CN103228784B - 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4‑羟基苯甲酸脱羧酶(4‑hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到。一种苯酚的制造方法，其中，包括使该转化体在还原条件下、在含有4‑羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤。

Description

棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
技术领域
本发明涉及苯酚生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予苯酚生产功能而实施了特定基因操作的谷氨酸棒杆菌的转化体及使用该转化体的高效的苯酚的制造技术。
背景技术
在全球变暖和化石资源枯竭问题的背景下，已经认识到以可再生资源为原料的化学品制造与生物燃料制造并列地作为新产业生物炼制而成为实现低碳社会的重要策略，并聚焦了广泛的关注。
但是，对于以可再生资源为原料的生物苯酚生产而言，与乳酸、乙醇的生产相比，从作为原料的糖类开始的代谢反应阶段非常多，因此生产率低，并且作为产物的苯酚会使细菌的增殖受到抑制或者存在由苯酚产生的细胞毒性等，基于上述理由，目前还不能进行工业性的生产。
作为苯酚的重要用途，可以列举酚醛树脂。酚醛树脂是由苯酚与醛类的加成缩合反应生成且在塑料中具有最古老历史的树脂，由于其优良的耐热性、耐久性等优点，目前仍被用于汽车用金属替代材料、半导体密封材料、电路基板等各种用途。另外，对于迄今为止的酚醛树脂而言，由于原料苯酚与醛类的反应性极高，所得到的高分子形成复杂的三维网状结构，因此，难以实现聚合物的精密结构设计和在纳米材料中的发展，从而认为难以应用于高附加价值的用途。但是近年来，随着高分子的物性理论和仿真技术的快速发展，只要使网状结构精密化则能够由酚醛树脂创制高功能性材料。在这样的背景下，日本的酚醛树脂生产量正在逐年增加。
目前的苯酚的工业生产法(异丙苯法)是以石油来源的苯和丙烯作为原料、需要大量的溶剂类和大量的热能的、典型的化学工业的高能耗型工艺。因此，从保护地球环境和减少温室效应气体的观点出发，当务之急是开发二氧化碳排放少的节能型的、能够由可再生资源制造的、废弃物排放低的环境和谐型工艺，即建立生物苯酚制造技术。
迄今为止尚未报道过自然界中的苯酚生产菌。
就利用基因重组菌的苯酚生产技术而言，非专利文献1公开了使用羟基苯甲酸梭菌(Clostridium hydroxybenzoicum)的细胞悬浊液或细胞提取液，用50小时将2mM的4-羟基苯甲酸酯/盐完全转变成苯酚的技术。
另外，专利文献1公开了使用导入有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的转化菌由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚的技术。
但是，非专利文献1和专利文献1的方法在实用中不能高效地制造苯酚。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-050914号
非专利文献
非专利文献1：International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology,Vol.52,2002,801-807.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的微生物、以及能够以4-羟基苯甲酸酯/盐为原料高效地制造苯酚的方法。
用于解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人反复进行了研究，得到下述发现。
(i)在谷氨酸棒杆菌中导入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因而得到的转化体能够高效地由4-羟基苯甲酸酯/盐生产苯酚。
(ii)该转化体中，存在于宿主谷氨酸棒杆菌的染色体上的苯酚2-单加氧酶基因被破坏或发生缺陷时，能够更高效地生产苯酚。
(iii)该转化体在还原条件下的反应液中实质上不增殖的状态下进行反应时，苯酚生产效率特别高。
本发明是基于上述发现而完成的，其提供下述转化体及苯酚的制造方法。
第1项.一种具有苯酚生产能力的转化体，其通过将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶(4-hydroxybenzoate decarboxylase)活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到。
第2项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)来源的基因。
第3项.如第1项所述的转化体，其中，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因为下述(a)或(b)的DNA，
(a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA；
(b)在严格的条件下与由(a)中任一个碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。
第4项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶(phenol 2-monooxygenase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第5项.如第1项～第4项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶(4-hydroxybenzoate hydroxylase)活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第6项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869。
第7项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第8项.如第1项～第3项中任一项所述的转化体，其中，宿主谷氨酸棒杆菌为存在于谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869的染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
第9项.谷氨酸棒杆菌PHE21(保藏编号：NITE BP-996)、PHE21-2、PHE21-3、PHE21-4、PHE21-5、PHE21-6、PHE21-7、PHE21-8、PHE21-9、PHE21-10、PHE21-11、PHE21-12、PHE22-1、PHE22-2、PHE22-3、PHE22-4、PHE22-5、PHE22-6、PHE22-7、PHE22-8、PHE22-9、PHE22-10、PHE22-11、PHE22-12、PHE23-1、PHE23-2、PHE23-3、PHE23-4、PHE23-5、PHE23-6、PHE23-7、PHE23-8、PHE23-9、PHE23-10、PHE23-11或PHE23-12的转化体。
第10项.一种苯酚的制造方法，其中，包括：
使第1项～第9项中任一项所述的转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和
回收反应液中的苯酚的步骤。
第11项.如第10项所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。
第12项.如第10项或第11项所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。
发明效果
通过使用本发明的转化体，能够以高效率由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚。
一般而言，微生物的增殖会因苯酚这样的溶剂的细胞毒性而受到抑制，因此，难以使用微生物来制造苯酚，但根据本发明方法，能够使用微生物以实用上足够良好的效率制造苯酚。
附图说明
图1是表示实施例中使用的质粒的构成的图。
图2是表示苯酚对各种微生物在需氧条件下的增殖的影响的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
(I)具有苯酚生产能力的转化体
本发明的具有苯酚生产能力的转化体是将编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌而得到的转化体。
宿主
作为宿主使用的谷氨酸棒杆菌为Bargey’s Manual of DeterminativeBacteriology(伯杰氏系统细菌学手册),Vol.8,599(1974)中定义的一组微生物。
具体而言，可以列举谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)、ATCC13032、ATCC13869、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233(FERM BP-1497)或MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等菌株。其中，优选R(FERM P-18976)株、ATCC13032株及ATCC13869株，更优选R(FERM P-18976)株。
另外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[Liebl,W.et al.,Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM20297T,“Brevibacterium flavum”DSM20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM20412and DSM1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns.Int J Syst Bacteriol.41:255-260.(1991)，驹形和男等,棒状细菌的分类,发酵与工业,45:944-963(1987)]，因此，包含在本发明中。
另外，除了野生株以外，谷氨酸棒杆菌也可以是其突变株或人工的基因重组体。可以列举例如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyrvate carboxylase)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase)等的基因的破坏株。通过使用这种基因破坏株作为宿主，能够提高苯酚的生产率或抑制副产物的生成。
其中，优选乳酸脱氢酶基因的破坏株。该基因破坏株中，乳酸脱氢酶基因被破坏，由此使丙酮酸至乳酸的代谢途径被阻断。其中，特别优选谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)株的乳酸脱氢酶基因的破坏株。
这种基因破坏株可以通过基因工程的方法按照常规方法来制作。例如，WO2005/010182A1中记载了乳酸脱氢酶破坏株及其制作方法。
4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(bsdBCD或dca)
4-羟基苯甲酸脱羧酶为催化通过4-羟基苯甲酸酯/盐脱羧而生成苯酚的反应的酶。
编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因的来源没有特别限定，可以列举：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)等芽孢杆菌属细菌来源的基因；克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)等柠檬酸杆菌属细菌来源的基因；产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)等肠杆菌属细菌来源的基因；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)等埃希氏菌属细菌来源的基因；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)等类芽孢杆菌属细菌来源的基因；菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等泛菌属细菌来源的基因等。其中，优选芽孢杆菌属细菌特别是枯草芽孢杆菌来源的基因、肠杆菌属细菌特别是阴沟肠杆菌来源的基因、埃希氏菌属细菌特别是大肠埃希氏菌来源的基因。
另外，编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的酶的基因根据来源使用各种不同的简称。例如，枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因简称为bsdBCD。本说明书中，有时无论来源如何将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因均简称为“dca”。
作为枯草芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号16的碱基序列构成的DNA，作为萎缩芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号23的碱基序列构成的DNA，作为枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号26的碱基序列构成的DNA，作为克氏柠檬酸杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号29的碱基序列构成的DNA，作为产气肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号32的碱基序列构成的DNA，作为阴沟肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号35的碱基序列构成的DNA，作为霍氏肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号38的碱基序列构成的DNA，作为阪崎肠杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号41的碱基序列构成的DNA，作为大肠埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号44的碱基序列构成的DNA，作为弗格森埃希氏菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号47的碱基序列构成的DNA，作为多粘类芽孢杆菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号50的碱基序列构成的DNA，作为菠萝泛菌来源的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因，可以列举由序列号53的碱基序列构成的DNA。
另外，本发明中，也可以使用在严格的条件下与由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。
本发明中，“严格的条件”是指一般的条件、例如Molecular Cloning,ALaboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,1989,Vol2,p11.45中记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交的解链温度(Tm)低5～10℃的温度下发生杂交的情况。
4-羟基苯甲酸脱羧酶活性可以利用《Genomics,86,342-351,2005“Materials andMethods”》中记载的方法进行测定。简单地来说明，向试验用液中添加被测酶，制备含有100mM MES,pH6.0、1mM DTT、5mM4-羟基苯甲酸酯/盐和酶的反应液，测定270nm下的吸光度的斜率(初速度)。对于不添加4-羟基苯甲酸酯/盐的体系也同样进行反应，作为背景值。将两个测定值的差作为4-羟基苯甲酸脱羧酶活性。
另外，本发明中，也可以使用由与序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列具有90%以上、优选95%以上、更优选98%以上的同一性的碱基序列构成且编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽的DNA。
本发明中，碱基序列的同一性是利用GENETYX第8版(GENETYX株式会社ゼネティックス制造)算出的值。
由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA的同源物可以通过例如使用基于这些碱基序列按照常规方法设计的引物或探针的PCR或杂交由其他生物种的DNA文库中选择，由此以高概率得到编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的多肽。
用于转化的载体的构建
将通过PCR扩增得到的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的DNA各自克隆到能够在宿主中扩增的适当的载体中即可。
作为质粒载体，只要是包含在谷氨酸棒杆菌内担负自主复制功能的基因的质粒载体即可。作为其具体例，可以列举：乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)2256来源的pAM330[日本特开昭58-67699]、[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids inglutamic acid-producing bacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和[Yamaguchi,R.et al.,Determination of the complete nucleotide sequence of theBrevibacterium lactofermentum plasmid pAM330and the analysis of its geneticinformation.Nucleic Acids Symp.Ser.16:265-267(1985)]、谷氨酸棒杆菌ATCC13058来源的pHM1519[Miwa,K.et al.,Cryptic plasmids in glutamic acid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48:2901-2903(1984)]和pCRY30[Kurusu,Y.et al.,Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria.Appl.Environ.Microbiol.57:759-764(1991)]、谷氨酸棒杆菌T250来源的pCG4[日本特开昭57-183799]、[Katsumata,R.et al.,Protoplast transformation of glutamate-producingbacteria with plasmid DNA.J.Bacteriol.、159:306-311(1984)]、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50[日本特开昭62-166890]、pEK0、pEC5、pEKEx1[Eikmanns,B.J.et al.,A family ofCorynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning,controlled gene expression,and promoter probing.Gene,102:93-98(1991)]等。
作为优选的启动子，可以列举谷氨酸棒杆菌R来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶A基因(gapA)的启动子PgapA、苹果酸脱氢酶基因(mdh)的启动子Pmdh、乳酸脱氢酶A基因(ldhA)的启动子PldhA等，其中，优选PgapA。
作为优选的终止子，可以列举大肠杆菌rRNA操纵子的rrnB T1T2终止子、大肠杆菌的trpA终止子、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的trp终止子等，其中，优选rrnB T1T2终止子。
转化
转化方法可以没有限制地使用公知的方法。作为这样的公知的方法，可以列举例如氯化钙/氯化铷法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔法等。其中，对于谷氨酸棒杆菌优选电脉冲法，电脉冲法可以通过公知的方法[Kurusu,Y.et al.,Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation.Agric.Biol.Chem.54:443-447(1990)]和[Vertes A.A.et al.,Presence of mrr-andmcr-like restriction systems in Coryneform bacteria.Res.Microbiol.144:181-185(1993)]进行。
转化体使用微生物的培养中通常使用的培养基进行培养即可。作为该培养基，通常可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基等。
作为碳源，可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇、甘油等糖质或糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸或葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇等。另外，还可以根据期望使用正链烷烃等烃等。碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的这些碳源的浓度通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。
作为氮源，可以列举：氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的氮源浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。
作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。这些无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。培养基中的无机盐类浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。
作为营养物质，可以列举例如肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物或者动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质的培养基浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。另外，还可以根据需要添加维生素类。作为维生素类，可以列举例如生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
培养基的pH优选约5～约8。
作为优选的微生物培养培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolicanalysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。
培养温度设定为约15℃～约45℃即可，培养时间设定为约1天～约7天即可。
宿主染色体基因的破坏或缺失
宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因(poxF)被破坏或发生缺失，由此能够更高效地制造苯酚。
另外，宿主谷氨酸棒杆菌中，优选存在于其染色体上的、编码具有4-羟基苯甲酸羟化酶活性的酶的基因(pobA)被破坏或发生缺失，由此，能够更高效地制造苯酚。
特别优选poxF和pobA这两者均被破坏或发生缺失。
制作以使基因的部分序列缺失而不产生正常发挥功能的酶蛋白的方式进行改变后的缺失型基因，利用包含该基因的DNA转化细菌，在缺失型基因与染色体上的基因之间引起同源重组，由此能够将染色体上的基因置换成缺失型或破坏型的基因。由缺失型或破坏型的基因编码的酶蛋白即使生成也具有与野生型酶蛋白不同的立体结构，功能降低或消失。由这种利用同源重组的基因置换所致的基因缺失或破坏方法已经确立，有：使用包含温度敏感性复制起点的质粒、能够进行接合转移的质粒的方法；利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。
具体而言，通过实施例1的项目中记载的方法，能够得到poxF被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。另外，通过同样的方法，能够得到pobA被破坏或缺失的谷氨酸棒杆菌。
(II)苯酚的制造方法
可以通过包括使上述说明过的本发明的转化体在含有4-羟基苯甲酸酯/盐的反应液中反应的步骤和回收反应液中的苯酚的步骤的方法来制造苯酚。
微生物的增殖
在反应之前，优选将转化体在需氧条件下、在约25℃～约38℃的温度下培养约12小时～约48小时而使其增殖。
培养用培养基
反应之前的转化体的需氧培养中使用的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。
作为碳源，也可以使用：糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等)；甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸等有机酸；乙醇、丙醇等醇；正链烷烃等烃等。
碳源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
作为氮源，可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。另外，也可以使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用一种或者两种以上混合使用。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。
作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐可以单独使用一种或者两种以上混合使用。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。
作为营养物质，可以列举肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而异，通常设定为约0.1～约10(w/v%)即可。
还可以根据需要进一步添加维生素类。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。
培养基的pH优选约6～约8。
作为具体的优选的谷氨酸棒杆菌用培养基，可以列举A培养基[Inui,M.et al.,Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)]、BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。这些培养基中，使糖类浓度在上述范围内来使用即可。
反应液
反应液可以使用含有苯酚前体(苯酚原料)的水、缓冲液、无机盐培养基等。
作为前体，使用4-羟基苯甲酸酯/盐。作为4-羟基苯甲酸酯/盐，可以列举钠盐、钾盐等盐；与碳原子数1～4的醇的酯等。其中，优选盐，更优选钠盐。前体可以单独使用一种或者两种以上混合使用。
反应液中的4-羟基苯甲酸酯/盐的浓度优选约0.5～约20(w/v%)，更优选约1～约10(w/v%)，进一步优选约2～约5(w/v%)。4-羟基苯甲酸酯/盐由于为芳香族化合物而具有抑制细胞存活的作用，但4-羟基苯甲酸酯/盐浓度为上述范围时，能够高效地制造苯酚。
作为缓冲液，可以列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选约10mM～约150mM。
作为无机盐培养基，可以列举含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等无机盐中的一种或两种以上的培养基。其中，优选含有硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体而言，可以列举BT培养基[Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)]等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而异，通常设定为约0.01～约1(w/v%)即可。
反应液的pH优选约6～约8。反应中，优选在使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等利用pH控制器(例如，エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)将反应液的pH控制在中性附近、特别是约7的同时进行反应。
反应条件
反应温度即反应中的转化体的存活温度优选约20℃～约50℃，更优选约25℃～约47℃。反应温度为上述温度范围时，能够高效地制造苯酚。
另外，反应时间优选约1天～约7天，更优选约1天～约3天。
培养可以是分批培养、流加培养、连续培养中的任何一种。其中，优选分批培养。
<还原条件>
反应可以在需氧条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在还原条件下进行。在还原条件下，谷氨酸棒杆菌实质上不增殖，能够更高效地生产苯酚。
还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选约-200mV～约-500mV，更优选约-250mV～约-500mV。
反应液的还原状态可以简单地利用刃天青指示剂(在还原状态下由蓝色脱色为无色)推测，使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORP电极)能够准确地测定。
处于还原条件下的反应液的制备方法可以没有限制地使用公知的方法。例如，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等作为反应液制备用的液体介质，反应液用水溶液的制备方法参考例如硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(Pfennig,Net.al.,(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,A Handbook on Habitats,Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et.al.p.926-940,Berlin,Springer Verlag.)或“农艺化学实验书第三卷、京都大学农学部农艺化学教室编、1990年第26次印刷、产业图书株式会社出版”等，能够得到期望的还原条件下的水溶液。
具体而言，可以通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理将溶解气体除去而得到还原条件的反应液用水溶液。在这种情况下，可以通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压条件下将蒸馏水等处理约1分钟～约60分钟、优选约5分钟～约40分钟来将溶解气体、特别是溶解氧除去而得到还原条件下的反应液用水溶液。
另外，也可以添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。
将上述方法适当组合而成的方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。
反应中也优选将反应液维持于还原条件。为了维持反应过程中的还原条件，优选尽可能地防止从反应体系外混入氧，具体而言，可以列举将反应体系用氮气等惰性气体或二氧化碳等密封的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应过程中使本发明的需氧性细菌的菌体内的代谢功能高效地发挥作用，有时也需要添加维持反应体系的pH的调节液或适当添加各种营养素溶解液，在这种情况下，预先从添加溶液中除去氧是有效的。
苯酚的回收
通过以上述方式进行培养，在反应液中生产出苯酚。可以通过回收反应液来回收苯酚，也可以进一步利用公知的方法从反应液中分离出苯酚。作为这种公知的方法，可以列举蒸馏法、膜透过法、有机溶剂提取法等。
实施例
以下，利用实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1苯酚生产基因的克隆和表达
(1)从微生物中提取染色体DNA
从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)中提取染色体DNA的操作如下进行：向A培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g溶解于1L蒸馏水中]中添加终浓度为4%的50%(w/v)葡萄糖溶液作为碳源，使用铂环接种后，在33℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBRC14144中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)JCM9070中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到JCM Medium No.22培养基[将蛋白胨10g、牛肉提取物10g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)NBRC 101239中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895的染色体DNA(目录号BAA-895D-5)从ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。
从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)NBRC13534中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)NBRC13535中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在37℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)ATCC49162中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到胰酪胨大豆肉汤培养基[将30g胰酪胨大豆肉汤(BD公司制造，目录号211825)溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)ATCC BAA-894来源的染色体DNA(目录号BAA-894D-5)从ATCC(American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)获得。
从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)W NBRC13500中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)NBRC102419中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBRC15309中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到NBRC Medium No.802培养基[将多聚蛋白胨10g、酵母提取物2g、MgSO4·7H2O1g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
从菠萝泛菌(Pantoea ananatis)LMG20103中提取染色体DNA的操作如下进行：使用铂环接种到BCCM/LMG BacteriCulture Medium No.1培养基[将牛肉提取物1g、酵母提取物2g、蛋白胨5g、NaCl5g溶解于1L蒸馏水中]中后，在30℃下振荡培养至对数增殖期，收集菌体后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，安玛西亚公司制造)，按照使用说明书从收集的菌体中回收染色体DNA。
(2)克隆载体的构建
克隆载体pCRB22的构建
通过以下的PCR法对分别包含乳酪棒杆菌JCM12072来源的质粒pCASE1的DNA复制起点(以下记作pCASE1-ori)序列和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将pCASE1-ori序列、克隆载体pHSG298克隆化，基于序列号1(pCASE1-ori序列)、序列号2(克隆载体-pHSG298)分别合成下述一对引物来使用。
pCASE1-ori序列扩增用引物
(a-1)：5’-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3’(序列号3)
(b-1)：5’-AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3’(序列号4)
另外，引物(a-1)和(b-1)上附加有BglII限制性内切酶位点。
克隆载体pHSG298扩增用引物
(a-2)：5’-AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG-3’(序列号5)
(b-2)：5’-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3’(序列号6)
另外，引物(a-2)和(b-2)上附加有BglII限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的乳酪棒杆菌JCM12072的总DNA和克隆载体pHSG298(宝生物株式会社制造)。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增pCASE1-ori序列时使用引物(a-1)与(b-1)的组合进行，扩增克隆载体pHSG298时使用引物(a-2)与(b-2)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃
pCASE1-ori序列 150秒
克隆载体pHSG298 180秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在pCASE1-ori序列的情况下检测到约1.4-kb的DNA片段，在克隆载体pHSG298的情况下检测到约2.7-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含乳酪棒杆菌株来源的质粒pCASE1-ori序列的约1.4-kb的DNA片段10μl和包含克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段10μl分别用限制性内切酶BglII进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接A液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接A液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶BglII分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pHSG298的约2.7-kb的DNA片段以外，还确认到pCASE-ori序列的约1.4-kb的DNA片段。
将包含pCASE1-ori序列的克隆载体命名为pCRB22。
克隆载体pCRB207的构建
通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的gapA基因的启动子序列(以下记作PgapA)的DNA片段和包含克隆载体pKK223-3(法玛西亚公司制造)来源的rrnBT1T2双向终止子序列(以下记作终止子序列)的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了分别将PgapA序列和终止子序列克隆化，基于序列号7(PgapA序列)、序列号8(终止子序列)分别合成下述一对引物来使用。
PgapA序列扩增用引物
(a-3)：5’-CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(序列号9)
(b-3)：5’-CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号10)
另外，引物(a-3)上附加有SalI限制性内切酶位点，引物(b-3)上附加有SalI、BamHI和NcoI限制性内切酶位点。
终止子序列扩增用引物
(a-4)：5’-CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列号11)
(b-4)：5’-CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3(序列号12)
另外，引物(a-4)上附加有SphI和NcoI限制性内切酶位点，引物(b-4)上附加有SphI和BspHI限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R(FERM P-18976)的染色体DNA和pKK223-3质粒(法玛西亚公司制造)。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100251
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增PgapA序列时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增终止子序列时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃
PgapA序列 45秒
终止子序列 30秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在PgapA序列的情况下检测到约0.6-kb的DNA片段，在终止子序列的情况下检测到约0.4-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含谷氨酸棒杆菌R来源的PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段10μl和克隆载体pCRB22约4.1-kb分别用限制性内切酶SalI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接B液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接B液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶SalI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB22的约4.1-kb的DNA片段以外，还确认到PgapA序列的约0.6-kb的DNA片段。
将包含PgapA序列的克隆载体命名为pCRB206。
将由上述PCR扩增出的包含pKK223-3质粒来源的终止子序列的约0.4-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NcoI和BspHI进行切割，将上述的克隆载体pCRB2062μl用限制性内切酶NcoI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接C液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接C液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到克隆载体pCRB206的约4.7-kb的DNA片段以外，还确认到终止子序列的约0.4-kb的DNA片段。
将包含rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB207。
克隆载体pCRB209的构建
通过以下的方法对包含谷氨酸棒杆菌R来源的gapA(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase A，甘油醛-3-磷酸脱氢酶A)基因的启动子(以下记作PgapA)序列的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将pCRB207序列克隆化，基于序列号13(pCRB207)分别合成下述一对引物来使用。
pCRB207序列扩增用引物
(a-5)：5’-CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’(序列号14)
(b-5)：5’-CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列号15)
另外，引物(a-5)和(b-5)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
模板DNA使用含有gapA启动子和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体pCRB207。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝酒造株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增pCRB207序列时使用引物(a-5)与(b-5)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃ 307秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到包含克隆载体pCRB207序列的约5.1-kb的DNA片段。
将由上述PCR扩增出的包含pCRB207来源基因的约5.1-kb的DNA片段10μl用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝酒造株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接D液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接D液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶NdeI对该质粒进行切割，确认了限制性内切酶位点的插入。
将包含PgapA序列和rrnBT1T2终止子序列的克隆载体命名为pCRB209。
(3)苯酚生产基因的克隆
枯草芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的bsdBCD基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将bsdBCD基因克隆化，基于序列号16(枯草芽孢杆菌bsdBCD基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
bsdBCD基因扩增用引物
(a-6)：5’-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3’(序列号17)
(b-6)：5’-CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG-3’(序列号18)
另外，引物(a-6)和(b-6)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
萎缩芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含萎缩芽孢杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号23(萎缩芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-9)：5’-CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG-3’(序列号24)
(b-9)：5’-CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC-3’(序列号25)
另外，引物(a-9)和(b-9)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号26(枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-10)：5’-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3’(序列号27)
(b-10)：5’-CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG-3’(序列号28)
另外，引物(a-10)和(b-10)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
克氏柠檬酸杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含克氏柠檬酸杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号29(克氏柠檬酸杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-11)：5’-CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG-3’(序列号30)
(b-11)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG-3’(序列号31)
另外，引物(a-11)和(b-11)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
产气肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含产气肠杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号32(产气肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-12)：5’-CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG-3’(序列号33)
(b-12)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC-3’(序列号34)
另外，引物(a-12)和(b-12)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
阴沟肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含阴沟肠杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号35(阴沟肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-13)：5’-CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC-3’(序列号36)
(b-13)：5’-CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG-3’(序列号37)
另外，引物(a-13)和(b-13)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
霍氏肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含霍氏肠杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号38(霍氏肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-14)：5’-CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC-3’(序列号39)
(b-14)：5’-CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC-3’(序列号40)
另外，引物(a-14)和(b-14)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
阪崎肠杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含阪崎肠杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号41(阪崎肠杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-15)：5’-CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC-3’(序列号42)
(b-15)：5’-CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC-3’(序列号43)
另外，引物(a-15)和(b-15)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
大肠埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含大肠埃希氏菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号44(大肠埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-16)：5’-CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG-3’(序列号45)
(b-16)：5’-CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC-3’(序列号46)
另外，引物(a-16)和(b-16)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
弗格森埃希氏菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含弗格森埃希氏菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号47(弗格森埃希氏菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-17)：5’-CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT-3’(序列号48)
(b-17)：5’-CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC-3’(序列号49)
另外，引物(a-17)和(b-17)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
多粘类芽孢杆菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含多粘类芽孢杆菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号50(多粘类芽孢杆菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-18)：5’-CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG-3’(序列号51)
(b-18)：5’-CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG-3’(序列号52)
另外，引物(a-18)和(b-18)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
菠萝泛菌来源的苯酚生产基因的克隆
通过以下的PCR法对包含菠萝泛菌来源的、编码具有4-羟基苯甲酸脱羧酶活性的基因的dca基因的DNA片段进行扩增。
PCR时，为了将dca基因克隆化，基于序列号53(菠萝泛菌dca基因)，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
dca基因扩增用引物
(a-19)：5’-CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC-3(序列号54)
(b-19)：5’-CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG-3’(序列号55)
另外，引物(a-19)和(b-19)上附加有NdeI限制性内切酶位点。
对于模板DNA而言，枯草芽孢杆菌使用提取自由NITE(National Institute ofTechnology and Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌NBRC14144的染色体DNA。
萎缩芽孢杆菌使用提取自由日本微生物保藏中心(JCM)获得的萎缩芽孢杆菌JCM9070的染色体DNA。
枯草芽孢杆菌斯氏亚种使用提取自由NITE(National Institute of Technologyand Evaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的枯草芽孢杆菌斯氏亚种NBRC101239的染色体DNA。
克氏柠檬酸杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的克氏柠檬酸杆菌染色体DNA(目录号BAA-895D-5)。
产气肠杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的产气肠杆菌NBRC13534的染色体DNA。
阴沟肠杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的阴沟肠杆菌NBRC13535的染色体DNA。
霍氏肠杆菌使用提取自由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的霍氏肠杆菌ATCC49162的染色体DNA。
阪崎肠杆菌使用由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的阪崎肠杆菌染色体DNA(目录号BAA-894D-5)。
大肠埃希氏菌W使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的大肠埃希氏菌NBRC13500的染色体DNA。
弗格森埃希氏菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的弗格森埃希氏菌NBRC102419的染色体DNA。
多粘类芽孢杆菌使用提取自由NITE(National Institute of Technology andEvaluation，日本国立技术与评估研究院)生物资源中心(NBRC)获得的多粘类芽孢杆菌NBRC15309的染色体DNA。
菠萝泛菌使用提取自由BCCM/LMG(比利时微生物协作保藏中心/微生物实验室，根特大学)获得的菠萝泛菌LMG20103的染色体DNA。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100381
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增枯草芽孢杆菌bsdBCD基因时使用引物(a-6)与(b-6)的组合进行，扩增萎缩芽孢杆菌dca基因时使用引物(a-9)与(b-9)的组合进行，扩增枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因时使用引物(a-10)与(b-10)的组合进行，扩增克氏柠檬酸杆菌dca基因时使用引物(a-11)与(b-11)的组合进行，扩增产气肠杆菌dca基因时使用引物(a-12)与(b-12)的组合进行，扩增阴沟肠杆菌dca基因时使用引物(a-13)与(b-13)的组合进行，扩增霍氏肠杆菌dca基因时使用引物(a-14)与(b-14)的组合进行，扩增阪崎肠杆菌dca基因时使用引物(a-15)与(b-15)的组合进行，扩增大肠埃希氏菌W dca基因时使用引物(a-16)与(b-16)的组合进行，扩增弗格森埃希氏菌dca基因时使用引物(a-17)与(b-17)的组合进行，扩增多粘类芽孢杆菌dca基因时使用引物(a-18)与(b-18)的组合进行，扩增菠萝泛菌dca基因时使用引物(a-19)与(b-19)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃
Figure BDA00003174594100382
Figure BDA00003174594100391
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在枯草芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在萎缩芽孢杆菌bsdBCD基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在克氏柠檬酸杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在产气肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在阴沟肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在霍氏肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.4-kb的DNA片段，在阪崎肠杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在大肠埃希氏菌W dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在弗格森埃希氏菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在多粘类芽孢杆菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段，在菠萝泛菌dca基因的情况下能够检测到约2.3-kb的DNA片段。
(4)苯酚生产基因表达质粒的构建
苯酚生产基因向pCRB209中的克隆
将上述第(3)项中所示的通过PCR扩增出的、包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的约2.3-kb的DNA片段、包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含产气肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的约2.4-kb的DNA片段、包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段、包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段和包含菠萝泛菌株来源的dca基因的约2.3-kb的DNA片段各10μl以及含有PgapA启动子的克隆载体pCRB2092μl分别用限制性内切酶NdeI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其分别作为连接E液、连接G液、连接H液、连接I液、连接J液、连接K液、连接L液、连接M液、连接N液、连接O液、连接P液和连接Q液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的12种连接E液、连接G液、连接H液、连接I液、连接J液、连接K液、连接L液、连接M液、连接N液、连接O液、连接P液和连接Q液分别转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对各培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRB209的约5.1-kb的DNA片段以外，在枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因(连接E液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因(连接G液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因(连接H液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因(连接I液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在产气肠杆菌株来源的dca基因(连接J液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在阴沟肠杆菌株来源的dca基因(连接K液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在霍氏肠杆菌株来源的dca基因(连接L液)的情况下，还确认到长度为约2.4-kb的插入片段，在阪崎肠杆菌株来源的dca基因(连接M液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在大肠埃希氏菌W株来源的dca基因(连接N液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在弗格森埃希氏菌株来源的dca基因(连接O液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因(连接P液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段，在菠萝泛菌株来源的dca基因(连接Q液)的情况下，还确认到长度为约2.3-kb的插入片段。
将包含枯草芽孢杆菌株来源的bsdBCD基因的质粒命名为pCRB209-bsdBCD/BS(图1)，将包含萎缩芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BAE，将包含枯草芽孢杆菌斯氏亚种株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/BSS，将包含克氏柠檬酸杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/CKO，将包含产气肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EAE，将包含阴沟肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ECL，将包含霍氏肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EHO，将包含阪崎肠杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ESA，将包含大肠埃希氏菌W株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/ECK，将包含弗格森埃希氏菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/EFE，将包含多粘类芽孢杆菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PPY，将包含菠萝泛菌株来源的dca基因的质粒命名为pCRB209-dca/PAM。
(5)谷氨酸棒杆菌的染色体基因破坏用质粒的构建
谷氨酸棒杆菌株poxF基因破坏用质粒的构建
通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上poxF基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。
PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
poxF-1区扩增用引物
(a-7)：5’-CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC-3’(序列号19)
(b-7)：5’-GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC-3’(序列号20)
另外，引物(a-7)上附加有XbaI限制性内切酶位点。
poxF-2区扩增用引物
(a-8)：5’-CAAGTCAGCAATGGTTGGTC-3’(序列号21)
(b-8)：5’-CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG-3’(序列号22)
另外，引物(b-8)上附加有XbaI限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100431
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增poxF-1区时使用引物(a-7)与(b-7)的组合进行，扩增poxF-2区时使用引物(a-8)与(b-8)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃
poxF-1区 50秒
poxF-2区 50秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌poxF-1区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段，在poxF-2区的情况下能够检测到约0.8-kb的DNA片段。
接着，将由上述PCR扩增出的poxF-1区片段与poxF-2区片段各1μl混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100441
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)使用poxF-1区片段与poxF-2区片段进行。
PCR循环：
变性过程：95℃ 20秒
退火过程：52℃ 5秒
延伸过程：72℃ 50秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环
进而，以所得到的poxF-1与poxF-2的结合片段为模板，通过PCR进行poxF缺失片段的扩增。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100451
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增poxF缺失片段时使用引物(a-7)与(b-8)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：95℃ 20秒
退火过程：52℃ 5秒
延伸过程：72℃ 97秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到约1.6-kb的poxF缺失片段。
将由上述PCR扩增出的谷氨酸棒杆菌R来源的poxF缺失序列的约1.7-kb的DNA片段10μl与约4.4-kb的无痕染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]2μl分别用限制性内切酶XbaI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μlT4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接F液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接F液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶XbaI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRA725的约4.4-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的pheA缺失基因(连接F液)的情况下，还确认到长度为约1.7-kb的插入片段。
将包含谷氨酸棒杆菌株来源的poxF缺失基因的质粒命名为pCRA725-poxF/CG。
谷氨酸棒杆菌株pobA基因破坏用质粒的构建
通过以下的PCR法对用于构建谷氨酸棒杆菌株的染色体上pobA基因的无痕破坏用质粒所需要的DNA片段进行扩增。
PCR时，基于谷氨酸棒杆菌R的序列，使用应用生物系统公司制造的“394DNA/RNA合成仪”分别合成下述一对引物来使用。
pobA-1区扩增用引物
(a-20)：5’-CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG-3’(序列号56)
(b-20)：5’-GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG-3’(序列号57)
另外，引物(a-20)上附加有XbaI限制性内切酶位点。
pobA-2区扩增用引物
(a-21)：5’-GAGGTATAAACGCTCGTGTC-3’(序列号58)
(b-21)：5’-CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG-3(序列号59)
另外，引物(b-21)上附加有SacI限制性内切酶位点。
模板DNA使用提取自谷氨酸棒杆菌R的染色体DNA。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100471
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增pobA-1区时使用引物(a-20)与(b-20)的组合进行，扩增pobA-2区时使用引物(a-21)与(b-21)进行。
PCR循环：
变性过程：94℃ 60秒
退火过程：52℃ 60秒
延伸过程：72℃
pobA-1区 60秒
pobA-2区 60秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，在谷氨酸棒杆菌pobA-1区的情况下能够检测到约1.0-kb的DNA片段，在pobA-2区的情况下能够检测到约1.0-kb的DNA片段。
接着，将由上述PCR扩增出的pobA-1区片段与pobA-2区片段各1μl混合，通过PCR进行两种片段的结合反应。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100481
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)使用pobA-1区片段与pobA-2区片段进行。
PCR循环：
变性过程：95℃ 20秒
退火过程：52℃ 5秒
延伸过程：72℃ 50秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
进而，以所得到的pobA-1与pobA-2的结合片段为模板，通过PCR进行pobA缺失片段的扩增。
实际的PCR中，使用热循环仪GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司制造)，并使用TaKaRa LA Taq(宝生物株式会社制造)作为反应试剂在下述的条件下进行。
反应液：
Figure BDA00003174594100491
将以上物质混合，将该50μl的反应液供于PCR。
*)扩增pobA缺失片段时使用引物(a-20)与(b-21)的组合进行。
PCR循环：
变性过程：95℃ 20秒
退火过程：52℃ 5秒
延伸过程：72℃ 97秒
将以上过程作为一个循环，进行30个循环。
利用0.8%的琼脂糖凝胶对10μl上述中生成的反应液进行电泳，能够检测到约2.0的pobA缺失片段。
将由上述PCR扩增出的谷氨酸棒杆菌R来源的pobA缺失序列的约2.0的DNA片段10μl与约4.4-kb的无痕染色体基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol.8,243-254(2004)、(日本特开2006-124440)]2μl分别用限制性内切酶XbaI和SacI进行切割，并在70℃下处理10分钟，由此使限制性内切酶失活，然后，将两者混合，向其中添加1μl T4DNA连接酶10×缓冲液、1单位T4DNA连接酶(宝生物株式会社制造)各成分，利用无菌蒸馏水调节为10μl，在15℃下反应3小时使其结合。将其作为连接R液。
利用氯化钙法[Journal of Molecular Biology,53,159(1970)]以所得到的连接R液转化大肠埃希氏菌JM109，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上。
通过常规方法对培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶XbaI和SacI分别对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，除了确认到质粒pCRA725的约4.4-kb的DNA片段以外，在谷氨酸棒杆菌株来源的pobA缺失基因(连接N液)的情况下，还确认到长度为约2.0-kb的插入片段。
将包含谷氨酸棒杆菌株来源的pobA缺失基因的质粒命名为pCRA725-pobA/CG。
(6)副产物途径基因破坏株的构建
谷氨酸棒杆菌株poxF基因破坏株的构建
无痕染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌R内复制的质粒。使用pCRA725-poxF/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[A液体培养基和1.5%琼脂]上。将使用上述培养基得到的一重交叉株涂布到含有10%(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml溶解在1L蒸馏水中，并加入1.5%琼脂]上。
在质粒pCRA725-poxF/CG为与染色体上的同源区的一重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的表达而显示出卡那霉素耐性，并且由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示出在含蔗糖培养基中的致死性，相对于此，在质粒pCRA725-poxF/CG为二重交叉株的情况下，由于pCRA725-poxF/CG上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示出卡那霉素敏感性，并且由于sacR-sacB基因的脱落而显示出在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无痕染色体基因破坏株显示出卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。
因此，选择出显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性的菌株。将该谷氨酸棒杆菌R株poxF基因无痕破坏株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ΔpoxF。
谷氨酸棒杆菌株poxF、pobA基因破坏株的构建
无痕染色体基因导入用载体pCRA725是不能在谷氨酸棒杆菌R内复制的质粒。使用pCRA725-pobA/CG，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpoxF，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[A液体培养基和1.5%琼脂]上。将使用上述培养基得到的一重交叉株涂布到含有10%(W/V)蔗糖的BT琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml溶解在1L蒸馏水中，并加入1.5%琼脂]上。
在质粒pCRA725-pobA/CG为与染色体上的同源区的一重交叉株的情况下，由于pCRA725-pobA/CG上的卡那霉素耐性基因的表达而显示出卡那霉素耐性，并且由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而显示出在含蔗糖培养基中的致死性，相对于此，在质粒pCRA725-pobA/CG为二重交叉株的情况下，由于pCRA725-pobA/CG上的卡那霉素耐性基因的脱落而显示出卡那霉素敏感性，并且由于sacR-sacB基因的脱落而显示出在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无痕染色体基因破坏株显示出卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。
因此，选择出显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性的菌株。将该在谷氨酸棒杆菌ΔpoxF株中叠加有pobA基因的无痕破坏的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ΔpoxFΔpobA。
(7)苯酚生产基因导入株的构建
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆菌ΔpoxF株中的导入
分别使用上述12种质粒(pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM)，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpoxF株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。
通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM的导入。
将确认到pCRB209-bsdBCD/BS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21，将确认到pCRB209-dca/BAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-2，将确认到pCRB209-dca/BSS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-3，将确认到pCRB209-dca/CKO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-4，将确认到pCRB209-dca/EAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-5，将确认到pCRB209-dca/ECL的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-6，将确认到pCRB209-dca/EHO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-7，将确认到pCRB209-dca/ESA的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-8，将确认到pCRB209-dca/ECK的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-9，将确认到pCRB209-dca/EFE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-10，将确认到pCRB209-dca/PPY的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-11，将确认到pCRB209-dca/PAM的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE21-12。另外，将该菌株的基因重组的概要归纳示于表1中。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)PHE21保藏于日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心(保藏日：2010年10月21日，保藏编号：NITE BP-996)。
表1
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆菌ΔpoXF株中的导入
Figure BDA00003174594100541
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆菌ΔpoxFΔpobA株中的导入
分别使用上述12种质粒(pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM)，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌ΔpoxFΔpobA株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。
通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM的导入。
将确认到pCRB209-bsdBCD/BS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-1，将确认到pCRB209-dca/BAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-2，将确认到pCRB209-dca/BSS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-3，将确认到pCRB209-dca/CKO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-4，将确认到pCRB209-dca/EAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-5，将确认到pCRB209-dca/ECL的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-6，将确认到pCRB209-dca/EHO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-7，将确认到pCRB209-dca/ESA的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-8，将确认到pCRB209-dca/ECK的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-9，将确认到pCRB209-dca/EFE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-10，将确认到pCRB209-dca/PPY的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-11，将确认到pCRB209-dca/PAM的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE22-12。另外，将该菌株的基因重组的概要归纳示于表2中。
表2
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆菌ΔpoXFΔpobA株中的导入
Figure BDA00003174594100551
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆菌R株中的导入
分别使用上述12种质粒(pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM)，利用电脉冲法[Agric.Biol.Chem.,Vol.54,443-447(1990)和Res.Microbiol.,Vol.144,181-185(1993)]转化谷氨酸棒杆菌R株，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基上。
通过常规方法对该培养基上的生长株进行液体培养，从培养液中提取质粒DNA，利用限制性内切酶对该质粒进行切割，确认插入片段。结果，确认了上述中制作的质粒pCRB209-bsdBCD/BS、pCRB209-dca/BAE、pCRB209-dca/BSS、pCRB209-dca/CKO、pCRB209-dca/EAE、pCRB209-dca/ECL、pCRB209-dca/EHO、pCRB209-dca/ESA、pCRB209-dca/ECK、pCRB209-dca/EFE、pCRB209-dca/PPY和pCRB209-dca/PAM的导入。
将确认到pCRB209-bsdBCD/BS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-1，将确认到pCRB209-dca/BAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-2，将确认到pCRB209-dca/BSS的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-3，将确认到pCRB209-dca/CKO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-4，将确认到pCRB209-dca/EAE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-5，将确认到pCRB209-dca/ECL的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-6，将确认到pCRB209-dca/EHO的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-7，将确认到pCRB209-dca/ESA的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-8，将确认到pCRB209-dca/ECK的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-9，将确认到pCRB209-dca/EFE的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-10，将确认到pCRB209-dca/PPY的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-11，将确认到pCRB209-dca/PAM的导入的菌株命名为谷氨酸棒杆菌PHE23-12。另外，将该菌株的基因重组的概要归纳示于表3中。
表3
苯酚生产基因向谷氨酸棒杆苗R株中的导入
Figure BDA00003174594100571
实施例2导入有苯酚生产基因的谷氨酸棒杆菌副产物途径破坏株和R株(野生株) 的苯酚生成实验
将实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌ΔpoxF/苯酚生产基因导入株(参考表1)涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌ΔpoxF/苯酚生产基因导入株接种到装有10ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌ΔpoxF/苯酚生产基因导入株接种到装有500ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的各菌体。将所得到的菌体悬浊到50ml BT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使菌体终浓度为10%。将该菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加作为底物的4-羟基苯甲酸钠以达到250mM，在保持于33℃的水浴中边搅拌边反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)进行控制以使反应液的pH不低于7.0的同时进行反应。
对取样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液进行苯酚的定量。
结果，谷氨酸棒杆菌PHE21株在还原条件下的反应中在1小时后生成了65mM(6g/L)的苯酚，在4小时后生成了180mM(17g/L)的苯酚(表4)。将该条件下的谷氨酸棒杆菌PHE21-2～PHE21-12株的结果也一并示于表4中。
表4
导入有苯酚生产基因的谷氨酸棒杆菌ΔpoXF株的苯酚生产试验
Figure BDA00003174594100591
*)表内的表示的缩写如下所示
<基因起源缩写>
BS：枯草芽孢杆菌
BAE：萎缩芽孢杆菌
BSS：枯草芽孢杆菌斯氏亚种
CKO：克氏柠檬酸杆菌
EAE：产气肠杆菌
ECL：阴沟肠杆菌
EHO：霍氏肠杆菌
ESA：阪崎肠杆菌
ECK：大肠埃希氏菌W
EFE：弗格森埃希氏菌
PPY：多粘类芽孢杆菌
PAM：菠萝泛菌
接着，将实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌ΔpoxFΔpobA/苯酚生产基因导入株(参考表2)涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌ΔpoxFΔpobA/苯酚生产基因导入株接种到装有10ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌ΔpoxFΔpobA/苯酚生产基因导入株接种到装有500ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的各菌体。将所得到的菌体悬浊到50ml BT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使菌体终浓度为10%。将该菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加作为底物的4-羟基苯甲酸钠以达到250mM，在保持于33℃的水浴中边搅拌边反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)进行控制以使反应液的pH不低于7.0的同时进行反应。
对取样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液进行苯酚的定量。
结果，谷氨酸棒杆菌PHE22-1～PHE22-12株在还原条件下的反应中在1小时后如表5所示生成了苯酚。
由该结果可知，通过破坏poxA基因，观察到苯酚生产率的提高。
表5
导入有苯酚生产基因的谷氨酸棒杆菌ΔpoXFΔpobA株的苯酚生产试验
Figure BDA00003174594100611
*)表内的表示的缩写如下所示
<基因起源缩写>
BS：枯草芽孢杆菌
BAE：萎缩芽孢杆菌
BSS：枯草芽孢杆菌斯氏亚种
CKO：克氏柠檬酸杆菌
EAE：产气肠杆菌
ECL：阴沟肠杆菌
EHO：霍氏肠杆菌
ESA：阪崎肠杆菌
ECK：大肠埃希氏菌W
EFE：弗格森埃希氏菌
PPY：多粘类芽孢杆菌
PAM：菠萝泛菌
此外，作为比较例，将实施例1中制作的谷氨酸棒杆菌R株/苯酚生产基因导入株(参考表3)涂布到含有50μg/ml卡那霉素的A琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在28℃下于暗处静置20小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R株/苯酚生产基因导入株接种到装有10ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的试管中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R株/苯酚生产基因导入株接种到装有500ml含有50μg/ml卡那霉素的A液体培养基的容量2L的三角烧瓶中，在28℃下在需氧条件下进行15小时的振荡培养。
通过离心分离(4℃、5000g、15分钟)回收以上述方式培养增殖后的各菌体。将所得到的菌体悬浊到50ml BT(-尿素)液体培养基[0.7%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁七水合物、0.0006%硫酸铁七水合物、0.00042%硫酸锰水合物、0.00002%生物素、0.00002%硫胺素盐酸盐]中以使菌体终浓度为10%。将该菌体悬浊液装入容量100ml的培养瓶中，在还原条件下(氧化还原电位：-450mV)添加作为底物的4-羟基苯甲酸钠以达到250mM，在保持于33℃的水浴中边搅拌边反应。此时，在使用2.5N的氨水并利用pH控制器(エイブル株式会社制造，型号：DT-1023)进行控制以使反应液的pH不低于7.0的同时进行反应。
对取样得到的反应液进行离心分离(4℃、15000g、10分钟)，使用所得到的上清液进行苯酚的定量。
结果，谷氨酸棒杆菌PHE23-1～PHE23-12株在还原条件下的反应中在1小时后如表6所示生成了苯酚。
由该结果可知，在ΔpoxF株(表4)中导入有苯酚生产基因的菌株以及在ΔpoxFΔpobA株(表5)中导入有苯酚生产基因的菌株的苯酚生产率比在谷氨酸棒杆菌R株(野生株)中导入有苯酚生产基因的菌株的苯酚生产率高，由此表明，poxF基因的破坏和pobA基因的破坏对苯酚生产率具有正效果。
表6
导入有苯酚生产基因的谷氨酸棒杆菌R株的苯酚生产试验
Figure BDA00003174594100631
*)表内的表示的缩写如下所示
<基因起源缩写>
BS：枯草芽孢杆菌
BAE：萎缩芽孢杆菌
BSS：枯草芽孢杆菌斯氏亚种
CKO：克氏柠檬酸杆菌
EAE：产气肠杆菌
ECL：阴沟肠杆菌
EHO：霍氏肠杆菌
ESA：阪崎肠杆菌
ECK：大肠埃希氏菌W
EFE：弗格森埃希氏菌
PPY：多粘类芽孢杆菌
PAM：菠萝泛菌
实施例3作为苯酚生产用宿主的适性试验
苯酚对需氧增殖的影响
对谷氨酸棒杆菌、大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌进行需氧培养中的苯酚的生长抑制试验。另外，本试验中使用的恶臭假单胞菌S12作为耐溶剂性菌进行了报道，并公开了迄今为止唯一作为苯酚生产的宿主使用的技术。
将谷氨酸棒杆菌R涂布在A琼脂培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g、琼脂15g悬浊于1L蒸馏水中]上，在33℃下于暗处静置15小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的谷氨酸棒杆菌R接种到装有10mlA液体培养基[将(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06%(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042%(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02%(w/v)生物素溶液1ml、0.01%(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、维生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g溶解于1L蒸馏水中]的试管中，在33℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。
将上述条件下生长的谷氨酸棒杆菌R接种到100ml A液体培养基中以使初始菌体浓度OD610为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.2mM、0.24mM、0.32mM，并在33℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD610的吸光度来进行。
将大肠埃希氏菌JM109涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在37℃下于暗处静置15小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的大肠埃希氏菌JM109接种到装有10ml LB液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠]的试管中，在37℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。
将上述条件下生长的大肠埃希氏菌JM109接种到100ml LB液体培养基中以使初始菌体浓度OD610为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.16mM、0.20mM，并在37℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD610的吸光度来进行。
将恶臭假单胞菌F1和S12涂布在LB琼脂培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和1.5%琼脂]上，在30℃下于暗处静置15小时。
将一铂环的上述培养皿中生长的恶臭假单胞菌F1和S12接种到装有10ml LB(+葡萄糖)液体培养基[1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠和0.4%葡萄糖]的试管中，在30℃下在需氧条件下进行13小时的振荡培养。
将上述条件下生长的恶臭假单胞菌F1和S12株接种到100ml LB(+葡萄糖)液体培养基中以使初始菌体浓度OD610为0.05，同时添加苯酚使终浓度为0mM、0.10mM、0.20mM，并在30℃下在需氧条件下进行振荡培养。菌体的生长通过测定OD610的吸光度来进行。将向培养基中添加苯酚对需氧增殖的影响的分析结果示于图2中。
对于大肠埃希氏菌而言，在0.16%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。
恶臭假单胞菌F1和作为耐溶剂性菌被报道的恶臭假单胞菌S12显示出基本相同的倾向，在0.10%的苯酚存在下增殖显著受到抑制，在0.20%的苯酚存在下增殖完全被抑制。
与此相对，谷氨酸棒杆菌即使在使大肠埃希氏菌的增殖受到显著抑制的0.16%的苯酚存在下对增殖也几乎没有影响，即使在使大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌的增殖完全被抑制的0.20%的苯酚存在下也显示出良好的生长。而且在0.24%的苯酚存在下能够增殖。
由此表明，谷氨酸棒杆菌与大肠埃希氏菌和恶臭假单胞菌相比对苯酚具有高耐性，作为苯酚生产的宿主具有高适性。
产业上的可利用性
根据本发明方法，能够使用微生物以实用的效率由4-羟基苯甲酸酯/盐制造苯酚。
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Claims (6)

1.一种苯酚的制造方法，其中，包括：
使转化体在还原条件下、在含有4-羟基苯甲酸酯或其盐的反应液中反应的步骤，和
回收反应液中的苯酚的步骤，
所述转化体通过将编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因导入宿主谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)而得到，所述宿主谷氨酸棒杆菌为存在于其染色体上的编码具有苯酚2-单加氧酶活性的酶的基因、以及存在于其染色体上的编码4-羟基苯甲酸羟化酶的基因被破坏或发生缺陷的谷氨酸棒杆菌。
2.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，反应步骤中，转化体实质上不增殖。
3.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，还原条件下的反应液的氧化还原电位为-200～-500毫伏。
4.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的基因、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)来源的基因、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)来源的基因、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)来源的基因、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的基因、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源的基因、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)来源的基因、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)来源的基因、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)来源的基因、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)来源的基因、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)来源的基因或菠萝泛菌(Pantoeaananatis)来源的基因。
5.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因为下述(a)的DNA，
(a)由序列号16、序列号23、序列号26、序列号29、序列号32、序列号35、序列号38、序列号41、序列号44、序列号47、序列号50或序列号53的碱基序列构成的DNA。
6.如权利要求1所述的苯酚的制造方法，其中，所述宿主谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌R、谷氨酸棒杆菌ATCC13032或谷氨酸棒杆菌ATCC13869，所述谷氨酸棒杆菌R的保藏编号为FERM P-18976。
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