CN113699090B - 一种构建丙酸生产菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建丙酸生产菌的方法，包括以下步骤：中断谷氨酸棒杆菌基因组中ldh基因，整合入大肠杆菌来源的scpA、scpB和scpC的表达基因，筛选出厌氧条件下生产丙酸、但不生产乳酸的工程菌。该工程菌发酵产生的丙酸能够用于制备食品级的丙酸钙。

Description

一种构建丙酸生产菌的方法

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种产丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建方法、以及食品级丙酸钙的制备方法。

背景技术

丙酸钙广泛应用于食品、酿造、饲料、中药等行业，如面包、食醋、酱油、酱油食品蛋糕等。像其他脂肪酸一样，丙酸钙可以通过新陈代谢被人和动物吸收，并为人和动物提供必要的钙。丙酸钙被世卫组织和粮农组织批准用于安全食品和饲料使用酸基防腐剂，在酸性条件下，产生游离酸，具有抗菌作用，其防腐性能优越，是一种理想的食品防腐剂。GlobalIndustry Analysts,Inc.于2021年发布的调研报告指出，丙酸钙2020年估算为2亿8,130万美元的全球市场，在2020年～2027年期间预计将以4％的年复合成长率增长，2027年之前达到3.7亿美元。

丙酸钙主要制备方法是由丙酸和氢氧化钙直接反应制备丙酸钙，此方法耗能高，污染大，由于化工产品丙酸不是生物基来源，一定程度上影响其在高端产品中的应用。此外还有发酵法制备丙酸，然后发酵液浓缩后加入氢氧化钙进行反应制备丙酸钙，目前丙酸发酵菌株主要有产酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌等，产物浓度最高可达90g/L，但是发酵周期要300小时(Gonzalez-Garcia R.,et al.,Microbial Propionic Acid Production[J].Fermentation,2017,3(2):21.)。Jing L.等(Jing L.,et al.,Construction of a novelanaerobic pathway in Escherichia coli for propionate production[J].BmcBiotechnology,2017,17:1.)报道了一种产丙酸大肠杆菌，厌氧发酵72h可产丙酸4.95g/L。虽然大肠杆菌增殖速度很快，考虑到丙酸钙越来越多地用于食品、药品制造，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过大肠杆菌发酵获得的丙酸难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

发明内容

为了克服上述产酸丙酸杆菌和费氏丙酸杆菌增值速度慢且发酵周期过长、大肠肝菌造成发酵产品销售障碍和接受度低的缺陷，提高丙酸/丙酸钙被食品和药品销售商和消费者的接受度，发明人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等作为菌种通过发酵来生产丙酸的可行性，终于在谷氨酸棒杆菌中取得了成功。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种构建丙酸生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.中断谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh，NCBI登录号NP_602100.1)基因，得到菌株A；

B.构建用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA，NCBI登录号：NP_417392.1)基因表达元件、大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB，NCBI登录号：NP_311816.2)基因表达元件、大肠杆菌来源的丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC，NCBI登录号：NP_417396.4)基因表达元件，并将这三个基因表达元件分别或者共同克隆入用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的质粒载体中，得到基因表达质粒；

C.将步骤B中得到的基因表达质粒转入步骤A中得到的菌株A中，筛选基因组中整合了所述scpA、scpB和scpC编码基因的阳性克隆即菌株C；

D.从菌株C中筛选出厌氧条件下生产丙酸的工程菌。

优选地，上述每个基因表达元件包括启动子Psod、编码基因序列、终止子rrnBT1T2。

在一种实施方式中，甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA)编码基因的核苷酸序列为SEQID NO:1，但不限于此；甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB)编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2，但不限于此；丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC)编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:3，但不限于此。

上述步骤B中所述质粒载体优选是pEKEX2。

在一种优选的实施方式中，步骤B中三个基因表达元件克隆入同一个质粒载体pEKEX2中，得到pEKEX2-ScpABC质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

上述方法中，宿主谷氨酸棒杆菌优选是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

优选地，步骤D中筛选出的工程菌发酵时不生产乳酸，从而为丙酸的提取分离提供了极大方便，有利于降低生产成本。

上述步骤A可以是敲除谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶(ldh)基因，包括下述步骤：

A1.以ATCC13032基因组为模板，使用引物对Ldh-up-F和Ldh-up-R进行PCR扩增，得到约0.8kb的ldh基因上游同源臂片段ldh-up；

A2.以ATCC13032基因组为模板，引物对Ldh-dn-F和Ldh-dn-R进行PCR扩增，得到约0.8kb的ldh基因下游同源臂片段ldh-dn；

A3.以ldh-up和ldh-dn片段为模板，使用引物对Ldh-up-F/Ldh-dn-R进行OE-PCR扩增ldh-up-dn片段；

A4.将ldh-up-dn片段与PstI/HindIII线性化pK18mobsacB质粒进行同源拼接，转化DH5α感受态细胞，转化子抽质粒测序鉴定，获得质粒pK18mobsacB-ldh，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5；

A5.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；

A6.将质粒pK18mobsacB-ldh转化入ATCC13032感受态细胞；

A7.进行SacB蔗糖反筛，使用引物对ldh-KO-F和ldh-KO-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(Δldh)即菌株A。

本发明的第二个方面在于提供一种丙酸生产菌，其通过上述的方法构建得到。

本发明的第三个方面在于提供上述丙酸生产菌在生产丙酸中的应用。具体地，通过菌株的发酵来生产丙酸。

其中，丙酸生产菌先进行通气(有氧发酵)发酵，在菌体增殖进入对数生长期后期、接近或者进入平台期时开始厌氧发酵。

采用发酵罐发酵48小时即可结束发酵，完成丙酸在发酵液中的有效积累。

发酵结束后，离心去除菌体，上清液浓缩，调节pH至2.5左右，减压蒸馏回收丙酸，回收丙酸中加入氢氧化钙溶液，将pH调至7.5左右，喷雾干燥，获得丙酸钙晶体，可以作为食品级的高端丙酸钙。

本发明在公认的安全模式微生物谷氨酸棒杆菌中引入了丁二酸至丙酸代谢途径，所得基因工程菌能够以葡萄糖为原料通过一步发酵来实现丙酸的从头合成，发酵中直接产生丙酸、且不生产乳酸，所得到的丙酸能够制备成食品级的高端丙酸钙，易于被广大食品和药品销售商和消费者所接受，应用前景广阔。

附图说明

图1是本发明构建的质粒pK18mobsacB-ldh图谱，全长7313bp，其核苷酸序列为SEQID NO:5。

图2是本发明构建的pEKEX2-ScpABC质粒图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

图3是本发明构建的谷氨酸棒杆菌中生物合成丙酸的代谢路线图。

具体实施方式

本发明根据谷氨酸棒杆菌内在丁二酸(琥珀酸)代谢途径(如图3所示)，运用代谢工程构建了丙酸合成路线，通过中断乳酸脱氢酶基因ldh，弱化或阻断丙酮酸向乳酸的转化，使得谷氨酸棒杆菌可通过发酵将葡萄糖经过一系列生化反应合成丙酸，并排出体外。

术语“中断(disruption)”，是某一个基因的功能丧失或者大幅度下调即基因敲减，包括该基因的敲除、突变或缺失，一般可以通过敲除、插入失活、移码突变、引入终止密码子提前翻译终止等常规的基因操作手段实现。

简而言之，该代谢工程是对谷氨酸棒杆菌进行如下基因工程改造：中断谷氨酸棒杆菌基因组中ldh基因，整合入大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶scpA、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶scpB和丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶scpC的表达基因，构建出在厌氧条件下生产丙酸、但不生产乳酸的基因工程菌。

在本文中，有时为了描述简便，会将酶比如乳酸脱氢酶(ldh)蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于乳酸脱氢酶，用于描述乳酸脱氢酶功能或类别时，指的是ldh蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该酶的基因idh，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。

在本文中，对于本发明，术语“丙酸生产菌”、“基因工程菌”、“丙酸工程菌”都表示构建的谷氨酸棒杆菌工程菌ATCC13032(Δldh)/pEKEX2-ScpABC菌株，或谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Δldh::scpABC)。

为了在谷氨酸棒杆菌比如ATCC13032中最佳地表达外源的酶scpA、scpB和scpC，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在选定的微生物如谷氨酸棒杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在选定的微生物中得以改良。

发明人分别对于甲基丙二酰辅酶A变位酶(scpA，NCBI登录号：NP_417392.1)、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(scpB，NCBI登录号：NP_311816.2)和丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶(scpC，NCBI登录号：NP_417396.4)进行了谷氨酸棒杆菌偏好性的密码子优化，分别设计出5-10个编码基因序列。通过多次排列组合的对比实验，对这些编码基因序列进行筛选，优选出scpA编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，scpB编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，scpC编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

为了使得上述基因在谷氨酸棒杆菌中得到最佳表达，发明人还对于上述基因的表达元件结构和质粒载体进行了优化选择，发现每个基因表达元件的启动子选择为Psod、终止子选择为rrnBT1T2，并且将质粒载体选择为pEKEX2能够构建出较佳的丙酸生产菌。

这些对比实验的考察指标包括丙酸产量(发酵液中含量)、丙酸/丁二酸/乳酸比例。通过上述每个基因表达元件的构成和质粒载体的优化，厌氧发酵后的发酵液中丙酸的含量高于丁二酸的含量，大大出乎理论预期。更有利的是，乳酸的含量极低，几乎检测不出。

在发酵过程中，乳酸和丁二酸是在中后期的厌氧发酵中产生的。丙酸生产菌一开始进行通气(有氧发酵)发酵，在菌体增殖接近或者进入平台期时开始厌氧发酵，菌体开始分泌乳酸和丁二酸，直至进入菌体衰亡期，停止发酵。

丙酸生产菌发酵48h即可结束，发酵过程中无乳酸生成，发酵液中丙酸/丁二酸的重量比例大约为20.3/8.5。

从发酵液中将乳酸与丁二酸进行分离来回收丙酸，可通过调节发酵液pH、减压蒸馏的方法来实施。然后在分离出的丙酸中加入氢氧化钙溶液进行中和反应，经过调节反应液pH并喷雾干燥，即可获得丙酸钙晶体，用作食品和药品原料。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的基因合成、引物合成及测序皆委托南京金唯智生物技术有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

培养基：

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

BHIS液体培养基：37g/L BHI，91g/L山梨醇。(BHIS固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

BHIS-suc固体培养基：37g/LBHI，91g/L山梨醇，200g/L蔗糖，10g/L葡萄糖。

种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠2.5g/L，葡萄糖10g/L。

发酵培养基：葡萄糖100g/L，硫酸镁100mg/L，酵母粉35g/L，硫酸铵20g/L，FeSO₄.7H₂O 11mg/L，柠檬酸钠10mg/L，H₃PO4(85％)250μl/L，消泡剂204 500mg/L，泛酸钙60mg/L，维生素PP 18mg/L，thiamin HCl 15mg/L，生物素15mg/L。

20X电转母液：80g/L甘氨酸，2％吐温80。

以下实施例中，当使用含卡那霉素的培养基时，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。

丙酸HPLC检测方法：

流动相	95:5＝0.1％高氯酸：100％乙腈
		仪器	Waters
色谱柱	Agilent-SB-Aq
		流速(mL/min)	1mL/min
进样量(uL)	5μL
		柱温(℃)	40℃
波长(nm)	210nm
		运行时间(min)	10min
出峰时间	5.672min
		稀释液	纯水

实施例中使用的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

引物	序列(5’→3’)
		Ldh-up-F	tacccggggatcctctagagtcgacctgcagggtttcgtcgcgggttactcgtgcg
Ldh-up-R	ctgctttgtgggttgatctttggcgcctagttggcgac
		Ldh-dn-F	taggcgccaaagatcaacccacaaagcagctcagaaaatc
Ldh-dn-R	gacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgctgcgatgaaacttatccac
		Ldh-KO-F	gatgcgcgtaatgcatgaggttg
Ldh-KO-R	gtgatggcaccagttgcgatgtg

实施例中所使用的出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032和质粒pK18mobsacB由上海工业生物技术研发中心惠赠；质粒pK18mobsacB-ldh和pEKEX2-ScpABC委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。任何单位和个人都可以获得这些质粒用于验证本发明，但未经允许不得用作其他用途，包括开发利用、新药申报、科学研究和教学。

实施例1：乳酸脱氢酶基因敲除菌株ATCC13032(Δldh)构建

1.1构建pK18mobsacB-ldh质粒

以ATCC13032基因组为模板，使用引物对Ldh-up-F/Ldh-up-R进行PCR扩增ldh基因上游同源臂片段ldh-up，大小0.8kb；

以ATCC13032基因组为模板，使用引物对Ldh-dn-F/Ldh-dn-R进行PCR扩增ldh基因下游同源臂片段ldh-dn，大小0.8kb。

用KOD-neo DNA聚合酶进行扩增，PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，58℃30s，68℃35s，31个循环；68℃10min；16℃10min。

分别用琼脂糖凝胶回收0.8kb的ldh-up和ldh-dn片段。

以ldh-up和ldh-dn片段为模板，使用引物对Ldh-up-F/Ldh-dn-R进行OE-PCR扩增ldh-up-dn片段，PCR条件同上，延伸时间延长到1min，琼脂糖凝胶回收1.6kb PCR产物。

将OE-PCR产物与PstI/HindIII线性化的质粒pK18mobsacB(质粒pK18mobsacB的碱基序列由中国科学院上海生命科学研究院杨晟课题组提供，GenBank登录号为FJ437239.1)进行同源拼接(Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，TransGene)，转化DH5α感受态细胞(上海唯地生物)，转化子抽质粒测序鉴定，获得质粒pK18mobsacB-ldh，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

1.2构建ATCC13032(Δldh)菌株

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032甘油菌在BHIS平板上划线，30℃恒温培养箱中培养48h，挑取单菌落到BHIS试管培养基中，30℃摇床220rpm过夜培养。取1ml菌液到50ml的BHIS液体培养基摇瓶中，同时加入2.5ml 20X电转母液，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至OD₆₀₀值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500×g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500×g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入250μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每80μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。

吸取3μl(500ng以上)pK18mobsacB-ldh质粒到上述感受态细胞中，混匀后转移至2μm电转杯中，在2.5kV的条件下进行电击，电击时间为5.3ms，电击后立即转入800μl 46℃预热的BHIS液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取100μl菌体涂布在含卡那霉素的BHIS平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。

挑取含卡那霉素的BHIS平板上的转化子2-3个，分别接种到无抗性的BHIS试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24h，使其发生双交换。将菌体分别稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的BHIS-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取BHIS-suc平板转化子，分别点板BHIS平板和含卡那霉素的BHIS平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时，进行SacB蔗糖反筛验证。挑选出在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，使用引物ldh-KO-F和ldh-KO-R进行PCR扩增验证，阳性转化子PCR扩增条带约为0.87Kb，阴性转化子条带约为1.84kb。挑取阳性转化子到4ml的BHIS试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养14小时，使用20％甘油保菌，得到了基因型为ATCC13032(Δldh)的菌株。

实施例2：含基因簇scpABC的整合质粒构建

2.1根据甲基丙二酰辅酶A变位酶scpA(NCBI登录号：NP_417392.1)的氨基酸序列，设计适合谷氨酸棒杆菌表达的核苷酸序列共10种，包括核苷酸序列SEQ ID NO:1；

根据甲基丙二酰辅酶A脱羧酶scpB(NCBI登录号：NP_311816.2)的氨基酸序列，设计适合在谷氨酸棒杆菌中表达的核苷酸序列共8种，包括核苷酸序列SEQ ID NO:2；

根据丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶scpC(NCBI登录号：NP_417396.4)的氨基酸序列，设计适合在谷氨酸棒杆菌中表达的核苷酸序列共5种，包括核苷酸序列SEQ ID NO:3。

2.2设计酶编码基因表达元件，通过转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032进行表达的基因排列组合实验对比，筛选出酶scpA、scpB和scpC基因的启动子皆为Psod，终止子选择为rrnBT1T2，串联形成基因簇scpABC。

2.3通过使用不同质粒转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032进行基因簇scpABC表达的实验对比，选择pEKEX2作为表达基因簇scpABC的质粒载体。设计质粒pEKEX2-ScpABC的结构和核苷酸序列SEQ ID NO:4，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行全基因合成。

实施例3：构建ATCC13032(Δldh)/pEKEX2-ScpABC菌株

按照实施例1.2的方法，制备ATCC13032(Δldh)感受态细胞，然后将pEKEX2-ScpABC质粒转入ATCC13032(Δldh)菌株中，BHIS平板筛选(kan 50mg/L)，转化平板长出单菌落即为目的菌株，其基因型为ATCC13032(Δldh)/pEKEX2-ScpABC。挑单克隆接BHI试管(kan50mg/L)，30℃过夜培养，20％甘油保菌。

实施例4：工程菌发酵实验

将实施例3构建的ATCC13032Δldh/pEKEX2-ScpABC菌株进行BHI平板(kan 50mg/L)划线活化，挑单克隆接BHI试管(kan 50mg/L)，30℃、220rpm振荡培养14h左右，按照5v/v％接种量转接盛有50mL种子培养基的500ml摇瓶(kan 50mg/L)，30℃220rpm振荡培养7h。将摇瓶培养液按10v/v％接种量接种盛有200mL发酵培养基的2L发酵罐(kan50mg/L)，控制发酵温度30℃，溶氧维持30％，5N氢氧化钠维持pH7.0，发酵6h，此时菌体增殖进入对数生长期后期；然后关闭发酵罐通气阀门，搅拌速度维持100rpm，继续发酵42h，停止发酵。发酵液进行丙酸、乳酸和丁二酸HPLC检测，发酵液含丙酸20.3g/L，丁二酸8.5g/L，检测不到乳酸。

实施例5：制备丙酸钙

将发酵液3000g离心5min，去除菌体，上清液用膜分离技术浓缩10倍，加入6N盐酸调节pH到2.5左右，然后于温度60℃，压强-0.08Mpa条件下进行减压蒸馏，以回收丙酸。回收的丙酸中缓慢加入20wt％氢氧化钙溶液进行中和反应，将pH回调至7.5，然后直接进行喷雾干燥，获得丙酸钙晶体。

应理解，上述实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读了本发明的构思之后，对其做出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 一种构建丙酸生产菌的方法

<130> SHPI2110305

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgtctaacg tgcaggagtg gcaacagctt gccaacaagg aattgagccg tcgggagaaa 60

actgtcgact cgctggttca tcaaaccgcg gaagggatcg ccatcaagcc gctgtatacc 120

gaagccgatc tcgataatct ggaggtgaca ggtacccttc ctggtttgcc gccctacgtt 180

cgtggcccgc gtgccactat gtataccgcc caaccgtgga ccatccgtca gtatgctggt 240

ttttcaacag caaaagagtc caacgctttt tatcgccgta acctggccgc cgggcaaaaa 300

ggtctttccg ttgcgtttga ccttgccacc caccgtggct acgactccga taacccgcgc 360

gtggcgggcg acgtcggcaa agcgggcgtc gctatcgaca ccgtggaaga tatgaaagtc 420

ctgttcgacc agatcccgct ggataaaatg tcggtttcga tgaccatgaa tggcgcagtg 480

ctaccagtac tggcgtttta tatcgtcgcc gcagaagagc aaggtgttac acctgataaa 540

ctgaccggca ccattcaaaa cgatattctc aaagagtacc tctgccgcaa cacctatatt 600

tacccaccaa aaccgtcaat gcgcattatc gccgacatca tcgcctggtg ttccggcaac 660

atgccgcgat ttaataccat cagtatcagc ggttaccaca tgggtgaagc gggtgccaac 720

tgcgtgcagc aggtagcatt tacgctcgct gatgggattg agtacatcaa agcagcaatc 780

tctgccggac tgaaaattga tgacttcgct cctcgcctgt cgttcttctt cggcatcggc 840

atggatctgt ttatgaacgt cgccatgttg cgtgcggcac gttatttatg gagcgaagcg 900

gtcagtggat ttggcgcaca ggacccgaaa tcactggcgc tgcgtaccca ctgccagacc 960

tcaggctgga gcctgactga acaggatccg tataacaacg ttatccgcac caccattgaa 1020

gcgctggctg cgacgctggg cggtactcag tcactgcata ccaacgcctt tgacgaagcg 1080

cttggtttgc ctaccgattt ctcagcacgc attgcccgca acacccagat catcatccag 1140

gaagaatcag aactctgccg caccgtcgat ccactggccg gatcctatta cattgagtcg 1200

ctgaccgatc aaatcgtcaa acaagccaga gctattatcc aacagatcga cgaagccggt 1260

ggcatggcga aagcgatcga agcaggtctg ccaaaacgaa tgatcgaaga ggcctcagcg 1320

cgcgaacagt cgctgatcga ccagggcaag cgtgtcatcg ttggtgtcaa caagtacaaa 1380

ctggatcacg aagacgaaac cgatgtactt gagatcgaca acgtgatggt gcgtaacgag 1440

caaattgctt cgctggaacg cattcgcgcc acccgtgatg atgccgccgt aaccgccgcg 1500

ttgaacgccc tgactcacgc cgcacagcat aacgaaaacc tgctggctgc cgctgttaat 1560

gccgctcgcg ttcgcgccac cctgggtgaa atttccgatg cgctggaagt cgctttcgac 1620

cgttatctgg tgccaagcca gtgtgttacc ggcgtgattg cgcaaagcta tcatcagtct 1680

gagaaatcgg cctccgagtt cgatgccatt gttgcgcaaa cggagcagtt ccttgccgac 1740

aatggtcgtc gcccgcgcat tctgatcgct aagatgggcc aggatggaca cgatcgcggc 1800

gcgaaagtga tcgccagcgc ctattccgat ctcggtttcg acgtagattt aagcccgatg 1860

ttctctacac ctgaagagat cgcccgcctg gccgtagaaa acgacgttca cgtagtgggc 1920

gcatcctcac tggctgccgg tcataaaacg ctgatcccgg aactggtcga agcgctgaaa 1980

aaatggggac gcgaagatat ctgcgtggtc gcgggtggcg tcattccgcc gcaggattac 2040

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<210> 2

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtcttatc agtatgttaa cgttgtcact atcaacaaag tggcggtcat tgagtttaac 60

tatggccgaa aacttaatgc cttaagtaaa gtctttattg atgatcttat gcaggcgtta 120

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tatgatgatc cattgcgtca aatcacccgc atgatccaaa aattcccgaa accgatcatt 300

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cattaa 786

<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列()

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atggaaactc agtggacaag gatgaccgcc aatgaagcgg cagaaattat ccagcataac 60

gacatggtgg catttagcgg ctttaccccg gcgggttcgc cgaaagccct acccaccgcg 120

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gtcaaagtga tcatcaccga acaagggatc gccgatctgc gcggtctttc cccgcttcaa 1320

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

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ctgccgcaac acctatattt acccaccaaa accgtcaatg cgcattatcg ccgacatcat 840

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tacacgccgt ttcagatgtt ggatatgttg gccgatcaaa gcgacgccgg cgaggatatg 11280

gacgctgttt tggtggctcg gtggcgtgag tatgaggttg gttctaaaaa cctgcgttcg 11340

tcctggtcac gtggggctaa gcgtgctttg ggcattgatt acatagacgc tgatgtacgt 11400

cgtgaaatgg aagaagaact gtacaagctc gccggtctgg aagcaccgga acgggtcgaa 11460

tcaacccgcg ttgctgttgc tttggtgaag cccgatgatt ggaaactgat tcagtctgat 11520

ttcgcggtta ggcagtacgt tctagattgc gtggataagg ctaaggacgt ggccgctgcg 11580

caacgtgtcg ctaatgaggt gctggcaagt ctgggtgtgg attccacccc gtgcatgatc 11640

gttatggatg atgtggactt ggacgcggtt ctgcctactc atggggacgc tactaagcgt 11700

gatctgaatg cggcggtgtt cgcgggtaat gagcagacta ttcttcgcac ccactaaaag 11760

cggcataaac cccgttcgat attttgtgcg atgaatttat ggtcaatgtc gcgggggcaa 11820

actatgatgg gtcttgttgt tgacaatggc tgatttcatc aggaatggaa ctgtcatgct 11880

gttatgtgcc tggctcctaa tcaaagctgg ggacaatggg ttgccccgtt gatctgatct 11940

agttcggatt ggcggggctt cactgtatct gggggtggca tcgtgaatag attgcacacc 12000

gtagtgggca gtgtgcacac catagtggcc atgagcacca ccacccccag ggacgccgac 12060

ggcgcgaagc tctgcgcctg gtgcggctcg gagatcaagc aatccggcgt cggccggagc 12120

cgggactact gccgccgctc ctgccgccag cgggcgtacg aggcccggcg ccagcgcgag 12180

gcgatcgtgt ccgccgtggc gtcggcagtc gctcgccgag atacgtcacg tgacgaaatg 12240

cagcagcctt ccattccgtc acgtgacgaa actcgggccg caggtcagag cacggttccg 12300

cccgctccgg ccctgccgga cccccggcat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa 12360

ccaagcctat gcctacagca tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt 12420

tagatttcat acacggtgcc tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt 12480

aaagcttatc gatgataagc tgtcaaacat ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg 12540

cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag 12600

gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 12660

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 12720

ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 12780

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 12840

accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc 12900

gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc 12960

atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga 13020

atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa 13080

cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg 13140

cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag 13200

acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg 13260

tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc 13320

gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 13380

agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga 13440

ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg 13500

ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa 13560

acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct 13620

gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg 13680

cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg caccattcga tggtgtcaac gtaaatgcat 13740

gccgcttcgc cttcgcgcgc gaattgcaag ctgatccggg cttatcgact gcacggtgca 13800

ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa 13860

tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc 13920

gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct 13980

cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag aattaaaaga 14040

tatgaccatg attacgcc 14058

<210> 5

<211> 7313

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 60

ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 120

aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 180

tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 240

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 300

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 360

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 420

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 480

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactccaaga cgaggcagcg 540

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 600

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 660

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 720

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 780

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 840

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcggatgc ccgacggcga ggatctcgtc 900

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 960

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 1020

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 1080

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 1140

gcgggactct ggggttcgct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 1200

ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 1260

aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 1320

attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 1380

agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 1440

aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 1500

gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 1560

tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 1620

agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 1680

ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 1740

ataaggaaac atacggcatt tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac 1800

agcaaaaaaa tgaaaaatat caagtttctg aatttgattc gtccacaatt aaaaatatct 1860

cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 1920

tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 1980

atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 2040

aaaacgctgg ccgcgtcttt aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa 2100

aagaccaaac acaagaatgg tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt 2160

tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 2220

ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 2280

tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 2340

acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 2400

aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 2460

tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 2520

ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 2580

agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 2640

taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 2700

ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 2760

ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 2820

tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 2880

ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 2940

cagacaaaca atcaacgttt gcgccgagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 3000

ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca 3060

aaagaaaatg ccgatgggta ccgagcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 3120

cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 3180

gggacgccct cgcggacgtg ctcatagtcc acgacgcccg tgattttgta gccctggccg 3240

acggccagca ggtaggccga caggctcatg ccggccgccg ccgccttttc ctcaatcgct 3300

cttcgttcgt ctggaaggca gtacaccttg ataggtgggc tgcccttcct ggttggcttg 3360

gtttcatcag ccatccgctt gccctcatct gttacgccgg cggtagccgg ccagcctcgc 3420

agagcaggat tcccgttgag caccgccagg tgcgaataag ggacagtgaa gaaggaacac 3480

ccgctcgcgg gtgggcctac ttcacctatc ctgcccggct gacgccgttg gatacaccaa 3540

ggaaagtcta cacgaaccct ttggcaaaat cctgtatatc gtgcgaaaaa ggatggatat 3600

accgaaaaaa tcgctataat gaccccgaag cagggttatg cagcggaaaa gcgctgcttc 3660

cctgctgttt tgtggaatat ctaccgactg gaaacaggca aatgcaggaa attactgaac 3720

tgaggggaca ggcgagagac gatgccaaag agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 3780

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 3840

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 3900

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc 3960

gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg 4020

cttctgtttc tatcagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat 4080

cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc 4140

caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg 4200

aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg gcgcaaagtg cgtcgggtga tgctgccaac 4260

ttactgattt agtgtatgat ggtgtttttg aggtgctcca gtggcttctg tttctatcag 4320

ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaaaagg 4380

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4440

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4500

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4560

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4620

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4680

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4740

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4800

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4860

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4920

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4980

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5040

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5100

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5160

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5220

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 5280

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 5340

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 5400

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 5460

ggaaacagct atgacatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagagtcg 5520

acctgcaggg tttcgtcgcg ggttactcgt gcgcgaccta cttctgcgcc tggggcgatt 5580

tcgccggtgc gtacttttgg tccggcgagg tccatgctga cgcggatttc ccggccaact 5640

tcttctgcaa cggtgtggac gttgtcgatc atctgcttcc agacggtttc atcgtcgtgt 5700

gcacagttga tgcgagctag attcatgccg cttttggcga agccacggac aagttcaatg 5760

tcggtggcgg cttcggtggg cagggtgacc atgatgcagg atggagtatc cggtaggggt 5820

tcgccaagga gaatttcggc gtgctcgtcg agaatctcat cggcatcttc gaaggcatcg 5880

acgacatctg agggtggata aagtgggcct tcacctgcga aagctccgat aacattgcgg 5940

gcggccttga ggcgggcctg cactgctggt tcggtggtag tcaagcgggt agctcccaca 6000

gaggagaggc gttgctgcag gccacggagg tctttggtgc gaagatgcgc gtaatgcatg 6060

aggttgcggg caccaacgta atgggttggg gagacctgcc cgatggcctc gctgtgagtt 6120

tgtgtcacct catcaagttc tagaattaac tcgtcgagtt cagtcttgat ctcctggaga 6180

atgtcctggt caaactcatt catttgagct ccttaagcta caaacactct aaattccatc 6240

caacagtttc attgtgcccg taaaccaaaa agttggcagc gcaagtgttc caatgaaaca 6300

cttgcgtcgc caactaggcg ccaaagatca acccacaaag cagctcagaa aatcagcaag 6360

agcttgtgcc cggattcctt tgttacacct ttaattatgc ccgattatgt ccgaaaatgt 6420

ggtcagacca agtgttattt ttgttgaaaa aatcacattg taaatcgagc aaaaccaacc 6480

tatgccctgc agaattgtgc atgctctgcc aagatgactc aatatggttt cgctccccag 6540

actagcgtct ctgctcacca ctcgcctggc aacgcttaaa cccgcactaa aacctgccac 6600

ccacctcgcc tccctcggcg cgcaggtcat tgcagagcta gttccgggga tccgaatgtc 6660

gccaaaccgc aggcgaatcc tccctgcaaa tatgggcgct ggctttatcg gagcggaaat 6720

cgcaatgtgg tgggctctct cgccgtcatt gttgccgaaa ccgtggtggg ttacggctgc 6780

taacctggct gttttacaag cggtggggca tgcggcagcg acgggaatcc actcgatcct 6840

ccccagaacc aaccggcggg tatccaggaa aatttacaac gccacccaca tcgcaactgg 6900

tgccatcacg ttgaccacca cggttgtggg attgatcagg catcgcaccc aaatccggct 6960

gattgggcag aagaattttg gaccgaagga gacgatcgcg ggcattagtg tcggcacctt 7020

ggggtacggc gcgctgctga tcaccggcga attaacccag cacagtatta atgaggtcaa 7080

gctcctaatt gagaggtttt taccgccgtg gataagtttc atcgcagcaa gcttggcact 7140

ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 7200

tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 7260

ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgataa gctagcttca cgc 7313

Claims (8)

1.一种丙酸生产菌，其特征在于，通过包括以下步骤的方法构建：

A.中断谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶ldh基因，得到菌株A，其中ldh的NCBI登录号为NP_602100.1；

B.构建用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A变位酶scpA基因表达元件、大肠杆菌来源的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶scpB基因表达元件、大肠杆菌来源的丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶scpC基因表达元件，并将这三个基因表达元件分别或者共同克隆入用于在谷氨酸棒杆菌菌株中表达的质粒载体中，得到基因表达质粒，其中scpA的NCBI登录号为NP_417392.1，scpB的NCBI登录号为NP_311816.2，scpC的NCBI登录号为NP_417396.4；

C.将步骤B中得到的基因表达质粒转入步骤A中得到的菌株A中，筛选基因组中整合了所述scpA、scpB和scpC编码基因的阳性克隆即菌株C；

D.从菌株C中筛选出厌氧条件下生产丙酸的工程菌，其中

步骤A是敲除谷氨酸棒杆菌基因组中乳酸脱氢酶ldh基因，

步骤B中每个基因表达元件包括启动子Psod、编码基因序列、终止子rrnBT1T2，

甲基丙二酰辅酶A变位酶scpA编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；甲基丙二酰辅酶A脱羧酶scpB编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；丙酰辅酶A：琥珀酰辅酶A转移酶scpC编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，

步骤B中三个基因表达元件克隆入同一个质粒载体pEKEX2中，得到pEKEX2-ScpABC质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

2.如权利要求1所述的丙酸生产菌，其特征在于，宿主谷氨酸棒杆菌是谷氨酸棒杆菌ATCC13032。

3.如权利要求1所述的丙酸生产菌，其特征在于，步骤D中筛选出的工程菌发酵时不生产乳酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的丙酸生产菌在生产丙酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，通过菌株的发酵来生产丙酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，丙酸生产菌先进行通气发酵即有氧发酵，菌体增殖接近或者进入平台期时开始厌氧发酵。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵得到的丙酸制备成丙酸钙。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵结束后，离心去除菌体，上清液浓缩，调节pH至2.5，减压蒸馏回收丙酸，回收丙酸中加入氢氧化钙溶液，将pH调至7.5，喷雾干燥，获得丙酸钙晶体。

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