgc aaccgcttcg tgactggcta atggaagagg attccatgac gcgacgcttt 120 gaacagcatt gccagaaggt cagggtggaa cctgtacgtg aggactttat ctccgccgat 180 gaactcggcg atgaaggggc attactccct gccgatcagc gtttctggct gcgagaagtc 240 attctctacg gggatgagga accttggctg gcagggcgca cgctggtgcc agaaagtacc 300 ctcaacggcc cggaagcgat gttacagcaa ctcggtacgc gcccgctggg gcgttatctg 360 ttctcgtcat caacgctgac ccgcgatttc attgagcctg gccgcgttga tgcgctctgg 420 ggacgccgct cgcgcctgcg actgtcaggg aaaccgctgc tgttaacgga actgttttta 480 ccggcttcgc cgctctatcg tgatcaaggt taa 513 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Providencia rustigianii <400> 2 atgcatgaaa caatttttac ccatcatccc attgattggc taaacgagga tgatgagtca 60 gttcctaaca gtgtactaga ttggctgcaa gagcgtggtt caatgactaa acggttcgag 120 cagcattgcc aaaaagtcac ggtaattccc tatttagagc gctatatcac tccagagatg 180 ctgagcgctg atgaagccga gcgtttaccc gaaagtcaac gttactggtt gcgagaagtc 240 attatgtatg gggataatat tccgtggttg ataggcagaa cattgatccc tgaagagacc 300 ctcaccaacg atgataaaaa gctggtggac attggtcgtg tgccattagg gcgttacctt 360 tttagtcatg atagtcttac ccgagattat attgatattg gcaccagtgc ggatcgttgg 420 gtgcgacgtt ctctgctgag attatctcaa aagcccttat tattaactga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatag ataactatct aacataatc 519 <210> 3 <211> 537 <212> DNA <213> Providencia stuartii <400> 3 atggatgaaa cgctttttat ctctcacccg ataacatggc tatcagaaga tgatgacctt 60 gttcctgaaa atgttttaga ttggctacat gaactagggt cgatgacaaa acgcttagag 120 cagcattgcc aacgtgtcac ggttgttcct tatacgcaac gttatgtgac tcaagaggca 180 ttgagcgaag aagaagcggc gtgtttacct gtcagtgaat attattggtt acgtgaagtc 240 attatgtatg gtgataatat tccatggtta cttggacgaa cgttaattcc acaggagaca 300 ttgactggtg aagaccggaa acttattgat atcggtgctg taccgttagg gcgttatctc 360 tttagccatg ataatctttc ccgtgattat attcatatag ggcagcaaaa tttgcgatgg 420 atccgccgct ctctattaag attatctgaa aaacctttat tattaaccga actgttttta 480 cctgaatcac ctgcatataa aagataaaaa ataaaaggag cacaacaaat ggaggga 537 <210> 4 <211> 539 <212> DNA <213> Providencia sneebia <400> 4 atggatgata cgctttttac ctctcacccg ataacatggt tatcagagac tgataatgtt 60 attcctgaaa atatgttaag ttggttacaa gaactcgggt caatgacaaa gcgcttagaa 120 caatattgcc agtctttgac tgtcacccct tatgtgcaaa aatatgtttc cagaaacatg 180 ctgagtgatg atgaagctca atgtttacct gaaagctcaa gttattggct aagagaagtg 240 attatctatg gggataatat cccttggttg ctagggcgaa cgctaattcc gcaagaaaca 300 ttgagtggcg atgaccaaag aattgtcgat attggtacgc tgcctttagg ccgttatcta 360 tttagtcatg ataatctgac tcgtgattat attcatattg ggcaacagga gcagcgatgg 420 ctgcgtcgtt cgcgattaag gctatcgaat aatcctttat tattaactga attgttttta 480 cctgaatcac ctgcatataa aagataaaaa ataaaaggag catgacaagt gaagggaag 539 <210> 5 <211> 504 <212> DNA <213> Providencia rettgeri <400> 5 atggatgaaa cgctttttac ttctcagccg attcactggc tggcggagaa cgataaaata 60 gtgcctgcca atgtattaga ttggctatta gagctcggct ccatgacaaa acgttttgag 120 cagcatagcc agcaagttac cgtgatacct tatttagagc gctatataac acaagataag 180 ctgagtgcag atgaaatgct gtctttacct gaaagccaac gttattgggt cagagaagtt 240 gtcatgtatg gagatggtat cccttggtta ctgggccgaa cgataatccc tgaagaaaca 300 ctgactgatg atgaccagca actggtagat attgggagaa tgccgttagg gcgttattta 360 tttagccgtg acagcttaac tcgagattat attcatattg gttcttgcgc aaaccgttgg 420 gtacgttgtt ctcggttaag attatcggat aaacccttac tattaacaga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatcg ttaa 504 <210> 6 <211> 505 <212> DNA <213> Providencia alcalifaciens <400> 6 atgcatgaaa cgatttttac ctctcatcct ataagttggt tcgtagaagg cgaagagagt 60 gttcctgaaa atgtattagg ttggttgcaa gagcaaaggt cgatgaccaa acggtttgag 120 cagcattgtc agaaagtgac ggtgatacct tatttagaac gctatatctc actggatatg 180 ctcaccaccg acgaacaaaa atgcttacca attagtgagc gttattggct acgggaagtg 240 attatgtatg gggataatat cccttggttg attggcagaa cgctgatccc agaagagacg 300 ctcaccgata atgacaaaaa attagtcgag cttgggcgag tcccattagg gcgctatctc 360 tttagtcatg aacacctaac ccgagattat attgaaatgg gcaccagtgc tgaccgctgg 420 gttcgccgtt ccttacttag actgtcccaa aaaccattat tattaaccga aatattttta 480 cctgaatcac ctgcatatag ataac 505 <210> 7 <211> 542 <212> DNA <213> Providencia burhodogranariea <400> 7 atggatgaaa cgctttttac ctctcacccg ataacgtggc taccagaggc cgatgacctt 60 gttcctgata atattttaga ctggttgcat gagcttgggt caatgacaaa acgtttagag 120 cagcactgcc agtgtgttac cgttatccct tgtgcgcagc gatatgtgac taaagaagct 180 ctcagtgatg atgaaactca atgtttaccg gtgagtgagt actattggtt acgggaggtt 240 attatgtatg gtgataatat tccctggtta ctcggccgaa cactaattcc gcaagaaaca 300 ttgaccggtg aagaccaaaa gctcattgat attggtgctg taccattagg gcgttatcta 360 tttagtcatg ataatcttac ccgggattat attcatatag ggcagcaaaa ttctcgatgg 420 ctccgtcgct ctcgattaag gttatcaaac aaaccgttat tattaactga attattttta 480 cctgaatcac ctgcttataa aagataaaaa gtaaaaggag cacgacaagt ggagggaagt 540 at 542 <210> 8 <211> 498 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc 60 ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa 120 cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa 180 atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg 240 ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta 300 agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc 360 acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg 420 cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg 480 gcgtcaccgt tgtactaa 498 <210> 9 <211> 663 <212> DNA <213> Escherichia fergusonii <400> 9 atgctgattt tgcaacaact ggtgcgtctt ctggcgcacc tttttttatc attttttgcg 60 attgttgcgt ttttgttgcg caatagatca cttaattttg tttccttctc ccgtaatctc 120 ttttctgcga tacaatgcct tcacgttata gaacggagag ttcgcatgtc acatcccgcg 180 ttaacgcaac tgcgtgcgct gcgctatttt gctgagattc cggcgcttga tcccgcacaa 240 ctcgactggt tattactgga 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gactatccgg cgctgattga acttattgca 420 cccacaactg gcgtcgcccc agagcgttta tttgctagaa gaagctggtt taaaaacggc 480 aaagcaaaga ttttagtttg tgaagtcttt atatcggaaa gcttttatga ttgaccacca 540 gaaatggcag gctt 554 <210> 11 <211> 546 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas haloplanktis <400> 11 atgattactt tccctgtttc attatctgct gattggcaga gtaccgctca agtaactggc 60 ttatctaacg ctgagaaaga gtggttattt gaaccgcatt ctttaacggc taaattaaaa 120 agtcagtctc agcgttttgc tgtaaaagtg ttgagtgagc aaaaagtaga cctttcgcaa 180 tcacagcaaa cgctattaag tgagcaggta agtacagtac ttaaccgtga agtgttactg 240 ttgtgtgatg aacaaccgat tgtttatgct caaagttggt tgccagtaac aagcaataat 300 acaaacaatc agctgcacaa tatgggagaa cgcccgttag gtgatgttat ctttcaagat 360 cctgcgttaa ggcgcactga tattgaaatt gctcgctttg atgataatca cccattgcaa 420 tcactggtga gcgaacttaa tttaccgaat cgctctttac tgggcagacg cagcgtattt 480 tctttacata actacaaatt tttagtttgt gaagtttttt taccaggagc gtatttgtac 540 tcatga 546 <210> 12 <211> 534 <212> DNA <213> Cronobacter sakazakii <400> 12 atgtcccatc ccgcgctgag acaactgcgc gcgttgtcct tttttgacga tatcagcacg 60 cttgatagtt cgctgctcga ctggctgatg ctggaagatt ccatgacccg ccgtttcgaa 120 ggcttttgcg agcgcgtgac ggtcgacatg ctgtttgagg gctttgtcgg ccccgaggcg 180 ctggaggaag agggcgagtt tttgcctgat gagccgcgct actggctgcg cgaaatcctg 240 ctgtgcggcg acggcgtgcc gtggctggtt gggcgcacgc tggtgccgga gtctacactt 300 tgtgggccgg agctggcgtt gcagcagctc ggtaccacgc cgctgggccg ttatctgttt 360 acctcatcca ccctcacgcg tgattttatc cagccgggcc gcagcgacga actctgggga 420 cgccgctctc tgctgaggct ttccggcaaa ccgctgctgc tgactgaact gtttttacct 480 gcatcaccct tgtacggaga ggaaaaataa tggagtggag cctgacgcag aata 534 <210> 13 <211> 498 <212> DNA <213> Citrobacter youngae <400> 13 atgccacacc ctgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgtt attttgatga gatcccggcg 60 ctggacccgc agctgctcga ctggttgtta ctggaagatt cgatgaccaa acgttttgag 120 cagcagggaa aacaagtcac cgttacgttg attcgcgaag cgttcgttgg gcaaaatgag 180 gtggctgaag aactgatgct gctgcctaaa gaatcccgct actggttacg cgaaatcctg 240 ttatgcgcgg atggtgagcc ctggcttgcc gggcgtaccg tggtgcctga atcaaccctg 300 tgcggccctg aactggcctt acaaaatctg gggaaaaccc cgctcggacg ctacctgttt 360 acgtcatcga cattgacccg agattttatt gagattggcc gcgatgcagc gctgtggggg 420 cgacgttccc gcctgcggct gagcggtaag ccattgatgc ttaccgagct ttttctacct 480 gcatcgccgt tgtactga 498 <210> 14 <211> 498 <212> DNA <213> Citrobacter koseri <400> 14 atgtcacacc ctgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attttaaaga gattcctgcg 60 ctggattccc ggttgctcga ctggttactt ctggaagatt ccatgaccaa acgttttgag 120 caagaaggga aacgggtaag cgtgacattg cttcgggaag cgtttgttgg tccacatgaa 180 gtggctgaag aggtggcgct gctaccggtc gaatcccgct actggttacg tgaaattttg 240 ttatgtgcag acggcgaacc ctggcttgcc gggcgtaccg tcgtgcctga atcaacgttg 300 tgcggccctg agctggcctt acaaaatctg ggaaaaacgc cgttagggcg ctacctgttt 360 acatcatcaa cgttgacccg agattttatt gagattggtc gtgatgccgc actgtggggg 420 cgtcgttccc gcctgcgtct gagcggtaag ccgctgatgc ttaccgagct gtttttgccc 480 gcatcaccgt tgtattaa 498 <210> 15 <211> 498 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 15 atgccacatc ctgcgcttac gcaactgcgt gcgctgcgct attttgccgc catacccgag 60 ctggacgcgc cgctgcgcga ctggctgttg ctggaagact caatgaccaa acgctttgag 120 caacaaggga aaaaggtcac cgtgaccatg attaacgaag gtttcgtcgg gcgcgacgcg 180 ctggcgggcg aagaagccct gctgccggaa gaggcgcggt attggctgcg ggagatcatt 240 ctttgcgccg atggcgaacc ctggcttgcc ggtcgtactc tcgtgccgga atcgacgcta 300 tgcggcccgg aattagccct gcagcagttg gggcagacgc cgctgggccg gtatctgttt 360 acgtcgtcga cgttaacccg tgattttatt gagattggcc gtagtgcaca gctgtggggg 420 cgacgttccc gtctccggct gagcggcaaa ccgctgctgc tgacagagct ttttctgcct 480 gcatcgccat tgtattaa 498 <210> 16 <211> 498 <212> DNA <213> Enterobacter cloacae <400> 16 atgtcacacc ctgcgctaac gcaactgcgt tcgctgcgct atttcgacca aatacctgcg 60 cttgacccgc agcagcttga ctggttgctg ctggaagatt ccatgactaa acgttttgag 120 caacagggca agacggttac ggtgacgatg attcaggaag ggtttgtcac ctccgctgac 180 attgccagtg agctgccgct gttaccaaaa gaagaacgct actggttgcg tgaaattctg 240 ctctgcgcgg atggtgagcc gtggctcgcc ggacgaaccg tggtgcctga atccaccctt 300 tccgggcctg agctggcact gcaacggctg ggaaacaccc cgctcgggcg gtaccttttc 360 acctcgtctg aacttacccg ggattttatt gaaattggac gcgatgccga actgtgggga 420 cgtcgttccc gtcttcgcct gagcggtaaa ccgttaatac tgacggagct ttttttaccg 480 gcatcgccgt tgtactga 498 <210> 17 <211> 558 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 17 atgtcgtacg aatccccgca agcagccgct gtcgcgtggc tgccgtattc acagctggcg 60 accgacatcg accagcccac ccttgactgg ctgttcgacg agggctcgct gacccgccgc 120 ctgacccgtc tgtccattga tcacttttcc gtcaccccgt tgttcgaggg ctggcagccg 180 ctgcgcgatg acgaatgcca ggcgctgggc atcgctgccg gcgccgaagg ctgggtgcgc 240 gaagtgtatc tgcgcggcca tggccaacct tgggtattcg cccgcagcgt ggccagccgc 300 agcgccctgg aacgtggtgg cctggacctg gaaaccttgg gcagccgctc gctgggcgag 360 ctgctgttct gcgaccaggc gttcatccgt catccactcg aagtgtgcac ttatccacag 420 gcctggctgc cgtccgaagc tgcacatgcg gcgctttggg gccgccgctc gcgcttcgag 480 cgcaacggcc tggacctgct ggtggcagaa gtgttcctgc cggcattgtg gcaagcggcc 540 aaggaggaaa accgctga 558 <210> 18 <211> 529 <212> DNA <213> Morganella morganii <400> 18 atgacacaaa cagtgataac accccccatc cgctggtttg ataatgcgga aatgatcccc 60 gccggggtgc tggactggtt atcagaatta gggtcaatga cgcggcgctt tgaacagcac 120 tgcaatgaag tgacggtaaa accgtattgt gaaaaatata tctcccgtga agcgctgact 180 gaagaagagc agatgcatct gcccggcagt gcacgctact ggttacggga ggtggtgtta 240 tatggtgacg gggttccctg gctgaccggc cggacagtgg taccggagga gacgctgaca 300 ggggaagagc agcagttact gaaaatggga aatgtgccgc tcgggcgcta tctctttacc 360 agcggttgtc tgacgcggga ttatatccgc ttcgggctgt cagaaacgca ctgggcgcgc 420 tgttcgcggc tgtgcctggc cggtaaaccg cttctgctga ctgaagtttt tctgccggcc 480 tctccggcat accccgcata agtgaatatc tcggagaaga ataacgtgg 529 <210> 19 <211> 552 <212> DNA <213> Azotobacter vinelandii <400> 19 atgaccgctg ctcccgcttt ccaatggctc ggcgccgacc aactgcatcc cgcccccccg 60 gccgtcctgg ccgactggct gttcgacagc ggctcgctga cccgccggct gaccgccctt 120 tccgccggcc gtttcgccgt gacgccgctg gccgaaggct ggcaggtgct gcgcgacgac 180 gaatgcaccg ccctcgacgt ggtgccgggc agcaccggct gggtacgcga ggtctacctg 240 ctcggcgccg agcggccctg ggtgttcgcc cgcagcgtgg cggcccgcga ggctctggcg 300 ggtttctccg gcgtactcgc cgaactcggc cggcggcccc tcggcgaact gctgttcagc 360 gacccagcct tcgcccgcgg cccgctgcag gccacgcact atccgccgga ctggctgccg 420 gccgggatac gctgccccgg actctgggga cggcgctccc gtttccaccg ggaaaccctg 480 agcgtgctgg tggcggaagt cttcctgccg gagctctggc gctaccaggg aatcgacccg 540 gacaccctat aa 552 <210> 20 <211> 561 <212> DNA <213> Shewanella putrefaciens <400> 20 atgaatgtga ctagcttaag cttcccctat ggtgaatcta ttcaatggtt ttgtgctgat 60 cgtaccgata aacttccccc gtcaccgcta aaagagtggt tactcgcccc aggcagcctg 120 acaaaaaaac tcaaaacctg ctgcaatcag tttgaagtca aagtcctcgg tgaaggccaa 180 ctcgccccct tcaaagatga atatcctcag caaggctctg tttgggttcg tgaagtattg 240 ctatgccttg ataatgttcc ttgggtgttt gccagaacct taatcccact ctctttgctg 300 tctgaacgag aagcggattt tctcggtttg ggttctcgtc cccttggcga attactcttt 360 agccaagata actttatccc cggcagaata gaagtcgcca gctttgatac aggtagtcgt 420 cttgcacact tagctgcaag tttagatcaa agggttgaac atctcctgtg gggacgccgt 480 cgctattttc accacggcca ggatgagatg atcgtcagtg aaatattttt acctgcggcc 540 gagcgagcaa tttgccagtg a 561 <210> 21 <211> 671 <212> DNA <213> Cupriavidus taiwanensis <400> 21 atgagcgcgc agtccgtgcg cggctgcggc tggagcccgc acctggcttt cgatgcggcg 60 atcccgccca acctgcggcg ctgggttacc ggcgatgacg gctcgctgac ggcgcggctg 120 gtggccgcct ccgcgcgctt tcgcgtggcg cggctgctgc aggcgccgca gcgcccgttt 180 gccgacgaat ggcaggcgct gggccagccc gaccgcaccc ccgcgctgac gcgcgaggtg 240 ctgctgatct gcgacgacat ccccgccgtg ttcgcccata ccgtggtgcg gctgcgccat 300 gcgcgccgcg actggccgtt cctgcgcggg ctgggcgaac gcccgctggg cgggcgcctg 360 ttcgtcgatc cggcggtgcg gcgcgagccg ttccagtttg cgcggctgct gccgcaccat 420 ccgctgcgcc aggccctgca ccgcgtgctg ccggccatgg cggcagtgcc gatgctgacc 480 gcgcggcgtt cggtgttccg gcgcggcggc ggcgtcatgc tcgtgacaga agtgttcctg 540 ccagacctgc tgtcgcggcc atccccgggg accgaggcgg taccgcatcc caaatatatg 600 cggacgacag accgaagccc tgtttcgaca cacactaccg aaaccaagaa agagaccacg 660 agatgaaact g 671 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ctctcatatg acgcaagacc cgct 24 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 ctctcatatg ttaaccttga tcacgataga gcg 33 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ctctcatatg catgaaacaa tttttaccca tcatcc 36 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 ctctcatatg gattatgtta gatagttatc tatatgcagg tg 42 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 ctctcatatg gatgaaacgc tttttatctc tcac 34 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ctctcatatg tccctccatt tgttgtgctc 30 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ctctcatatg gatgatacgc tttttacctc tc 32 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 29 ctctcatatg cttcccttca cttgtcatgc 30 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 ctctcatatg gatgaaacgc tttttacttc tcag 34 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 ctctcatatg ttaacgatat gcaggtgatt cagg 34 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 ctctcatatg catgaaacga tttttacctc tcatc 35 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 ctctcatatg gttatctata tgcaggtgat tcagg 35 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 ctctcatatg gatgaaacgc tttttacctc tc 32 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 35 ctctcatatg atacttccct ccacttgtcg 30 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 36 ctctcatatg tcacaccccg cgttaa 26 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 37 ctctcatatg ttagtacaac ggtgacgcc 29 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 38 ctctcatatg ctgattttgc aacaactggt g 31 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 ctctcatatg ttagtacaac ggtgatgcag g 31 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 ctctcatatg cctttgcaat tacccttaga g 31 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 41 ctctcatatg aagcctgcca tttctggtgg 30 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 42 ctctcatatg attactttcc ctgtttcatt atctgc 36 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 43 ctctcatatg tcatgagtac aaatacgctc ctg 33 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 44 ctctcatatg tcccatcccg cgctgag 27 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 ctctcatatg tattctgcgt caggctccac 30 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 ctctcatatg ccacaccctg cgttaa 26 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 47 ctctcatatg tcagtacaac ggcgatgca 29 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 ctctcatatg tcacaccctg cgttaac 27 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 ctctcatatg ttaatacaac ggtgatgcgg g 31 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 50 ctctcatatg ccacatcctg cgcttac 27 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 51 ctctcatatg ttaatacaat ggcgatgcag gc 32 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 52 ctctcatatg tcacaccctg cgctaa 26 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 53 ctctcatatg tcagtacaac ggcgatgc 28 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 54 ctctcatatg tcgtacgaat ccccg 25 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 55 ctctcatatg tcagcggttt tcctccttg 29 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 56 ctctcatatg acacaaacag tgataacacc c 31 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 57 ctctcatatg ccacgttatt cttctccgag 30 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 58 ctctcatatg accgctgctc ccg 23 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 59 ctctcatatg ttatagggtg tccgggtc 28 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 60 ctctcatatg aatgtgacta gcttaagctt cc 32 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 61 ctctcatatg tcactggcaa attgctcgc 29 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 62 ctctcatatg agcgcgcagt ccgtg 25 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 63 ctctcatatg cagtttcatc tcgtggtctc 30

Claims (10)

1. 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 숙주인 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입되고, 4-히드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자는 도입되지 않은, 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 생산 능력을 갖는 형질 전환체로,
   상기 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 판토에아(Pantoea)속, 프로비덴시아(Providencia)속, 에세리키아(Escherichia)속, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)속, 크로노박터(Cronobacter)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 모루가넬라(Morganella)속, 아조토박터(Azotobacter)속, 쉬와넬라(Shewanella)속, 또는 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속 유래의 유전자인, 형질전환체.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 프로비덴시아 러스티 지아니이(Providencia rustigianii), 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii), 프로비덴시아 스니비아(Providencia sneebia), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 버호도그라나리에아 (Providencia burhodogranariea), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 에세리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 슈도알테로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 시트로박터 얀가에(Citrobacter youngae), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens), 또는 쿠프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis) 유래의 유전자인, 형질 전환체.
4. 청구항 1에 있어서, 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가, 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA인, 형질 전환체:
   (a) 서열번호 1~21 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 DNA; 및
   (b) (a) 중 어느 하나의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이징하거나, 또는 (a) 중 어느 하나의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로 이루어진 DNA이며, 또한 코리스메이트-피루베이트 리아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
5. 삭제
6. 삭제
7. 청구항 1에 있어서, 숙주인 코리네박테리움 글루타미쿰이 코리네박테리움 R(FERM BP-18976) ATCC13032 또는 ATCC13869인, 형질 전환체.
8. 코리네박테리움 글루타미쿰 HBA-2(수탁번호: NITE BP-01838) 형질 전환체.
9. 청구항 1, 3, 4, 7 및 8 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를, 당류, 형질 전환체가 대사에 의해 코리스미산을 생성할 수 있는 화합물, 및 코리스미산, 및 그들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 원료 화합물을 포함하는 반응액 중에서 배양하는 공정과, 반응액 중 4-히드록시벤조산 또는 그 염을 회수하는 공정을 포함하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 호기성, 또는 형질 전환체가 증식하지 않는 조건하에서 형질 전환체를 배양하는, 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법.

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