CN107674889B - 一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶反应合成1,2,4‑丁三醇的方法，其特征在于，以D‑木糖脱氢酶、D‑木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D‑木糖转化为D‑1,2,4‑丁三醇；所述反应体系包括如下组分：50mM PBS(NaHPO₄、NaH₂PO₄)、MgCl₂6mM、NAD⁺0.5mM、NADH 0.5mM、TPP 0.4mM。本发明通过控制各个酶的酶量，提高了体外合成丁三醇的能力，解决了微生物法合成法带来的副产物多，后续分离工艺复杂等不利影响。

Description

一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法。

背景技术

D-1,2,4-丁三醇是无色无味、透明、粘稠的四碳多元醇。工业用的D-1,2,4-丁三醇是重要的有机合成中间体，广泛应用于医药、农业、化妆品、造纸、高分子材料、烟草、军工等领域。D-1,2,4-丁三醇的硝基化合物冲击敏感性低、热稳定性好、低毒性、吸湿性好，与其它含能增塑剂混合使用，可显著提高以硝化纤维素为基火药的低温力学性能。

目前国内外1,2,4-丁三醇的生产主要通过化学合成实现，但化学法反应条件严苛、成本高、生成副产物多等一系列弊端限制其大规模生产。随着DNA技术和合成生物学的发展，生物转化合成丁三醇具有反应条件温和、过程安全环保的优点，不论是对环境还是经济都有很大的意义。

2003年，Niu^[8]等在大肠杆菌中构建了异源代谢途径，利用氧化酶氧化D-木糖生成D-木糖酸，产率70％，D-木糖酸再经催化生成D-1,2,4-丁三醇，产率为25％，由木糖到丁三醇的总产率为17.5％。Frost等利用木糖途径生产丁三醇，不敲除任何副产物途径，丁三醇的产量仅有0.08g/L。Kris等敲除了木糖醇的副产物途径后，产量0.25g/L，这两种情况丁三醇转化效率较低。

虽然微生物法合成丁三醇研究的较为广泛，但是由于微生物的代谢途径复杂，且发酵过程不易调控，副产物多等多种因素，导致丁三醇的产量、产率低且后续的分离工艺较为复杂。通过无细胞体外纯酶反应，可以在体外建立最佳反应体系，通过添加辅因子，控制各个酶的酶量，研究最佳反应条件如温度、pH、金属离子等，最终获得产物丁三醇。体外纯酶反应具有反应条件易控制，无底物、中间产物的毒性问题，能获得更高的产品得率和纯度，其工业化前景巨大。目前尚未有文献报道以木糖为底物，利用纯酶进行体外反应获得D-1,2,4-丁三醇。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，以解决现有技术中D-1,2,4-丁三醇生产成本高、转化率低的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，以D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇；

所述反应体系包括如下组分：20～100mM PBS(NaHPO₄、NaH₂PO₄)、MgCl₂ 1～10 mM、NAD⁺0.1～0.8mM、NADH 0.1～0.8mM、TPP 0.1～0.6mM；

D-木糖脱氢酶催化木糖生成D-木糖酸；D-木糖酸脱水酶催化D-木糖酸生成3-脱氧-D-甘油戊酮酸；苯甲酰甲酸脱羧酶催化3-脱氧-D-甘油戊酮酸生成D-3,4-二羟基丁醛；醇脱氢酶催化D-3,4-二羟基丁醛生成D-1,2,4-丁三醇。

作为优选，所述D-木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；D-木糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；苯甲酰甲酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述D-木糖脱氢酶的含量为200～400U/mL，所述D-木糖酸脱水酶的含量为100～300U/mL，苯甲酰甲酸脱羧酶的含量为100～300U/mL，醇脱氢酶的含量为 200～350U/mL。

D-木糖脱氢酶：每分钟转化1μmol木糖所需要的酶量。

D-木糖脱水酶：每分钟转化1μmol木糖酸所需要的酶量。

苯甲酰甲酸脱羧酶：每分钟转化1μmol苯甲酰甲酸所需要的酶量。

醇脱氢酶：每分钟转化1μmol乙醛所需要的酶量。

其中，催化反应的温度为37℃，反应时间为12～24h。

其中，所述的D-木糖的浓度为10～40g/L，D-木糖的浓度优选为20g/L。

其中，所述D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的制备方法如下：

(1)将SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列分别导入质粒中，得到重组质粒，然后将重组质粒分别转化宿主菌，得到重组菌；

(2)在重组菌中分别诱导表达D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶；

(3)利用超声波破碎仪破碎各重组菌菌体，分别收集粗酶液，再利用镍柱对D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶进行纯化，收集纯化后的酶液，利用超滤管对其进行除盐和浓缩，即分别得到D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶。

步骤(3)中，利用镍柱纯化D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的方法如下：

利用PBS将菌重悬，超声破碎后得到各个酶的粗酶液。将粗酶液液从镍柱中流出，使蛋白结合在镍柱上，然后利用结合缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；

所述的结合缓冲液的配方如下：20mM Tris、0.5M NaCl、50mM咪唑，HCl调至pH7.0；

所述的洗脱缓冲液的配方如下：20mM Tris、0.5M NaCl、500mM咪唑、HCl调至 pH7.0。

步骤(1)中，所述的质粒为PRSF Duet-1。

步骤(1)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

有益效果：

本发明构建的方法实现了在体外利用纯酶反应以D-木糖为原料合成1,2,4-丁三醇；通过控制各个酶的酶量，提高了体外合成丁三醇的能力，可以避免微生物法合成法带来的副产物多，后续分离工艺复杂等不利影响；本发明可以对各个酶的酶学性质进行研究，找到合成途径中的关键酶，为体内合成丁三醇提供依据；体外纯酶反应可以缩短生产周期，本发明仅需要12h即可获得产物，而微生物发酵法则最少需要48h，本发明有效缩短了反应时间。

附图说明

图1为D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的蛋白电泳图，M：Marker；L1：D-木糖脱氢酶xylB(28KD)；L2：D-木糖酸脱水酶xylD(66KD)； L3：苯甲酰甲酸脱羧酶mdlC(58KD)；L4：醇脱氢酶adhP(35KD)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中所用的D-木糖脱氢酶是来自新月柄杆菌的基因，D-木糖酸脱水酶是来自新月柄杆菌的基因，苯甲酰甲酸脱羧酶是来自恶臭假单胞菌，醇脱氢酶基因是来自大肠杆菌的基因。D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶和醇脱氢酶分别经过密码子优化，将各基因分别连接到PRSFDuet-1表达载体上，转化至大肠杆菌 BL21(DE3)；得到阳性克隆培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加IPTG终浓度为0.5mM，33℃培养8-10h。

实施例1：

1,2,4-丁三醇体外合成相关的纯酶液制备，具体步骤如下：

(1)在D-木糖脱氢酶xylB基因5’端和3’端分别引入酶切位点BamHI和HindIII，对xylB基因和PRSFDuet-1进行双酶切，然后将xylB基因连接到PRSFDuet-1载体上；

(2)在D-木糖酸脱水酶xylD基因的5’端和3^’端引物引入酶切位点BamHI和XhoI，对xylD基因和PRSFDuet-1进行双酶切，然后将xylD基因连接到PRSFDuet-1载体上；

(3)在苯甲酰甲酸脱羧酶mdlC基因的5^’端和3^’端引入酶切位点BamHI和SacI；对mdlC基因和PRSFDuet-1进行双酶切，然后将mdlC基因连接到PRSFDuet-1载体上；

(4)在醇脱氢酶adhP基因的5^’端和3’端引入酶切位点BamHI和HindIII，对adhP 基因和PRSFDuet-1进行双酶切，然后将adhP基因连接到PRSFDuet-1载体上；

(5)将步骤(1)、(2)、(3)、(4)构建的相应的四个重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性克隆进行培养；

(6)将步骤(5)得到的重组大肠杆菌阳性克隆分别接种于100mL LB培养基中，摇床37℃200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，33℃培养 8～10h，25℃6000rpm离心10min收集菌体，用pH 7.0PBS缓冲液洗涤两次。超声破碎：在功率40％，处理10min，破碎后在4℃，6000rpm离心10min，收集上清，再将收集后的粗酶液再次离心，收集上清。镍柱纯化，是利用结合缓冲液将带有组氨酸标签的蛋白结合到镍柱上，再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来。超滤，是利用Millipore 10kDa的超滤管将洗脱得到的纯酶液在4℃，6000rpm离心10min，反复多次，并且在每次离心后加水，对酶液进行除盐和浓缩。纯酶液蛋白含量用酶标仪检测，并进行 SDS-PAGE检测，如图1所示。

实施例2：

D-1,2,4-丁三醇体外合成,具体步骤如下：

反应体系：D-木糖脱氢酶的浓度为350U/mL，所述D-木糖酸脱水酶的浓度为 250U/mL，苯甲酰甲酸脱羧酶的浓度为200U/mL，醇脱氢酶的浓度为300U/mL。

PBS(NaHPO₄、NaH₂PO₄)50mM pH7.0，木糖20g/L，MgCl₂ 6mM，NAD⁺0.5 mM，NADH0.5mM，TPP 0.4mM；最后补加PBS至10mL，反应温度为37℃，反应时间为24h，得到产物D-1,2,4-丁三醇。

按实施例2的体外合成体系，用高效液相色谱检测1,2,4-丁三醇，最终产量为12g/L，产率为85％。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)

<400> 2

atgtcttctg ctatctaccc gtctctgaaa ggtaaacgtg ttgttatcac cggtggtggt 60

tctggtatcg gtgctggtct gaccgctggt ttcgctcgtc agggtgctga agttatcttc 120

ctggacatcg ctgacgaaga ctctcgtgct ctggaagctg aactggctgg ttctccgatc 180

ccgccggttt acaaacgttg cgacctgatg aacctggaag ctatcaaagc tgttttcgct 240

gaaatcggtg acgttgacgt tctggttaac aacgctggta acgacgaccg tcacaaactg 300

gctgacgtta ccggtgctta ctgggacgaa cgtatcaacg ttaacctgcg tcacatgctg 360

ttctgcaccc aggctgttgc tccgggtatg aaaaaacgtg gtggtggtgc tgttatcaac 420

ttcggttcta tctcttggca cctgggtctg gaagacctgg ttctgtacga aaccgctaaa 480

gctggtatcg aaggtatgac ccgtgctctg gctcgtgaac tgggtccgga cgacatccgt 540

gttacctgcg ttgttccggg taacgttaaa accaaacgtc aggaaaaatg gtacaccccg 600

gaaggtgaag ctcagatcgt tgctgctcag tgcctgaaag gtcgtatcgt tccggaaaac 660

gttgctgctc tggttctgtt cctggcttct gacgacgctt ctctgtgcac cggtcacgaa 720

tactggatcg acgctggttg gcgttaa 747

<210> 2

<211> 1776

<212> DNA

<213> 新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)

<400> 2

atgtctaacc gtaccccgcg tcgtttccgt tctcgtgact ggttcgacaa cccggaccac 60

atcgacatga ccgctctgta cctggaacgt ttcatgaact acggtatcac cccggaagaa 120

ctgcgttctg gtaaaccgat catcggtatc gctcagaccg gttctgacat ctctccgtgc 180

aaccgtatcc acctggacct ggttcagcgt gttcgtgacg gtatccgtga cgctggtggt 240

atcccgatgg aattcccggt tcacccgatc ttcgaaaact gccgtcgtcc gaccgctgct 300

ctggaccgta acctgtctta cctgggtctg gttgaaaccc tgcacggtta cccgatcgac 360

gctgttgttc tgaccaccgg ttgcgacaaa accaccccgg ctggtatcat ggctgctacc 420

accgttaaca tcccggctat cgttctgtct ggtggtccga tgctggacgg ttggcacgaa 480

aacgaactgg ttggttctgg taccgttatc tggcgttctc gtcgtaaact ggctgctggt 540

gaaatcaccg aagaagaatt catcgaccgt gctgcttctt ctgctccgtc tgctggtcac 600

tgcaacacca tgggtaccgc ttctaccatg aacgctgttg ctgaagctct gggtctgtct 660

ctgaccggtt gcgctgctat cccggctccg taccgtgaac gtggtcagat ggcttacaaa 720

accggtcagc gtatcgttga cctggcttac gacgacgtta aaccgctgga catcctgacc 780

aaacaggctt tcgaaaacgc tatcgctctg gttgctgctg ctggtggttc taccaacgct 840

cagccgcaca tcgttgctat ggctcgtcac gctggtgttg aaatcaccgc tgacgactgg 900

cgtgctgctt acgacatccc gctgatcgtt aacatgcagc cggctggtaa atacctgggt 960

gaacgtttcc accgtgctgg tggtgctccg gctgttctgt gggaactgct gcagcagggt 1020

cgtctgcacg gtgacgttct gaccgttacc ggtaaaacca tgtctgaaaa cctgcagggt 1080

cgtgaaacct ctgaccgtga agttatcttc ccgtaccacg aaccgctggc tgaaaaagct 1140

ggtttcctgg ttctgaaagg taacctgttc gacttcgcta tcatgaaatc ttctgttatc 1200

ggtgaagaat tccgtaaacg ttacctgtct cagccgggtc aggaaggtgt tttcgaagct 1260

cgtgctatcg ttttcgacgg ttctgacgac taccacaaac gtatcaacga cccggctctg 1320

gaaatcgacg aacgttgcat cctggttatc cgtggtgctg gtccgatcgg ttggccgggt 1380

tctgctgaag ttgttaacat gcagccgccg gaccacctgc tgaaaaaagg tatcatgtct 1440

ctgccgaccc tgggtgacgg tcgtcagtct ggtaccgctg actctccgtc tatcctgaac 1500

gcttctccgg aatctgctat cggtggtggt ctgtcttggc tgcgtaccgg tgacaccatc 1560

cgtatcgacc tgaacaccgg tcgttgcgac gctctggttg acgaagctac catcgctgct 1620

cgtaaacagg acggtatccc ggctgttccg gctaccatga ccccgtggca ggaaatctac 1680

cgtgctcacg cttctcagct ggacaccggt ggtgttctgg aattcgctgt taaataccag 1740

gacctggctg ctaaactgcc gcgtcacaac cactaa 1776

<210> 3

<211> 1587

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400> 3

atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60

ttcggtaacc cgggttctaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120

tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180

tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240

gctctgtcta acgcttggaa ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300

cgtgctatga tcggtgttga agctctgctg accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360

ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420

cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480

gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540

tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600

tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660

gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720

ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780

tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840

caccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900

gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960

atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020

ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080

accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140

gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200

ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260

caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320

gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtgct 1380

ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440

atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500

gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560

gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

atgaaggctg cagttgttac gaaggatcat catgttgacg ttacgtataa aacactgcgc 60

tcactgaaac atggcgaagc cctgctgaaa atggagtgtt gtggtgtatg tcataccgat 120

cttcatgtta agaatggcga ttttggtgac aaaaccggcg taattctggg ccatgaaggc 180

atcggtgtgg tggcagaagt gggtccaggt gtcacctcat taaaaccagg cgatcgtgcc 240

agcgtggcgt ggttctacga aggatgcggt cattgcgaat actgtaacag tggtaacgaa 300

acgctctgcc gttcagttaa aaatgccgga tacagcgttg atggcgggat ggcggaagag 360

tgcatcgtgg tcgccgatta cgcggtaaaa gtgccagatg gtctggactc ggcggcggcc 420

agcagcatta cctgtgcggg agtcaccacc tacaaagccg ttaagctgtc aaaaattcgt 480

ccagggcagt ggattgctat ctacggtctt ggcggtctgg gtaacctcgc cctgcaatac 540

gcgaagaatg tctttaacgc caaagtgatc gccattgatg tcaatgatga gcagttaaaa 600

ctggcaaccg aaatgggcgc agatttagcg attaactcac acaccgaaga cgccgccaaa 660

attgtgcagg agaaaactgg tggcgctcac gctgcggtgg taacagcggt agctaaagct 720

gcgtttaact cggcagttga tgctgtccgt gcaggcggtc gtgttgtggc tgtcggtcta 780

ccgccggagt ctatgagcct ggatatccca cgtcttgtgc tggatggtat tgaagtggtc 840

ggttcgctgg tcggcacgcg ccaggattta actgaagcct tccagtttgc cgccgaaggt 900

aaagtggtgc cgaaagtcgc cctgcgtccg ttagcggaca tcaacaccat ctttactgag 960

atggaagaag gcaaaatccg tggccgcatg gtgattgatt tccgtcacta a 1011

<210> 5

<211> 3829

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120

ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180

taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240

gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300

tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt 360

ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg 420

cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 480

cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaacctca ggcatttgag aagcacacgg 540

tcacactgct tccggtagtc aataaaccgg taaaccagca atagacataa gcggctattt 600

aacgaccctg ccctgaaccg acgacaagct gacgaccggg tctccgcaag tggcactttt 660

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 720

ccgctcatga attaattctt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 780

catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 840

ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 900

tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 960

atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca 1020

gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 1080

gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cggtcgctgt taaaaggaca 1140

attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 1200

ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt 1260

ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 1320

aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 1380

tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1440

cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 1500

gttggaattt aatcgcggcc tagagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcatactctt 1560

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 1620

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg catgcagcgc tcttccgctt cctcgctcac 1680

tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggtg tcagctcact caaaagcggt 1740

aatacggtta tccacagaat caggggataa agccggaaag aacatgtgag caaaaagcaa 1800

agcaccggaa gaagccaacg ccgcaggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1860

atcacaaaaa tcgacgctca agccagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1920

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1980

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgtt 2040

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2100

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2160

acgacttatc gccactggca gcagccattg gtaactgatt tagaggactt tgtcttgaag 2220

ttatgcacct gttaaggcta aactgaaaga acagattttg gtgagtgcgg tcctccaacc 2280

cacttacctt ggttcaaaga gttggtagct cagcgaacct tgagaaaacc accgttggta 2340

gcggtggttt ttctttattt atgagatgat gaatcaatcg gtctatcaag tcaacgaaca 2400

gctattccgt tactctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 2460

agccccatac gatataagtt gtaattctca tgttagtcat gccccgcgcc caccggaagg 2520

agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga 2580

gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 2640

gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 2700

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 2760

ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 2820

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 2880

accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc 2940

gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc 3000

atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga 3060

atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa 3120

cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg 3180

cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag 3240

acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg 3300

tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc 3360

gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 3420

agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga 3480

ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg 3540

ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa 3600

acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct 3660

gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg 3720

cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg 3780

ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa attaatacga ctcactata 3829

Claims (5)

1.一种酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，以D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶为催化剂，在反应体系中催化D-木糖转化为D-1,2,4-丁三醇；所述反应体系包括如下组分：20～100mM PBS、MgCl₂ 1～10mM、NAD⁺ 0.1～0.8mM、NADH0.1～0.8mM、TPP 0.1～0.6mM；

所述D-木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；D-木糖酸脱水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；苯甲酰甲酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示；醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示；

所述D-木糖脱氢酶的含量为200～400U/mL，所述D-木糖酸脱水酶的含量为100～300U/mL，苯甲酰甲酸脱羧酶的含量为100～300U/mL，醇脱氢酶的含量为200～350U/mL。

催化反应的温度为33～37℃，反应时间为12～24h；

所述的D-木糖的浓度为10～25g/L。

2.根据权利要求1所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的制备方法如下：

(1)将SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列分别导入质粒中，得到重组质粒，然后将重组质粒分别转化宿主菌，得到重组菌；

(2)在重组菌中分别诱导表达D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶；

(3)利用超声波破碎仪破碎各重组菌菌体，分别收集粗酶液，再利用镍柱对D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶进行纯化，收集纯化后的酶液，利用超滤管对其进行除盐和浓缩，即分别得到D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶。

3.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，利用镍柱纯化D-木糖脱氢酶、D-木糖酸脱水酶、苯甲酰甲酸脱羧酶、醇脱氢酶的方法如下： 利用PBS缓冲液分别将各重组菌重悬，超声破碎重组菌，得到4种酶的粗酶液，将粗酶液 分别从镍柱中流出，使蛋白结合在镍柱上，然后利用结合缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲 液洗脱目标蛋白；所述的结合缓冲液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、50mM咪唑，HCl调至pH7.0； 所述的洗脱缓冲液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、500mM咪唑、HCl调至pH7.0。

4.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的质粒为PRSF Duet-1。

5.根据权利要求2所述的酶反应合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

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