CN110819650A

CN110819650A - 一种产β-榄香烯工程菌株及应用

Info

Publication number: CN110819650A
Application number: CN201911167120.XA
Authority: CN
Inventors: 开国银; 黄超; 冯岳; 尤大伟; 张通; 范三鹏
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明公开了一种产β‑榄香烯工程菌株及其应用,产β‑榄香烯工程菌株通过将含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS的重组质粒和含酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因ERG20的重组质粒同时转化至E.coli BL21感受态细胞中构建获得。本发明利用构建的重组工程菌在TB培养基中发酵后合成了β‑榄香烯,经碳源、碳源浓度、诱导剂浓度、诱导时间、诱导OD₆₀₀优化后,β‑榄香烯产量达到1.17mg/L,相比于化学合成方法,本发明的工程菌能高效、无污染的产β‑榄香烯,适于工业化生产。

Description

一种产β-榄香烯工程菌株及应用

技术领域

本发明涉及中药生物技术领域,特别涉及一种产β-榄香烯菌株的构建及表达。

背景技术

β-榄香烯是中药温郁金的有效成分之一,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性。目前临床上广泛应用榄香烯注射液治疗肺癌、肝癌、食道癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤,具有毒副作用小,对正常细胞和周围白细胞影响较小的特点,且有助于化疗、放疗药物进入癌组织发挥作用。随着榄香烯市场需求的不断增加,利用传统的提取分离方法从天然植物温郁金中获得榄香烯已无法满足市场需求,且通过提取分离得到的产品存在得率少、纯度低等问题,二次分离所需成本高。而通过化学合成的方法合成榄香烯,需要用到如二氯甲烷、氰化钠、甲苯等剧毒化学试剂,不利于环境保护；且化学合成的反应条件较难达到,而产品得率也很低。

随着生物技术的发展,合成生物学受到越来越多的关注。通过在微生物底盘细胞中重组天然化合物的生物合成途径,来快速、大量的获取天然产物及其中间体,为植物天然活性产物的开发与应用提供了新的方法。比如在酿酒酵母中构建青蒿素的生物合成途径,其产量已达到25g/L。微生物具有生长速度快、发酵周期短、发酵成本低的优点,且相对于植物其遗传背景更清楚有利于遗传改造。合成β-榄香烯的倍半萜合酶来源广泛,许多菊科植物中都可扩增得到,虽然从苍耳中提取分离的主要化合物不含β-榄香烯,但是苍耳基因组含有编码吉玛烯A合酶的基因,故对苍耳中吉玛烯A合酶研究有助于进一步发掘β-榄香烯的来源。

发明内容

本发明的目的是构建来源于酿酒酵母法尼基焦磷酸合酶的编码基因(ERG20)的重组载体和来源于苍耳吉玛烯A合酶的编码基因(XsGAS)的重组载体。构建了含两个重组载体的大肠杆菌表达菌株,并通过优化碳源、诱导浓度、诱导时间、诱导OD₆₀₀等条件提高β-榄香烯的产量。

为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下：

一种产β-榄香烯工程菌株,该工程菌株通过如下步骤构建获得：

(1)构建含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS的重组质粒：

(1.1)扩增一个苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS,其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(1.2)将步骤(1.1)扩增得到的苍耳来源的倍半萜合酶基因XsGAS与pRSFDuet-1载体连接,将重组载体转化至E.coli JM109感受态细胞中,在无抗性的LB培养基中37℃,200rpm培养1h,离心取沉淀后涂布于含50mg/L Kan抗性37℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行PCR并送测序鉴定,将构建成功的菌株提取重组质粒,即获得含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因的pRSFDuet-XsGAS重组质粒；pRSFDuet-1载体的序列如SEQ ID NO.3所示,pRSFDuet-XsGAS重组质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

(2)构建含酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因ERG20的重组质粒：

(2.1)扩增一个酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因ERG20,其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

(2.2)将步骤(2.1)扩增得到的酿酒酵母来源的磷酸合酶基因ERG20与pACYCDuet-1载体连接,将重组载体转化至E.coli JM109感受态细胞中,在无抗性的LB培养基中37℃,200rpm培养1h,离心取沉淀后涂布于含34mg/L Cm抗性的LB固体培养基上,37℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行PCR并送测序鉴定,将构建成功的菌株提取重组质粒,即获得含酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因的pACYCDuet-ERG20重组质粒；pACYCDuet-1载体的序列如SEQ ID NO.7所示,pACYCDuet-ERG20重组质粒的序列如SEQ ID NO.8所示。

(3)将步骤(1.2)和步骤(2.2)获得的两个重组质粒pRSFDuet-XsGAS和pACYCDuet-ERG20同时转化至E.coli BL21感受态细胞中,在无抗性的LB培养基中37℃,200rpm培养1h,离心取沉淀后涂布于同时含50mg/L Kan抗性和34mg/L Cm抗性的LB固体培养基上,37℃培养箱过夜培养后挑取单克隆在含50mg/L Kan抗性和34mg/L Cm抗性的LB中培养7-8h后进行保藏,即获得产β-榄香烯工程菌株E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20。

本发明还提供了一种上述产β-榄香烯工程菌株的应用,通过诱导工程菌株中苍耳倍半萜合酶XsGAS表达生产β-榄香烯,具体为：将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至含5-40g/L碳源的TB培养基中培养至OD₆₀₀为0.3-1.2,加入IPTG诱导,IPTG在TB培养基中的终浓度为0.01-1.2mM,20℃发酵24-60h。

进一步地,所述的碳源为甘油,甘油浓度为15g/L,OD₆₀₀为0.6,IPTG终浓度为0.4mM,发酵时间为48h。

本发明的有益效果是：本发明将将两个重组质粒pRSFDuet-XsGAS和pACYCDuet-ERG20同时转化至E.coli BL21感受态细胞中构建了同时含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因和含酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因的工程菌株,该工程菌株可用于产β-榄香烯,在以15g/L甘油为碳源,发酵温度为20℃,诱导剂浓度为0.04mM,诱导OD₆₀₀为0.6的发酵条件下,β-榄香烯的产量高达1.17mg/L,本发明的工程菌能高效、无污染的产β-榄香烯,适于工业化生产。

附图说明

图1 XsGAS重组载体谱图(a),ERG20重组载体谱图(b)；

图2 SDS-PAGE分析重组工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20经IPTG诱导后的蛋白表达结果(M:Marker；1:pRSFDuet-1/pACYCDuet-1；2:pACYCDuet-ERG20/pRSFDuet-1；3:pACYCDuet-1/pRSFDuet-XsGAS；3:pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20)；

图3β-榄香烯标准品(a)与工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20催化产物(b)的GC-MS分析图；

图4不同碳源对产物的影响；

图5碳源浓度对产物的影响；

图6发酵时间对产物的影响；

图7 IPTG浓度对产物的影响；

图8诱导OD₆₀₀对产物的影响。

具体实施方式

下述实施例中,采用的pRSFDuet-1载体、pACYCDuet-1购自于上海生工生物有限公司,但不限于此。

E.coli JM109感受态细胞、E.coli BL21感受态细胞按Takara的Competent CellPreparation Kit说明书制备,具体步骤如下：

1.使用无抗性LB平板培养基,用接种针挑取大肠杆菌(-70℃甘油保存菌),在平板培养基上分级划线,将上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

2.在划线平板培养基上挑取单菌落,接种到20mL无抗性的LB培养基中,37℃振荡(约120rpm)培养。测定OD₆₀₀值,当OD₆₀₀值达到0.3～0.5时(约培养5小时)放置冰中停止培养。

3.取步骤(2)菌体培养液1ml于1.5mL离心管中,5000rpm 4℃离心5分钟,弃上清(注意尽量除尽上清)。

4.在每个离心管中加入100μL冰中预冷的Solution A,轻轻弹动离心管使沉淀悬浮,禁止剧烈振荡。

5.5000rpm 4℃离心5分钟,弃上清(注意尽量除尽上清)。

6.在每个离心管中加入100μL冰中预冷的Solution B,轻轻弹动离心管使沉淀悬浮,禁止剧烈振荡。

7.感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验,也可以于-80℃中保存,以备以后使用。在-80℃保存时,可以有效保存一年以上,但不能反复冻融,一旦融解后,不能再进行-80℃保存。

实施例1制备工程菌E.Coil BL21codon pius/pACYCDuet-1/ERG20

1.1 XsGAS基因全长克隆

提取苍耳幼苗RNA,反转录为cDNA后作为模板。以NCBI上公布的苍耳GAS序列设计引物(上游引物(SEQ ID NO.9):5’-ATGGCAGCAGTTGGAGCCAATG-3’；下游引物(SEQ IDNO.10):5’-TTACATGGGTAAAGAATCGACAAACAAGAG-3’),以cDNA为模板进行高保真PCR反应,PCR反应参数为：首先98℃变性3min；其次98℃变性15sec,60℃退火15sec,72℃延伸1min30sec,35个循环；最后72℃再延伸10min；待PCR结束后将产物回收,获得苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.2构建pRSFDuet-XsGAS重组质粒

在pRSFDuet-1载体(SEQ ID NO.3)上选择NdeI和XhoI酶切位点,根据XsGAS基因编码序列设计扩增出完整编码阅读框的引物,并在上游和下游引物上分别引入载体末端同源序列,上游引物(SEQ ID NO.11)为:5’-TAAGAAGGAGATATACATATGATGGCAGCAGTTGGAGCCAATG-3’；下游引物(SEQ ID NO.12)为:5’-GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACATGGGTAAAGAATCGAC-3’。以上一步PCR回收产物为模板进行同源臂的扩增。PCR反应参数为：首先98℃变性3min；其次98℃变性15sec,60℃退火15sec,72℃延伸1min 30sec,35个循环；最后72℃再延伸10min,回收第二次PCR扩增产物。将pRSFDuet-1载体用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后,测定回收第二次PCR扩增产物和酶切后pRSFDuet-1载体这两个片段的核酸浓度后按Vazyme的ClonExpress II One Step Clonin说明书进行连接和PCR验证。其中,将连接产物转化至JM109感受态细胞,取适量转化后的感受态细胞涂布在含50mg/L Kan的LB平板上,37℃培养12h,挑取转化子进行验证,提取PCR验证为阳性菌落的质粒获得pRSFDuet-XsGAS重组质粒，其序列如SEQ ID NO.4所示。(图1a)将构建成功的重组质粒转入E.Coil BL21codon pius中,获得工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-1/XsGAS。

1.3 ERG20基因全长克隆

提取酿酒酵母S288C全基因组作为模板。以NCBI上公布的酿酒酵母ERG20序列设计引物(上游引物(SEQ ID NO.13):5’-ATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGAGAG-3’；下游引物(SEQID NO.14):5’-CTATTTGCTTCTCTTGTAAACTTTGTTCAAG-3’),以cDNA为模板进行高保真PCR反应,PCR反应参数为：首先98℃变性3min；其次98℃变性15sec,60℃退火15sec,72℃延伸1min,35个循环；最后72℃再延伸10min；待PCR结束后将产物回收，获得酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因ERG20,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

1.4构建pACYCDuet—ERG20重组质粒

在pACYCDuet-1载体(SEQ ID NO.7)上选择NcoI和BamHI酶切位点,根据ERG20基因编码序列设计扩增出完整编码阅读框的引物,并在上游和下游引物上分别引入载体末端同源序列,上游引物(SEQ ID NO.15)为：5’-AGATATACCATGGGCATGGCTTCAGAAAAAG-3’；下游引物(SEQ ID NO.16)为:5’-CTCGAATTCGGATCCCTATTTGCTTCTCTTG-3’。以上一步PCR回收产物为模板进行同源臂的扩增。PCR反应参数为：首先98℃变性3min；其次98℃变性15sec,60℃退火15sec,72℃延伸1min,35个循环；最后72℃再延伸10min,回收第二次PCR扩增产物。将pRSFDuet-1载体用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后,测定回收第二次PCR扩增产物和酶切后pRSFDuet-1载体这两个片段核酸浓度后按ClonExpress II One Step Clonin说明书进行连接和PCR验证。其中,将连接产物转化至JM109感受态细胞,取适量转化后的感受态细胞涂布在含34mg/L Cm的LB平板上,37℃培养12h,挑取转化子进行验证,提取PCR验证为阳性菌落的质粒获得pACYCDuet-ERG20重组质粒，序列如SEQ ID NO.8所示。(图1b)将构建成功的重组质粒转入E.Coil BL21codon pius中,获得工程菌E.Coil BL21codon pius/pACYCDuet-1/ERG20。

1.5产β-榄香烯工程菌的构建

将构建好的载体pRSFDuet-XsGAS和pACYCDuet-ERG20共同转化至E.CoilBL21codon pius中,获得工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20。

上述实施例中,采用的Vazyme的ClonExpress II One Step Clonin操作说明,具体如下：

1.线性化载体及插入片段扩增产物核酸浓度的测定；

2.进行重组反应

于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉入管底。

ddH<sub>2</sub>0	UP to 20μL
		5×CEII Buffer	4μL
线性化克隆载体	50～200ng
		插入片段扩增产物	50～200ng
Exnase II	2μL

ClonExpressTM II重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2,即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)

体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于37℃反应30min。待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后,反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。

3.反应产物转化、涂板

取20μL冷却反应液,加入到200μl感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30min。42℃热击90sec,冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基,37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μL菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置,于37℃过夜培养。

4.克隆鉴定

用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50μL LB培养基中混匀,直接取1μL作为PCR模板。以一条通用测序引物和一条插入片段扩增引物进行菌落PCR,将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜,提取质粒做后续的鉴定。

实施例2产β-榄香烯工程菌的发酵及检测

2.1工程菌的活化

将实施例1制备的工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS、E.CoilBL21codon pius/pACYCDuet-ERG20和E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20分别在含50μg/mL卡那霉素、34μg/mL氯霉素和同时含50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的20mL LB液体培养基中,37℃摇床过夜培养活化。

2.2发酵及发酵后产物检测和蛋白表达的检测

分别取200μL步骤2.1活化后的菌液转接至含与活化相对应抗生素的20mL TB培养基中,37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时,加入IPTG终浓度为0.5mM,同时加入10％正十二烷用于收集产物,20℃诱导20h后,测量发酵液OD₆₀₀,取OD₆₀₀＝1.0菌液离心收集菌体,用去离子水清洗两遍,再用1mL pH7.4磷酸盐缓冲液重悬,超声破碎细胞,离心取上清进行SDS-PAGE蛋白电泳。工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS,E.Coil BL21codon pius/pACYCDuet-ERG20和E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20蛋白电泳图如图2所示,工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20中,XsGAS蛋白分子量大小约为62kDa左右,ERG20蛋白分子量大小约为40kDa,与预期蛋白分子量61.6kDa和38.8kDa相吻合,说明说明同时含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因和含酿酒酵母来源的磷酸合酶编码基因的工程菌株构建成功且XsGAS基因ERG20基因能正常表达。

(图2)

2.3β-榄香烯的检测

取步骤(2.2)中工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS发酵后上层十二烷液体1mL,用0.22μm滤膜过滤后装进样小瓶里,进行GC-MS检测。检测仪器为Agilent7890-5977A气相色谱-单四极杆质谱联用仪。色谱条件：色谱柱为HP-5MS；载气为高纯度氦气,柱流量为10mL/min；进样量0.5μL；进样口温度200℃；柱温：起始温度45℃,保持3min：以10℃/min上升至280℃,保持5min。质谱条件：EI电离源,电离电压70eV,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,接口温度280℃,扫描质量范围45-330amu,溶剂延迟6min。

β-榄香烯标准曲线制作方法：吸取一定量的β-榄香烯标准品溶液,加入乙酸乙酯配制成母液浓度1mM；用乙酸乙酯将母液按5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍、15625倍稀释,配制成0.2mM,0.04mM,0.008mM,1.6μM,0.32μM,0.064μM的标准品浓度梯度,按上述方法进行GC-MS分析,峰面积分别为1298281,312264,58973,10921,2165,375,92。根据峰面积(y)和标准品浓度(x)作出标准曲线:y＝1563.8x-1022.4,R²＝0.9999。

结果表明:根据β-榄香烯和发酵产物的GC-MS分析图谱,确定发酵产物为β-榄香烯,即获得的重组菌株E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20可产β-榄香烯(图3)。

实施例3苍耳倍半萜合酶XsGAS诱导表达优化

3.1碳源种类

将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至20mL分别含5g/L葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、乳糖的TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8,加入IPTG终浓度0.5mM诱导,20℃发酵20h,以实施方法2中β-榄香烯的检测方法进行检测。

该重组菌在五种含不同碳源的培养基中发酵后均能检测到β-榄香烯,其中以甘油为碳源进行发酵产量最高,故选择甘油作为碳源进行之后的发酵。(图4)

3.2碳源浓度

将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至20mL分别含5g/L,10g/L,15g/L,20g/L,30g/L,40g/L甘油的TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8,加入IPTG终浓度0.5mM诱导,20℃发酵20h,以实施方法2中β-榄香烯的检测方法进行检测

在甘油浓度为5g/L-15g/L时,β-榄香烯的产量随碳源浓度的增加而增加,15g/L甘油进行发酵的产量达到最高,之后随着碳源浓度增加产量降低,因此培养基中最佳碳源浓度为15g/L。(图5)

3.3诱导剂浓度

将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至20mL TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8,加入IPTG终浓度分别为0.01mM,0.1mM,0.4mM,0.8mM,1.0mM,1.2mM诱导,20℃发酵20h,以实施方法2中β-榄香烯的检测方法进行检测

在诱导浓度为0.01mM—0.4mM时,β-榄香烯的产量随诱导浓度的增加而增加,终浓度为0.4mM时β-榄香烯产量最高,之后随着诱导浓度增加产量降低,故最佳诱导剂终浓度为0.4mM。(图6)

3.4发酵时间

将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至20mL TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8,加入IPTG终浓度为0.4mM诱导,20℃分别诱导12h,24h,48h,60h,以实施方法2中β-榄香烯的检测方法进行检测

该重组菌随着发酵时间的延长,β-榄香烯产量有微量增加但基本无明显差异。(图7)

3.5诱导OD₆₀₀

将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至20mL TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀分别为0.1,0.3,0.6,0.9,1.2,加入IPTG终浓度为0.4mM诱导,20℃发酵20h,以实施方法2中β-榄香烯的检测方法进行检测

该重组菌在OD₆₀₀为0.1-0.6时诱导,β-榄香烯产量随OD₆₀₀提高而增加,在OD₆₀₀为0.6时诱导的产量达到最大,之后随着OD₆₀₀的增大而产量下降(图8)。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一种产β-榄香烯工程菌株及应用

<141> 2019-11-25

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> 苍耳(Xanthium strumarium)

<400> 1

atggcagcag ttggagccaa tgctaccctc ctaacgaaca ccaaaagcac tgtagagcca 60

gtgcgtcctt tggccaactt tcctccttct gtatggggtg atatgttcct atcattctct 120

cttgacaatt cgaaaatgga agaatatgct aaagccatgg aaaaaccaaa acaagaagtg 180

aggagattga tcttggatcc cacaatggat tcaaacaaga aactcagttt gatttatgtg 240

gttcaccgtc tcggtctgac gtacatgttt ttgaaagaga ttgaaggcca gcttgacaga 300

cttttcgaag agtttaactt ggaagattat gttgatgttg atttacacac gatttcaatt 360

aactttcaag cttttcgaca ccttggttac aaactccctt gtgacgtgtt taacaaattc 420

aagaacaacg actcgaatgc attcaaggaa tctattgcca gtgacgtgag gggtctgtta 480

ggcttatatg aatctgcaca actgagagtg aaaggagaaa agatactaga tgatgcctca 540

gcgttcgcag aaactaaact gaagagttta gtaaatactc tggaaggcag tcttgcacaa 600

caggtgaaac aagcattgaa aagaccattt catcaaggga tgccaatggt agaggcaagg 660

ctgtatttca ccaactatca agaagaattc tccaaatatg actcactact gaaacttgca 720

aaacttcact tcaactactt gcagctacaa caaaaggaag aacttaggat tgtttcaaag 780

tggtggaagg atatgaggtt tcaagagacc actccttata tacgggatag agtaccagag 840

atttatttat ggatattagg actctacttt gaacctaagt actcactggc tagaatcatt 900

gccaccaaaa ttacattgtt tcttgtggtg ctagatgaca catatgatgc ttacggtacc 960

cttgaagagc tccgccttct aacccatgcg ataaatagat gggacatgag ggctatgagc 1020

gacattccag agtacattag accattttac aaaattctcc tagatgagta tgctgaactt 1080

gagaagcaac tagctaaaga aggacgcctg aagagtgtta ttgcttcaaa agaagcgttc 1140

caagacattg ctagaggtta cattgaagag gctgagtgga caaacagtgg atatgtagca 1200

tcatttccag agtacatgaa gaacggatta atcacttctg cctacaatgt tatttcgaaa 1260

tctgctttag tgggaatggg tgaggtagtg agtgcagatg ctttggcttg gtacgaaagc 1320

catccaaaga ttctgcaagc ctcggagcta atttcgagac tccaggatga tgttatgaca 1380

taccagtttg agcgcgaaag aggacaatcg gcaactggtg ttgattcata tatcaagacc 1440

tatggggtgt cagaaaagga agcaatcgag gagctgaaga aaatgattga aaatgcatgg 1500

aaagatataa acgagggatg tctgaagcca agagaagtct cgatggatct gcttgctcct 1560

attcttaatc ttgctcgaat gatagatgtg gtgtacaggt acgacgacgg gtttactttc 1620

ccgggaaaga ccctcaaaga gtacattact ctcttgtttg tcgattcttt acccatgtaa 1680

<210> 2

<211> 559

<212> PRT

<213> 苍耳(Xanthium strumarium)

<400> 2

Met Ala Ala Val Gly Ala Asn Ala Thr Leu Leu Thr Asn Thr Lys Ser

1 5 10 15

Thr Val Glu Pro Val Arg Pro Leu Ala Asn Phe Pro Pro Ser Val Trp

20 25 30

Gly Asp Met Phe Leu Ser Phe Ser Leu Asp Asn Ser Lys Met Glu Glu

35 40 45

Tyr Ala Lys Ala Met Glu Lys Pro Lys Gln Glu Val Arg Arg Leu Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Thr Met Asp Ser Asn Lys Lys Leu Ser Leu Ile Tyr Val

65 70 75 80

Val His Arg Leu Gly Leu Thr Tyr Met Phe Leu Lys Glu Ile Glu Gly

85 90 95

Gln Leu Asp Arg Leu Phe Glu Glu Phe Asn Leu Glu Asp Tyr Val Asp

100 105 110

Val Asp Leu His Thr Ile Ser Ile Asn Phe Gln Ala Phe Arg His Leu

115 120 125

Gly Tyr Lys Leu Pro Cys Asp Val Phe Asn Lys Phe Lys Asn Asn Asp

130 135 140

Ser Asn Ala Phe Lys Glu Ser Ile Ala Ser Asp Val Arg Gly Leu Leu

145 150 155 160

Gly Leu Tyr Glu Ser Ala Gln Leu Arg Val Lys Gly Glu Lys Ile Leu

165 170 175

Asp Asp Ala Ser Ala Phe Ala Glu Thr Lys Leu Lys Ser Leu Val Asn

180 185 190

Thr Leu Glu Gly Ser Leu Ala Gln Gln Val Lys Gln Ala Leu Lys Arg

195 200 205

Pro Phe His Gln Gly Met Pro Met Val Glu Ala Arg Leu Tyr Phe Thr

210 215 220

Asn Tyr Gln Glu Glu Phe Ser Lys Tyr Asp Ser Leu Leu Lys Leu Ala

225 230 235 240

Lys Leu His Phe Asn Tyr Leu Gln Leu Gln Gln Lys Glu Glu Leu Arg

245 250 255

Ile Val Ser Lys Trp Trp Lys Asp Met Arg Phe Gln Glu Thr Thr Pro

260 265 270

Tyr Ile Arg Asp Arg Val Pro Glu Ile Tyr Leu Trp Ile Leu Gly Leu

275 280 285

Tyr Phe Glu Pro Lys Tyr Ser Leu Ala Arg Ile Ile Ala Thr Lys Ile

290 295 300

Thr Leu Phe Leu Val Val Leu Asp Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr

305 310 315 320

Leu Glu Glu Leu Arg Leu Leu Thr His Ala Ile Asn Arg Trp Asp Met

325 330 335

Arg Ala Met Ser Asp Ile Pro Glu Tyr Ile Arg Pro Phe Tyr Lys Ile

340 345 350

Leu Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Lys Gln Leu Ala Lys Glu Gly

355 360 365

Arg Leu Lys Ser Val Ile Ala Ser Lys Glu Ala Phe Gln Asp Ile Ala

370 375 380

Arg Gly Tyr Ile Glu Glu Ala Glu Trp Thr Asn Ser Gly Tyr Val Ala

385 390 395 400

Ser Phe Pro Glu Tyr Met Lys Asn Gly Leu Ile Thr Ser Ala Tyr Asn

405 410 415

Val Ile Ser Lys Ser Ala Leu Val Gly Met Gly Glu Val Val Ser Ala

420 425 430

Asp Ala Leu Ala Trp Tyr Glu Ser His Pro Lys Ile Leu Gln Ala Ser

435 440 445

Glu Leu Ile Ser Arg Leu Gln Asp Asp Val Met Thr Tyr Gln Phe Glu

450 455 460

Arg Glu Arg Gly Gln Ser Ala Thr Gly Val Asp Ser Tyr Ile Lys Thr

465 470 475 480

Tyr Gly Val Ser Glu Lys Glu Ala Ile Glu Glu Leu Lys Lys Met Ile

485 490 495

Glu Asn Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu Gly Cys Leu Lys Pro Arg Glu

500 505 510

Val Ser Met Asp Leu Leu Ala Pro Ile Leu Asn Leu Ala Arg Met Ile

515 520 525

Asp Val Val Tyr Arg Tyr Asp Asp Gly Phe Thr Phe Pro Gly Lys Thr

530 535 540

Leu Lys Glu Tyr Ile Thr Leu Leu Phe Val Asp Ser Leu Pro Met

545 550 555

<210> 3

<211> 3829

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120

ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180

taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240

gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300

tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt 360

ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg 420

cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 480

cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaacctca ggcatttgag aagcacacgg 540

tcacactgct tccggtagtc aataaaccgg taaaccagca atagacataa gcggctattt 600

aacgaccctg ccctgaaccg acgacaagct gacgaccggg tctccgcaag tggcactttt 660

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 720

ccgctcatga attaattctt agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt 780

catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa 840

ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg 900

tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa 960

atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa agtttatgca tttctttcca 1020

gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc 1080

gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg cggtcgctgt taaaaggaca 1140

attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt 1200

ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt 1260

ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat 1320

aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc 1380

tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt 1440

cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat 1500

gttggaattt aatcgcggcc tagagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcatactctt 1560

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 1620

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg catgcagcgc tcttccgctt cctcgctcac 1680

tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggtg tcagctcact caaaagcggt 1740

aatacggtta tccacagaat caggggataa agccggaaag aacatgtgag caaaaagcaa 1800

agcaccggaa gaagccaacg ccgcaggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 1860

atcacaaaaa tcgacgctca agccagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1920

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 1980

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgtt 2040

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2100

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2160

acgacttatc gccactggca gcagccattg gtaactgatt tagaggactt tgtcttgaag 2220

ttatgcacct gttaaggcta aactgaaaga acagattttg gtgagtgcgg tcctccaacc 2280

cacttacctt ggttcaaaga gttggtagct cagcgaacct tgagaaaacc accgttggta 2340

gcggtggttt ttctttattt atgagatgat gaatcaatcg gtctatcaag tcaacgaaca 2400

gctattccgt tactctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 2460

agccccatac gatataagtt gtaattctca tgttagtcat gccccgcgcc caccggaagg 2520

agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga 2580

gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 2640

gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 2700

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 2760

ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 2820

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 2880

accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc 2940

gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc 3000

atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga 3060

atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa 3120

cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg 3180

cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag 3240

acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg 3300

tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc 3360

gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 3420

agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga 3480

ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg 3540

ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa 3600

acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct 3660

gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg 3720

cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg 3780

ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa attaatacga ctcactata 3829

<210> 4

<211> 5458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120

ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180

taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240

gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300

tgatggcagc agttggagcc aatgctaccc tcctaacgaa caccaaaagc actgtagagc 360

cagtgcgtcc tttggccaac tttcctcctt ctgtatgggg tgatatgttc ctatcattct 420

ctcttgacaa ttcgaaaatg gaagaatatg ctaaagccat ggaaaaacca aaacaagaag 480

tgaggagatt gatcttggat cccacaatgg attcaaacaa gaaactcagt ttgatttatg 540

tggttcaccg tctcggtctg acgtacatgt ttttgaaaga gattgaaggc cagcttgaca 600

gacttttcga agagtttaac ttggaagatt atgttgatgt tgatttacac acgatttcaa 660

ttaactttca agcttttcga caccttggtt acaaactccc ttgtgacgtg tttaacaaat 720

tcaagaacaa cgactcgaat gcattcaagg aatctattgc cagtgacgtg aggggtctgt 780

taggcttata tgaatctgca caactgagag tgaaaggaga aaagatacta gatgatgcct 840

cagcgttcgc agaaactaaa ctgaagagtt tagtaaatac tctggaaggc agtcttgcac 900

aacaggtgaa acaagcattg aaaagaccat ttcatcaagg gatgccaatg gtagaggcaa 960

ggctgtattt caccaactat caagaagaat tctccaaata tgactcacta ctgaaacttg 1020

caaaacttca cttcaactac ttgcagctac aacaaaagga agaacttagg attgtttcaa 1080

agtggtggaa ggatatgagg tttcaagaga ccactcctta tatacgggat agagtaccag 1140

agatttattt atggatatta ggactctact ttgaacctaa gtactcactg gctagaatca 1200

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gcgacattcc agagtacatt agaccatttt acaaaattct cctagatgag tatgctgaac 1380

ttgagaagca actagctaaa gaaggacgcc tgaagagtgt tattgcttca aaagaagcgt 1440

tccaagacat tgctagaggt tacattgaag aggctgagtg gacaaacagt ggatatgtag 1500

catcatttcc agagtacatg aagaacggat taatcacttc tgcctacaat gttatttcga 1560

aatctgcttt agtgggaatg ggtgaggtag tgagtgcaga tgctttggct tggtacgaaa 1620

gccatccaaa gattctgcaa gcctcggagc taatttcgag actccaggat gatgttatga 1680

cataccagtt tgagcgcgaa agaggacaat cggcaactgg tgttgattca tatatcaaga 1740

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tcccgggaaa gaccctcaaa gagtacatta ctctcttgtt tgtcgattct ttacccatgt 1980

aactcgagtc tggtaaagaa accgctgctg cgaaatttga acgccagcac atggactcgt 2040

ctactagcgc agcttaatta acctaggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac 2100

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agcacacggt cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag 2220

cggctattta acgaccctgc cctgaaccga cgacaagctg acgaccgggt ctccgcaagt 2280

ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 2340

aatatgtatc cgctcatgaa ttaattctta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg 2400

caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga 2460

aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat 2520

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ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc 2700

aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc ggtcgctgtt 2760

aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc 2820

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aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg 3060

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cacgctgttg gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3720

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ccgttggtag cggtggtttt tctttattta tgagatgatg aatcaatcgg tctatcaagt 4020

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agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt 5160

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ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg 5280

gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc 5340

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<210> 5

<211> 1059

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

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gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 6

Met Ala Ser Lys Ile Arg Arg Arg Asn Val Lys Val Asn Ala Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Gly Met Lys Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Asn Tyr Asn Thr

20 25 30

Gly Gly Lys Asn Arg Gly Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Lys Thr Val Gly Tyr Lys Val Ala Ile Gly Trp Cys Ile Ala Tyr Val

50 55 60

Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Cys Trp Tyr

65 70 75 80

Lys Val Val Gly Ile Ala Ile Asn Asp Ala Met Ala Ala Ile Tyr Lys

85 90 95

Lys Ser His Arg Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr His Val Thr Thr

100 105 110

Gly Met Asp Ile Thr Ala Asp Lys Val Asp Ser Lys Ser Lys Lys His

115 120 125

Ser Ile Val Thr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Tyr Val Ala Ala Met Tyr

130 135 140

Val Ala Gly Ile Thr Asp Lys Asp Lys Ala Arg Asp Val Ile Gly Tyr

145 150 155 160

Ile Asp Asp Tyr Asp Cys Gly Thr Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile

165 170 175

Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Ala Ser Ala Arg Lys

180 185 190

Thr Asp Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Ser Val Ala Ala Lys Cys Lys Lys

195 200 205

Ile Asn Asp Lys Ile Tyr His Tyr Ser Ile Ala Lys Asp Lys Ala Lys

210 215 220

Ile Ser Val Asp Ser Arg Gly Lys Ala Asp Val Thr Ala Asn Lys Val

225 230 235 240

Tyr Lys Arg Ser Lys

245

<210> 7

<211> 4008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120

ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180

taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240

gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300

tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt 360

ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg 420

cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg 480

cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaacctca ggcatttgag aagcacacgg 540

tcacactgct tccggtagtc aataaaccgg taaaccagca atagacataa gcggctattt 600

aacgaccctg ccctgaaccg acgaccgggt cgaatttgct ttcgaatttc tgccattcat 660

ccgcttatta tcacttattc aggcgtagca ccaggcgttt aagggcacca ataactgcct 720

taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt 780

ctgccgacat ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc 840

accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atagtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc 900

atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa 960

aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca 1020

tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat 1080

gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc 1140

accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aactccggat gagcattcat caggcgggca 1200

agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag 1260

gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc 1320

tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt 1380

ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt 1440

agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat 1500

tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat 1560

tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc gggtgatgct 1620

gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg cttctgtttc 1680

tatcagctgt ccctcctgtt cagctactga cggggtggtg cgtaacggca aaagcaccgc 1740

cggacatcag cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg ttggcactga tgagggtgtc 1800

agtgaagtgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc ggtgcgtcag cagaatatgt 1860

gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc gttcgactgc 1920

ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc aggaagatac 1980

ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc gcccccctga 2040

caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga aacccgacag gactataaag 2100

ataccaggcg tttcccctgg cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc ctttcggttt 2160

accggtgtca ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga cactcagttc 2220

cgggtaggca gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc agtccgaccg 2280

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg caaaagcacc 2340

actggcagca gccactggta attgatttag aggagttagt cttgaagtca tgcgccggtt 2400

aaggctaaac tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc tccaagccag ttacctcggt 2460

tcaaagagtt ggtagctcag agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg gttttttcgt 2520

tttcagagca agagattacg cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat cttattaatc 2580

agataaaata tttctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca cctgaagtca 2640

gccccatacg atataagttg taattctcat gttagtcatg ccccgcgccc accggaagga 2700

gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag 2760

ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 2820

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca 2880

gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc 2940

cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt 3000

tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta 3060

ccgagatgtc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg 3120

ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca 3180

tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa 3240

tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac 3300

ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc 3360

ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga 3420

catcaagaaa taacgccgga acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt 3480

catccagcgg atagttaatg atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg 3540

ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca 3600

gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac 3660

tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt 3720

tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa 3780

cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg 3840

cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc 3900

gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc 3960

tctcccttat gcgactcctg cattaggaaa ttaatacgac tcactata 4008

<210> 8

<211> 5038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcatgg cttcagaaaa agaaattagg agagagagat tcttgaacgt 120

tttccctaaa ttagtagagg aattgaacgc atcgcttttg gcttacggta tgcctaagga 180

agcatgtgac tggtatgccc actcattgaa ctacaacact ccaggcggta agctaaatag 240

aggtttgtcc gttgtggaca cgtatgctat tctctccaac aagaccgttg aacaattggg 300

gcaagaagaa tacgaaaagg ttgccattct aggttggtgc attgagttgt tgcaggctta 360

cttcttggtc gccgatgata tgatggacaa gtccattacc agaagaggcc aaccatgttg 420

gtacaaggtt cctgaagttg gggaaattgc catcaatgac gcattcatgt tagaggctgc 480

tatctacaag cttttgaaat ctcacttcag aaacgaaaaa tactacatag atatcaccga 540

attgttccat gaggtcacct tccaaaccga attgggccaa ttgatggact taatcactgc 600

acctgaagac aaagtcgact tgagtaagtt ctccctaaag aagcactcct tcatagttac 660

tttcaagact gcttactatt ctttctactt gcctgtcgca ttggccatgt acgttgccgg 720

tatcacggat gaaaaggatt tgaaacaagc cagagatgtc ttgattccat tgggtgaata 780

cttccaaatt caagatgact acttagactg cttcggtacc ccagaacaga tcggtaagat 840

cggtacagat atccaagata acaaatgttc ttgggtaatc aacaaggcat tggaacttgc 900

ttccgcagaa caaagaaaga ctttagacga aaattacggt aagaaggact cagtcgcaga 960

agccaaatgc aaaaagattt tcaatgactt gaaaattgaa cagctatacc acgaatatga 1020

agagtctatt gccaaggatt tgaaggccaa aatttctcag gtcgatgagt ctcgtggctt 1080

caaagctgat gtcttaactg cgttcttgaa caaagtttac aagagaagca aatagggatc 1140

cgaattcgag ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc 1200

gaacagaaag taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata 1260

ggggaattgt gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga 1320

gatatacata tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt 1380

accctcgagt ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg 1440

tctactagcg cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 1500

ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaacctca ggcatttgag 1560

aagcacacgg tcacactgct tccggtagtc aataaaccgg taaaccagca atagacataa 1620

gcggctattt aacgaccctg ccctgaaccg acgaccgggt cgaatttgct ttcgaatttc 1680

tgccattcat ccgcttatta tcacttattc aggcgtagca ccaggcgttt aagggcacca 1740

ataactgcct taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc 1800

attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag 1860

cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atagtgaaaa cgggggcgaa 1920

gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc 1980

tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta 2040

acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact 2100

ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact 2160

atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aactccggat gagcattcat 2220

caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt 2280

ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga 2340

ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc 2400

agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 2460

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 2520

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 2580

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc 2640

gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg 2700

cttctgtttc tatcagctgt ccctcctgtt cagctactga cggggtggtg cgtaacggca 2760

aaagcaccgc cggacatcag cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg ttggcactga 2820

tgagggtgtc agtgaagtgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc ggtgcgtcag 2880

cagaatatgt gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc 2940

gttcgactgc ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc 3000

aggaagatac ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc 3060

gcccccctga caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga aacccgacag 3120

gactataaag ataccaggcg tttcccctgg cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc 3180

ctttcggttt accggtgtca ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga 3240

cactcagttc cgggtaggca gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc 3300

agtccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg 3360

caaaagcacc actggcagca gccactggta attgatttag aggagttagt cttgaagtca 3420

tgcgccggtt aaggctaaac tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc tccaagccag 3480

ttacctcggt tcaaagagtt ggtagctcag agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg 3540

gttttttcgt tttcagagca agagattacg cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat 3600

cttattaatc agataaaata tttctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca 3660

cctgaagtca gccccatacg atataagttg taattctcat gttagtcatg ccccgcgccc 3720

accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct 3780

aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 3840

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 3900

ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc 3960

accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga 4020

aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg 4080

tatcccacta ccgagatgtc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt 4140

gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc 4200

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atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc 4320

gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga 4380

tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc 4440

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gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc 4920

tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg 4980

atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaaa ttaatacgac tcactata 5038

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcagcag ttggagccaa tg 22

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttacatgggt aaagaatcga caaacaagag 30

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taagaaggag atatacatat gatggcagca gttggagcca atg 43

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtttcttta ccagactcga gttacatggg taaagaatcg ac 42

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggcttcag aaaaagaaat taggagag 28

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctatttgctt ctcttgtaaa ctttgttcaa g 31

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agatatacca tgggcatggc ttcagaaaaa g 31

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgaattcg gatccctatt tgcttctctt g 31

Claims

1.一种产β-榄香烯工程菌株,其特征在于,该工程菌株通过如下步骤构建获得：

(1)构建含苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS的重组质粒：

(1.1)扩增一个苍耳来源的倍半萜合酶编码基因XsGAS,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(1.2)将步骤(1.1)扩增得到的苍耳来源的倍半萜合酶基因XsGAS与pRSFDuet-1载体连接,获得pRSFDuet-XsGAS重组质粒；pRSFDuet-1载体的序列如SEQ ID NO.3所示,pRSFDuet-XsGAS重组质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

(2.2)将步骤(2.1)扩增得到的酿酒酵母来源的磷酸合酶基因ERG20与pACYCDuet-1载体连接,获得pACYCDuet-ERG20重组质粒；pACYCDuet-1载体的序列如SEQ ID NO.7所示,pACYCDuet-ERG20重组质粒的序列如SEQ ID NO.8所示。

(3)将步骤(1.2)和步骤(2.2)获得的两个重组质粒pRSFDuet-XsGAS和pACYCDuet-ERG20同时转化至E.coli BL21感受态细胞中,获得产β-榄香烯工程菌株E.Coil BL21codonpius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20。

2.一种权利要求1产β-榄香烯工程菌株的应用,其特征在于,通过诱导工程菌株中苍耳倍半萜合酶XsGAS表达生产β-榄香烯,具体为：将工程菌E.Coil BL21codon pius/pRSFDuet-XsGAS/pACYCDuet-ERG20活化后转接至含5-40g/L碳源的TB培养基中培养至OD₆₀₀为0.3-1.2,加入IPTG诱导,IPTG在TB培养基中的终浓度为0.01-1.2mM,20℃发酵24-60h。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的碳源为甘油,甘油浓度为15g/L,OD₆₀₀为0.6,IPTG终浓度为0.4mM,发酵时间为48h。