CN109609525A

CN109609525A - 灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN109609525A
Application number: CN201910022178.9A
Authority: CN
Inventors: 崔凤杰; 朱鸿安; 陶庭磊; 孙文敬; 昝新艺
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-12
Also published as: CN110117602A; CN110117601B; CN110117601A; CN110117602B

Abstract

本发明属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及一种灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用；本发明首次从灰树花菌丝体基因组中克隆得到葡聚糖合成关键酶‑葡聚糖合成酶的编码基因，并通过基因沉默证明该基因在灰树花菌丝体生长和葡聚糖合成过程中的关键角色；最后通过基因工程技术，在灰树花中过表达葡聚糖合成酶，显著提高了重组菌株菌体生长和葡聚糖合成产量；本发明将有助于从分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制，开展食药用真菌多糖合成的代谢工程研究和高效发酵生产品质稳定的葡聚糖提供重要的技术支持和参考。

Description

灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用

技术领域

本发明属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及一种灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用。

背景技术

食药用真菌多糖是当前国内外研究十分活跃的领域之一，其在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节及抗肿瘤等诸多重要的生物过程中起到关键作用。其中，葡聚糖是由D-葡萄糖之间通过β-1,3和/或β-1,6糖苷键链接聚合而成的多糖，具有显著的免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒和降血脂等生理功能，因此被称为“生物反应调节物”。

然而，食药用真菌多糖的合成过程极为复杂，参与合成的底物和酶系众多，且可参考的技术方法严重不足，因而对其了解和认识十分有限。研究发现，葡萄糖作为灵芝发酵的碳源时，除供菌体自身生长需求外，还会被多种核苷酸糖合成酶（如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶等）转化为相应的UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、GDP-甘露糖和dTDP-鼠李糖等核苷酸糖，并推测其可能经糖转移酶转运至多糖合成位点最终聚合成菌丝体多糖或胞外多糖。因此，要实现食药用真菌葡聚糖高效而稳定的合成，还需明确葡聚糖合成相关酶系的功能，并采取具有针对性的代谢调控手段以有效强化其合成。

灰树花（Grifola frondosa）是一种富含多糖和蛋白质等营养成分的食用菌。已有的研究结果显示，灰树花子实体中纯化出的葡聚糖（D-fraction）具有显著的抗肿瘤和免疫调节等活性。已有研究证实，灰树花菌丝体多糖或胞外多糖中的单糖组成和含量与核苷酸糖合成酶（磷酸葡萄糖异构酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶）的活性直接相关。但究竟哪些酶系参与了灰树花葡葡聚糖合成途径却始终没有详细报道。到目前为止没有检索到任何关于灰树花多糖合成途径相关酶和合成机制的分子水平研究成果。

发明内容

本发明目的是提供有效改变灰树花葡聚糖合成量的技术手段，具体的，本发明的目的在于提供灰树花葡聚糖合成相关酶，即葡聚糖合成酶，同时提供灰树花葡聚糖合成酶编码基因序列、基因沉默和基因过表达质粒、基因工程菌及生产方法。

为实现灰树花菌丝体多糖高效而稳定的合成和进一步提升灰树花发酵产品品质的目标，本发明首次从灰树花菌丝体基因组中克隆得到葡聚糖合成关键酶-葡聚糖合成酶的编码基因，并通过基因沉默证明该基因在灰树花菌丝体生长和葡聚糖合成过程中的关键角色；最后通过基因工程技术，在灰树花中过表达葡聚糖合成酶，显著提高了重组菌株细胞生长和葡聚糖合成产量。本发明将有助于从分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制，开展食药用真菌多糖合成的代谢工程研究和高效发酵生产品质稳定的葡聚糖提供重要的技术支持和参考。

本发明通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术进行灰树花葡聚糖合成酶基因沉默，以及通过同源重组技术进行灰树花葡聚糖合成酶基因过表达，为分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制和高效生产免疫增强剂葡聚糖提供行之有效的解决策略和方法，所构建的重组菌株能以葡萄糖、淀粉水解物和木质纤维素等底物合成葡聚糖。

本发明提供一种灰树花葡聚糖合成酶，所述酶包括4个亚基FKS 1-0、FKS 1-1、FKS1-2和FKS1-3，各亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO .5、SEQ ID NO .6、SEQ ID NO .7、SEQ IDNO .8所示。

编码所述葡聚糖合成酶各亚基FKS 1-0、FKS 1-1、FKS 1-2和FKS1-3的基因序列如SEQ ID NO .1、SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。

本发明还提供所述灰树花葡聚糖合成酶在改变提高葡聚糖合成量中的用途，所述改变包括上调或下调灰树花多糖合成量；进一步的，所述上调葡聚糖合成量是通过过表达编码灰树花葡聚糖合成酶亚基fks 1-0的基因实现；所述下调葡聚糖合成量是通过基因沉默编码灰树花葡聚糖合成酶亚基fks 1-0的基因实现;进一步的，所述上调或下调灰树花多糖合成量是通过过表达或基因沉默灰树花葡聚糖合成酶亚基fks1-0编码基因的保守序列（SEQ ID NO .9）实现。

本发明还提供一种重组载体，即过表达载体，所述载体包含所述灰树花葡聚糖合成酶亚基fks 1-0编码基因的保守序列（SEQ ID NO .9），用于上调灰树花葡聚糖合成量。所述重组载体是通过扩增葡聚糖合成酶亚基FKS 1-0编码基因保守序列（SEQ ID NO .9），经T4 DNA连接酶与质粒pGU3301连接获得；根据本发明的实施例之一，所述的基因过表达载体为pGU3301-fks1-0。

所述重组载体还包括灰树花gpd启动子（SEQ ID NO .10）和构巢曲霉35s启动子（SEQ ID NO .11），即基因沉默载体。所述重组载体的构建是分别克隆SEQ ID NO .9序列、SEQ ID NO .10序列和SEQ ID NO .11序列，再通过overlap-PCR将三个基因片段进行连接，质粒pAN7-1 经BamI和HindIII酶切，然后通过T4 DNA连接酶将基因片段和酶切质粒片段连接获得双向启动子沉默葡聚糖合成酶基因保守区域的载体。根据本发明的实施例之一，所述的基因沉默载体为pAN7-fks1-0。

本发明还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括所述的基因沉默载体或过表达载体。所述工程菌是通过制备不完全酶解的灰树花原生质体，并采用电击转化法将所述的重组载体转化该原生质体得到。

其中，所述制备不完全酶解的灰树花原生质体是通过将培养的灰树花菌丝体经0.3-0.6 M甘露醇溶液洗涤后，加入0.5-4.0%溶壁酶（购自广东微生物研究所）在25-45℃条件下酶解1-5h，离心收集酶解后的不溶物，经过滤获得。

所述的电击转化法将基因沉默载体或过表达载体转入原生质体，是将基因沉默载体pAN7-fks1-0或基因过表达载体pGU3301-fks1-0与灰树花原生质体混匀后，在设置电场强度为0.5-3.5kV/cm，电容15-45μF和电阻200-600Ω等条件下电击2.0-8.0ms后，依次涂布到选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得。

本发明还提供所述的重组工程菌在改变葡聚糖合成量中的用途；所述改变包括上调或下调灰树花多糖合成量。

本发明还提供一种高产灰树花葡聚糖的生产方法，采用所述灰树花重组工程菌，以葡萄糖、淀粉水解物或木质纤维素等底物生产，所述方法包括如下步骤：

（1）配制发酵培养基和种子培养基，其碳源为葡萄糖、或淀粉水解物或木质纤维素中的一种或两种，浓度为5.0~100.0 g/L；

（2）培养所述的工程菌，在培养基中活化工程菌种子液，并在相应规模的发酵罐中逐级放大制备种子培养液；

（3）将工程菌种子液以5.0%-15.0%的接种量接种到含有发酵培养基的摇瓶或发酵罐。

所述发酵罐培养条件：20℃-30℃，通气量0.5-2.0 vvm，搅拌转速50 -500 rpm，培养3-10d；所述摇瓶条件为：20 -30℃，转速80 -200 rpm，培养3-10d。

使用该方法发酵重组灰树花可得葡聚糖总产量为2.0-50.0 g/L 以上。

本发明通过首次采用过表达技术或基因沉默正负调控灰树花葡聚糖合成。经基因沉默的灰树花重组菌，菌体生长速度缓慢，且葡聚糖合成量和合成速度与原始菌株相比显著下降甚至全部消除，说明葡聚糖合成酶在葡聚糖合成过程中具有不可替代的作用。经基因过表达的灰树花重组菌，其葡聚糖合成量和合成速度与原始菌株相比显著提高。基因过表达灰树花重组菌在25L发酵罐发酵葡聚糖的产量能够提高50%以上，还具有生长快、培养基廉价、遗传稳定、产量高等诸多优势，具有明显的工业化生产的潜力。本发明为利用基因工程技术改造出食药用真菌的葡聚糖合成途径提供技术基础和方法指导。

附图说明

图1为灰树花葡聚糖合成酶各亚基（fks 1-0，fks 1-1，fks 1-2和fks 1-3）基因的克隆结果；图中，M：DNA Maker，1为fks 1-0扩增产物，2为fks 1-1扩增产物，3为fks 1-2扩增产物，3为fks 1-3扩增产物。

图2为灰树花葡聚糖合成酶Dicer-Like protein 2功能域预测分析结果。

图3为灰树花葡聚糖合成酶基因序列的基因沉默载体构建示意图。

图4为灰树花葡聚糖合成酶电转及再生重组菌在含有100μg/mL潮霉素培养基生长结果。

图5灰树花葡聚糖合成酶基因沉默和基因过表达的重组菌株在PDB平板上生长对比结果。

图6葡聚糖合成酶基因沉默和基因过表达的灰树花重组菌在25-L发酵罐条件下发酵合成葡聚糖的结果；图中，GF-WT：对照菌株；GF o-fks-1-0：过表达重组菌；GF i-fks-1-0：基因沉默重组菌）。

具体实施方式

以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实施例中使用的质粒、PCR 试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。但本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。

本发明实施例中所述的葡聚糖测定方法如下：收集灰树花发酵醪，经10000g离心收集上清液，浓缩后使用95%乙醇按体积比1:3沉淀；10000g离心收集醇沉物，经50℃真空干燥至恒重，即为所产葡聚糖重量并记录。

本发明实施例中所述的葡聚糖中单糖组成测定方法如下：称取30 mg所产葡聚糖样品，加入3 mL 72% H₂SO₄，30℃水浴60 min后，加入8.4 mL蒸馏水，于121℃反应1h后碳酸钙调节pH至中性，8000g离心收集上清液，旋转蒸发至干。称取水解后的样品，依次加入1 mg内标物肌醇、10 mg盐酸羟胺及1.0 mL吡啶，90℃水浴30 min后，冷却至室温，加入1.0 mL乙酸酐，90℃继续水浴30 min，得到各个标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物；精确称取以上六种单糖各1 mg，加入相同试剂，按上述步骤反应后得到混合标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物，0.22μm微孔滤膜过滤后进入GC分析，气相色谱分析条件：美国Agilent公司7890A气相色谱仪，毛细管色谱柱，FID检测器。进样口温度280 ℃，检测器温度300℃，柱温箱起始温度130℃，保持5 min，4℃/min到240 ℃，保持5 min，分流比40：1，进样量1 μL。根据样品保留时间确定单糖种类，采用内标法计算各单糖的百分含量，明确所产葡聚糖样品中的单糖组成及含量。

本实施例中涉及到的灰树花葡聚糖合成酶FKS，所述酶包括4个亚基FKS 1-0、FKS1-1、FKS 1-2和FKS1-3，各亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO .5、SEQ ID NO .6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO .8所示。

编码所述葡聚糖合成酶各亚基fks 1-0、fks 1-1、fks 1-2和fks 1-3的基因序列如SEQ ID NO .1、SEQ ID NO .2、SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。

所述亚基FKS 1-0编码基因的cDNA序列为SEQ ID NO .12所示；葡聚糖合成酶基因保守序列和克隆灰树花gpd启动子和构巢曲霉35s启动子的序列分别为SEQ ID NO .9、 SEQID NO .10和SEQ ID NO .11所示。

实施例1:灰树花葡聚糖合成酶编码基因的克隆

离心收集灰树花GF02（购自美国模式培养物集存库，American type culturecollection，ATCC ® 60301™）培养菌丝体，迅速加入液氮研磨成细粉，通过植物或者真菌基因组提取试剂盒提取基因组。

根据灰树花胞外葡聚糖合成酶亚基的编码基因fks-1-0（GenBank ID：MK256943）、 fks-1-1（GenBank ID：MK256944）、fks-1-2（GenBank ID：MK256945）和fks-1-3（GenBankID：MK256946）设计引物，分别为：

fks 1-0-F(SEQ ID NO .13)： 5'-acagaagggtctgcaccttaa-3'，

fks 1-0-R(SEQ ID NO .14) ：5'-gtatatgtcgtggagatctatagg-3'；

fks 1-1-F(SEQ ID NO .15)： 5'-ccgtaagagaaacgcacataga-3'，

fks 1-1-R(SEQ ID NO .16) ：5'-tgcagagcacaaataacacataac-3'；

fks 1-2-F (SEQ ID NO .17)：5'-ccctcccacttagacccaac-3'，

fks 1-2-R(SEQ ID NO .18)： 5'-tctggaagtttagaatggtgcc-3'；和

fks 1-3-F(SEQ ID NO .19)： 5'-gagcccttatgcacaatgg-3'，

fks 1-3-R (SEQ ID NO .20)：5'-tggtctgtcgtgcacttgtta-3'。

将培养和收集灰树花GF02菌丝体迅速在液氮中研成粉末状提取总RNA。根据RACE技术，使用TAKARA 3’-FULL RACE Core Set V2.0试剂盒（Takara Code：D314）并设计特异性引物3RACE1(SEQ ID NO .21)：5'-ttctgggtatccatcctcgc-3'，3RACE2(SEQ ID NO .22)：5' -gatacccagaagtaggtca -3'，以灰树花总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增获得FKS1-0基因3’cDNA特异片段，根据已经得到的灰树花基因特异片段，使用TAKARA 5’-FULL RACEKit（Takara Code：D315）试剂盒并设计特异性引物5RACE1(SEQ ID NO .23)：5' -cccatcagttctcttttgcg-3'，5RACE2(SEQ ID NO .24)：5'-aagaagaagaggctcgggca-3'，经去磷酸化反应，去帽子反应、5'RACE Adaptor的连接以及反转录反应之后的cDNA为模板，PCR扩增获得FKS1-0基因5’cDNA特异片段，经拼接得到FKS1-0基因完整的cDNA序列见SEQ IDNO .12。

以已经公布的灰树花的基因组（GenBank assembly accession：GCA_001683735.1）为模板采用上述引物扩增基因全长，PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min；94℃变性20 s，退火 30 s，退火温度52℃，72 ℃延伸（时间由目的基因长度决定），反应 35个循环；采用 1%琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，再用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因片段（如图1所示）测序，然后将测序获得fks 1-0、fks 1-1、fks 1-2和fks 1-3的基因序列，在NCBI中进行BLAST比对，确认其为编码灰树花葡聚糖合成酶的基因序列。

实施例2：构建灰树花葡聚糖合成酶基因序列的基因沉默载体pAN7-fks-1-0

根据已经公布的灰树花全基因序列（GenBank assembly accession：GCA_001683735.1），发现灰树花基因组中存在两段Dicer-Like氨基酸序列（GenBank：OBZ75102.1和OBZ68881.1），进一步通过NCBI保守功能域预测分析Dicer-Like protein 2，结果如图2，灰树花Dicer-Like蛋白含有三个功能域：HELICc, Dicer_dimer, and RIBOc，编码1438个氨基酸，且与其他物种同源性达到95%以上，表明灰树花存在典型的RNAi关健酶，存在基因沉默的可能。

根据实施例1中克隆得到的灰树花葡聚糖合成酶各亚基的基因序列（fks-1-0、fks-1-1、fks-1-2和fks-1-3），根据同源区域设计上下游引物分别为：

fks-F (SEQ ID NO .25)：5'-cccaagcttgcgccatccataaggtcct-3'，

fks-R(SEQ ID NO .26)：5' –ggggtaccgacgatgagggcaacgaag-3'。

以实施例1中得到的灰树花cDNA为模板PCR扩增获得目的基因fks-1-0。

根据灰树花gpd基因序列（GenBank：A0H81_05461），设计GPD启动子引物为：

gpd-F(SEQ ID NO .27)：5'-cgggatcccgttcgcattacacacattg-3'；

gpd-R(SEQ ID NO .28)：5'-ggggtaccactggtgggtacaaatgacg-3'。

以实施例1中得到的灰树花总DNA为模板PCR扩增目的基因。

根据质粒pAN7-1（购于湖南丰晖生物科技有限公司）中构巢曲霉35s启动子序列SEQ ID NO .11，设计35s启动子引物为：

35s -F(SEQ ID NO .29)：5'-cgggatcccgttcgcattacacacattg-3'；

35s -R(SEQ ID NO .30)：5'-ggggtaccactggtgggtacaaatgacg-3'。

以质粒pAN7-1为模板PCR扩增目的基因。

分别将灰树花葡聚糖合成酶主要亚基基因fks-1-0进行KpnI和XhoI酶切，灰树花gpd基因启动子进行Bam I和Kpn I酶切，构巢曲霉35s启动子进行XhoI和HindIII酶切，并将质粒pAN7-1 进行BamI和HindIII酶切。将各酶切产物通过T4 DNA连接酶获得双向启动子沉默葡聚糖合成酶基因保守区域的载体pAN7-fks-1-0（载体构建示意图如图3所示）。

实施例3：不完全酶解制备灰树花原生质体

收集灰树花PDA液体培养所得菌丝体，组织粉碎机无菌条件下处理1min，以10%接种量接种于100mL PDB培养基，28℃静置培养4d后，5000g离心15min收集不溶物；用0.6M甘露醇溶液洗涤2次，加入1mL 2%丝状真菌破壁酶液，30℃酶解4h。将酶解液以5000g离心15min收集不溶物，无菌过滤得到酶解的原生质体；将制备的原生质体加入50mL再生CYM培养基（葡萄糖 20g 蛋白胨 2g 酵母膏2g 七水硫酸镁 0.5g 磷酸氢二钾 1.0g 磷酸二氢钾0.46g琼脂 20g，潮霉素100μg/mL）中混匀，倒入平板，28℃培养再生。

实施例4：灰树花葡聚糖合成酶基因沉默重组菌GF i-fks-1-0的构建

取10μg质粒pAN7-fks-1-0和1mL灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为2.5kV/cm，电容25μF和电阻400Ω等条件下电击4ms后，倒入选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花葡聚糖基因沉默重组菌GF i-fks-1-0。

实施例5：构建葡聚糖合成酶基因过表达的灰树花重组菌GFo-fks-1-0

与实施例2类似，根据同源区域设计灰树花葡聚糖合成酶亚基FKS-1-0上下游引物分别为：

fks-F (SEQ ID NO .31)：5'-cccaagcttgcgccatccataaggtcct-3'，

fks-R(SEQ ID NO .32)：5'-ggggtaccgacgatgagggcaacgaag-3'。

以灰树花cDNA为模板PCR扩增获得目的基因fks-1-0。

利用一步法克隆试剂盒(One Step Cloning Kit；TaKaRa)分别将灰树花葡聚糖合成酶主要亚基基因fks-1-0连接到载体pGU3301（购于湖南丰晖生物科技有限公司）的多克隆位点（MCS）区域，转化E. coli Top10，进行PCR验证和测序验证，获得葡聚糖合成酶基因过表达载体pGU3301-fks-1-0。

取10μg过表达载体pGU3301-fks-1-0和1mL灰树花原生质体重悬液至电转杯中，放置1min后电转，电转条件为：电场强度为3.0kV/cm，电容20μF和电阻450Ω等条件下电击5ms后，到选择性再生CYM培养基（潮霉素100μg/mL）和潮霉素抗性平板上，28℃条件培养筛选获得灰树花葡聚糖过表达重组菌GFo-fks-1-0，如图4所示，经验证，电转成功。

实施例6：以葡萄糖为碳源灰树花重组菌GF i-fks-1-0和GFo-fks-1-025-L发酵生产葡聚糖

（1）斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖 20，蛋白胨5，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 0.75，pH自然。该培养基用于菌种保藏及活化。

一级种子培养基为(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨5，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 0.75，pH自然。

二级种子培养基为(g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 1.5，pH自然。

（2）发酵培养基为(g/L)：葡萄糖 60，蛋白胨6，KH₂PO₄ 6，MgSO₄·7H₂O 1，大豆油50mL，pH自然。

（3）切取5 mm×5 mm的新鲜重组菌菌丝块置于斜面培养基上，于28 ℃的恒温培养箱中培养5d。

分别制备一级和二级种子培养基。接入10块5 mm×5 mm 重组菌菌块，装液量为75/250 mL，28℃、150 rpm摇床培养3d，制得一级种子液。将一级种子液接种于二级种子培养基中，接种量10%(v/v)，装液量150/500 mL，摇床(28℃，150 rpm)培养3d，获得二级种子液。

（4）将培养好的二级种子液以10%的接种量，接种至25L发酵罐中，装液量60%，控制温度28℃，培养7d，控制搅拌转速和通气量分别为90rpm和0.8vvm。每24h取发酵醪，10000g离心10 min后，得到灰树花菌丝体沉淀，蒸馏水反复洗涤菌体，冷冻干燥后称量计算菌丝体干重；上清液经浓缩乙醇沉淀，干燥后称量计算葡聚糖量，并检测葡聚糖样品中单糖组成。经发酵6d后，灰树花原始菌株WT菌体量为23.4g/L，胞外葡聚糖产量为1.03g/L；而灰树花葡聚糖合成酶基因沉默重组菌GF i-fks-1-0的菌体量仅为5 g/L，葡聚糖产量为0.4g/L，其葡萄糖组成达98%以上；而葡聚糖合成酶基因过表达菌株GFo-fks-1-0的菌体量增加到33.2g/L，葡聚糖量达为1.7g/L，其葡萄糖组成达99%以上。这也表明，对葡聚糖合成酶主要亚基进行基因沉默或过表达，均对灰树花菌丝体生长和葡聚糖合成产生直接而显著的影响。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1913

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 1

atgcttgtca tcctgtccgt tcagatattc attgtgacga gtaagtgtta tgtgttattt 60

gtgctctgca tggtgcttat gaatttgatt cgcagtggtt ttcttgggga cgttgaacga 120

ccagctgctc gtctgcaagt attcctcttc gggccagttt atcggtacaa caggatgcta 180

caatctcact cctgcgttcc agtggatcga ccattgcatc atcagtattt tcttggtatt 240

tatgattgca tacctccccc tgttcctaca aggtacgtcg aagtgtcatg attataacgt 300

ccaattcgat aaccgtaatt ccgcagagct tgttgagcgt ggaactggca aagctgtatt 360

tcgactggcg aagcacttcg gttcggcgtc tcctgcgttc gaagtgttct cgacacagat 420

ctcttctcat tcaattatca ccaacttgac tttcggaggt gcaagataca tcgccaccgg 480

ccgtggcttc gcgacgacga gaatttcatt tagcatccta tactcgagat ttgcggggcc 540

aagtatctat ctcgggatga ggacattgat tatgttgtta tatgtgactc tgaccatctg 600

gacgggttgg gtgacctact tctgggtatc catcctcgct ttgtgcattt cgccgttcct 660

cttcaatccc catcagttct cttttgcgga ctttatcatt gactacaggt aagctagaat 720

tgtagaccta atcgttcacg tcactaactt gaattccagg gagttcttgc ggtggatgaa 780

ccgcggcaac tcgcgcgtac accagaactc ttggattggc tattgccggt tatcacggac 840

tatgattaca ggctacaaga agaagaggct cgggcatcct tcagagaaat tgtcgggtga 900

cgtcccgcgt gcgggctggc gagcggtctt gttctcggag gtcatcttcc ccatcgtgat 960

ggccaccctg ttcgtcatcg catacatgct cgtgaagtcg ttcccggaca aggatgggaa 1020

gcaaccgccc agccccctca ttcgaatcgc aatcgtatct cttgggccga ttgtttggaa 1080

tgctgcgata ttgctcgtcc tgttcatgtt ctcgcttttc cttggaccga tgctcgacac 1140

accgttcccc aagttcggat cattgatggc tttccttggg cactcgctcg gtgtcatcgg 1200

catgatcgca ttcttcgagt tcctcgtaag tcgtctcacc ttatctattt cttgacatcg 1260

ctcactttcc gcggcacata gtggttcctc gagctgtgga acgtcgcaca cgccgtgctc 1320

ggtctgatcg cagtcatctt cattcagcgc gccatccata aggtcctgat ttcggtgttc 1380

ctgtcgcgcg agttcaagca tgacgagacg aaccgggcgt ggtggacagg taaatggtac 1440

ggccgcgggc tgggctcgca cgcgatgtca cagcctgcac gagagttcat cgtgaagatc 1500

atcgagctgt cgctgtggag ctcagatttc ctcactggcc acctattgct cttcttgttg 1560

acaccgccaa tcctcatacc gtacttcgac cggctacact cgacgatgct ctgtgagtag 1620

ctatgctatg atttatgcta atgatgttac tgatatcgag tctgcagtct ggttgaggcc 1680

gtcaaaacaa atccgcgcac cgttgtattc catcaagcag aagcggcaac gtcggtggat 1740

tgtcatcaag tatggtgctg tctacgtgct cgcgatcggc atcttcgttg ccctcatcgt 1800

catccgtggg tattgctcat ctgtatggtg tcattgttgc tcatcccgcc catgtagcgc 1860

tcgtcttccg gcaatcgctg accttcaact gcagcatttg ccaacaggtc tga 1913

<210> 2

<211> 3966

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 2

atggccggtc gctctggtcc acgaagccag gagggcatgt atgtctcctc gtctccgtct 60

tcagaccccc acgatccctt cagcaacgtc cacgcacaaa tgcccgagcc ccagaggtac 120

tacgacaacg actctgacca gatagataat tacggtcggc gcgacaccta tggctcggat 180

ggcagtaatg gaggaaacga cgacgatcgt tattatgacc acaacggcgc ctacgatccg 240

tatggccgtg agtgcctttt cctcatgttt ccattctctg tgagcttagt ttcccccagc 300

acaacccgac accgactcgg acgtcgatgt ttacggtcag aagtatgccc cctcagcgga 360

gtctcttggc cctcctcgcg tgggcgtctc agagtcctcc accccgactt tcattgatca 420

caatggttcc ggcgggcgag agccataccc agcttggagt tccgagcgcc aaattccact 480

atcgaaggag gagatcgagg acatcttcct ggaccttacg cagaagtttg gttttcagcg 540

ggattccatg cggaacatgg tatgcttctg ggtgaaagct atctgggttg aattcttaca 600

caagtcttta gttcgacttt acgatgcagc tactggatag tcgcgcctcg cgcatgtcgc 660

ctaatcaggc tctcctcact ttgcatgctg attacatcgg tggccagcac gcaaattacc 720

gcaagtggta cttcgctgcc cagctggatc tcgacgacgc tattggacag acacaaaacc 780

ccggtttaag gtctacaaag cgcaagggac acaaggccgt ggaaaagtcc ctgaacatcg 840

ctctggaccg atggcggcag gccatgaaca acatgagcca gtacgacagg atgcgacaga 900

tcgcactata tctcctttgc tggggcgaag ctgcgcaggt gcgatttgtc ccagaatgcc 960

tatgtttcat cttcaagtgt gcagacgact actaccgatc gccggagtgc cagagtcgga 1020

tagatcccgt gccagaaggc ctgtacttgc atgccgtcat caagcccctg tacaggttta 1080

ttcgcgacca aggttacgag gtagtcgatg ggaagtttgt ccgacgggag aaggaccatg 1140

acacaattat cgggtacgac gatgtgaacc agctattttg gtatccggag ggcatcgctc 1200

gaattgtcct cgcggacaag gtatgccgtc tgacatatac ttttctggtg ttactcatgc 1260

catctacgta tacagacacg actggtcgac ttggcaccag cgcaacgttt catgaaattt 1320

gaccggatcg actggaaccg tgcattcttt aagacgtact atgagaaacg atctttcggc 1380

cacttgcttg tgaactttaa caggatatgg gtcattcatg tgtccatgta ctggtactac 1440

acggcttaca actcaccaac cgtctacaat ggcatcaggt caacagcgat gcgatggtcg 1500

gcaactgcgc tcggaggcgc agttgccact gtgatcatga tcttggcgac gctcgccgaa 1560

ttttcgtaca ttccgacaac atggaacaat acctcgcatc tcactcgacg tctcattttc 1620

ctcgccatta cccttgccct cacggccggt cccacgtttt acatcgcgat cgccgagagc 1680

agctctcccg gcggctcgtt ggccctcatt ctcggcattg tccaattttt catctcggtc 1740

gtcgcgacgc tgctgttcgc gttcctgccc tctggacgca tgttcggcga tagggtggcc 1800

ggcaagtctc ggaagtatct ggcaagtcag acgttcacgg ccagctaccc gacgctgaag 1860

gcatcagcac ggctggcttc cgtgtgcctc tggattctcg tcttcggctg caagttcacc 1920

gaatcgtact ttttcctcac gcaatccttc aaaaacccca tcttggtcat ggtgggcatg 1980

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ttcacgctga cgatcatgta cctgatggat ctcgttctgt tctttttgga caccttcttg 2100

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tgtcgagtgg gataatttcg tcaaggacac gaagattctc gcggaagagt ctgctatgta 2820

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cggtgaccct cgtctgttct ccgcgctgat cgacggccac tcggagttca tcaacgaaag 3300

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aaagtccgac aaccagaatc acgctatcat tttctaccgc ggcgagtatc tccagctcat 3420

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caagaaatcc cccattgcca tcgtcggtgc gcgcgagtat atcttctcgg aaaatatcgg 3600

cattctcggt gatctcgcgg ccggaaagga acagacattc ggtaccctca ccgcgcggtc 3660

gttggcatgg attggcggca agctgcatta tggccacccc gatttcctca acgcgctgta 3720

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cacgggtatg ggcgagcaga tgctcagtcg ggaatactac tacctcggca cgcagctccc 3960

gattga 3966

<210> 3

<211> 3733

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 3

atggcatcca atccgggcta tggacagccc aatccactaa acccattcgc tgcgcagcaa 60

ccttacggac agccctatgg acaacccctt cgtcaatatt ctaatgattc tgatggcgac 120

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atcgggcgct gcatagcatc acgcgccgta tatatgcatg aattgatcta cgagctcgct 300

catggcgtcg agatatacac ccatacacga tacctcttcc gcagaatccg tgagactgat 360

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cgcctctgtc gactcgcaca tgagtacggc gacgagtatc ctgccatcga atccattctc 480

cgatatgcca aactcaggcg agcctttccc tgcgtggtgg cgagcgacag atcccgatgt 540

cgaccgaaga gattgaggat atttttcttg acctggcgca gaaattcgga ttccagaagg 600

attctatgcg taatatggtg cgtagccatc tctgttagag aagttattta atttttttta 660

aactttctac agtttgactt cttgatgacg ctcttggact cgcgtgcatc gcgaatgacg 720

ccgaaccaag ctttgctgac agtacacgcg gactacatcg gcggacagca tgccaactac 780

cgcaagtggt atttcgcggc gcaactcaac ctcgacgatg cggttggtca gtcccagaac 840

cctggattac agcggctgcg cagcgtatct gggggcggcg tcaagacagc gggtacgaag 900

tcgctggata gtgcattgaa ccggtggcga aatgcgatga ataacatgag ccagtacgat 960

cggctgcgtc aggttgcgct gtacctgttg tgctggggcg aggccgggaa cgtacgattc 1020

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ctttaccgat tcatgcgcga ccaaggttat gaggtcgttg agggcaagtt ctccgcaggg 1200

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agggtcttgc aaaaattgta ttgcaggata atgtatgttc tctatacccg tagttcgcac 1320

cctcgctgac gtaggtccag acccgtctga tagatatccc tcctgcccag cgctttacga 1380

agtttggacg tattgcttgg aaccgtgtct ttttcaagac gttcttcgag aagcgttcgg 1440

ccgcccatct tctcgttaac ttcaatcgca tttggatcct gcacatagcg gtcttctggt 1500

tctacacggc ttacttttcg cccaaagtct acgctccgca taaccaacag aacccgtccg 1560

cgcctatgac gtggtcggcg tccgcgcttg gtggcgctgt agccacgctg atcatgatct 1620

tcgcgacaat ggcagagttt tcgtacatcc ccacgacctg gaacaatgca tcgcatctga 1680

ctacgaggct aattttcttg ctagtggtgc tggcgctcac cggcgggccg acggtatata 1740

ttgccattgt cgacggccgc ccaggccagg gcaacattcc actaatcgtc ggcattgtgc 1800

agttcttcgt atcggttgtc gccacgctca catttggtct gattccgtct ggtcgcatgt 1860

tcggcgatcg tgtcgcgggc aagtcgcgga agtacatggc atcgcagacg ttcacggcgt 1920

catatcccga gctgaagagg acccagcgca ttgcatccat tggactgtgg atgctgattt 1980

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tccaccttgg cctctcaatc tggacgccat ggaaggaggt ctacacgcgg atgccgaaga 2280

ggatctacgc gaagctcttg gcaacggctg agatggaagt gaagtataag ccgaaggtat 2340

gttgatctgc cgcattggta tcatatatgt catactcatt tatttgccag gttctcgtct 2400

cgcaagtctg gaatgccatc attatctcca tgtatcgcga gcaccttcta tccattcaca 2460

acgtgcagcg actcctttac catcaggtcg atggtcccga cggtcatcgt gccctccgcg 2520

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ggccgagcgt cgtatctctt tctttgcgtc ctcgctcacc actgccctcc cggaacccct 2640

gcctgtagat gccatgccta cattcaccgt cttggttccc cattactccg agaagattct 2700

gctcagcttg cgcgagatta tcagggagga ggaccagaac acccgtgtca cgctcctcga 2760

gtaccttaag cagctgcatc ccgtcgaatg ggataacttc gtcaaggaca ccaagatcct 2820

cgctgaggag tctgagacgg tgacgcaatt cgatggcacg gcgaccacga acgagaagcc 2880

cggcagtaag cgcacagatg acttgccctt ctactgcatc ggtttcaaga ctgccgcccc 2940

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tcactctgag ttggacgaga ccactggcaa gaggaagccc aagttccgtg tcgaactgcc 3360

cggaaacccc attctcggtg acggcaagtc tgacaaccag aaccacgcca tcatcttcta 3420

ccgcggcgag ttccttcagc tcatcgatgc caatcaggac aactatctgg aggagtgtat 3480

caagatccgg aacattcttg gcgaattcga gcagtactcc ctgtctagtc agagccctta 3540

tgcacaatgg ggccataagg agttctcgaa agccccggtc gctatcgtcg gtactcgcga 3600

gtacattttc tcggagaaca ttggtattct tggcgatatc gctgccggta aggaacagac 3660

gttcggtacc atgacccccg tgtcctggct tggattggcg gaaagctgca ttacggtcac 3720

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<210> 4

<211> 2201

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 4

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ttcgccggca tgaacgccat cggacgcggt ggtcgtatca aacattcaga atattaccaa 120

tgcggaaagg gtcgtgatct tggctttgga accattctca acttccagac caagcttgga 180

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atcgaccgct tcctcacatt ctattacggc catcctggtt tccacatcaa caacattttg 300

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catcgcaatc atcgcgatcc agcgtgctat tcaaaagttc ctcatctctg tattcctgtc 1620

tcgcgagtac aagcacgatg agaccaatcg tgcgtggtgg tcgggtaaat ggtacggtcg 1680

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tccgcatatg tgccggactc tgatgctaac gaatgatctt ttaggttctg aagtacacgt 2040

ttgtctacgt tgtggtcgtg gcgttcctcg ctgcgctgat cgtcctccgt atgtttatcc 2100

tttattcatt ttgggtgatc cttgctaatc atcatcgcgg cacagctgca cttttccggg 2160

atcacatcac gttacactgt accgtttgcc aaaatatcta a 2201

<210> 5

<211> 528

<212> PRT

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 5

Met Leu Val Ile Leu Ser Val Gln Ile Phe Ile Val Thr Met Val Phe

1 5 10 15

Leu Gly Thr Leu Asn Asp Gln Leu Leu Val Cys Lys Tyr Ser Ser Ser

20 25 30

Gly Gln Phe Ile Gly Thr Thr Gly Cys Tyr Asn Leu Thr Pro Ala Phe

35 40 45

Gln Trp Ile Asp His Cys Ile Ile Ser Ile Phe Leu Val Phe Met Ile

50 55 60

Ala Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Gln Glu Leu Val Glu Arg Gly Thr Gly

65 70 75 80

Lys Ala Val Phe Arg Leu Ala Lys His Phe Gly Ser Ala Ser Pro Ala

85 90 95

Phe Glu Val Phe Ser Thr Gln Ile Ser Ser His Ser Ile Ile Thr Asn

100 105 110

Leu Thr Phe Gly Gly Ala Arg Tyr Ile Ala Thr Gly Arg Gly Phe Ala

115 120 125

Thr Thr Arg Ile Ser Phe Ser Ile Leu Tyr Ser Arg Phe Ala Gly Pro

130 135 140

Ser Ile Tyr Leu Gly Met Arg Thr Leu Ile Met Leu Leu Tyr Val Thr

145 150 155 160

Leu Thr Ile Trp Thr Gly Trp Val Thr Tyr Phe Trp Val Ser Ile Leu

165 170 175

Ala Leu Cys Ile Ser Pro Phe Leu Phe Asn Pro His Gln Phe Ser Phe

180 185 190

Ala Asp Phe Ile Ile Asp Tyr Arg Val Leu Ala Val Asp Glu Pro Arg

195 200 205

Gln Leu Ala Arg Thr Pro Glu Leu Leu Asp Trp Leu Leu Pro Val Ile

210 215 220

Thr Asp Tyr Asp Tyr Arg Leu Gln Glu Glu Glu Ala Arg Ala Ser Ser

225 230 235 240

Glu Lys Leu Ser Gly Asp Val Pro Arg Ala Gly Trp Arg Ala Val Leu

245 250 255

Phe Ser Glu Val Ile Phe Pro Ile Val Met Ala Thr Leu Phe Val Ile

260 265 270

Ala Tyr Met Leu Val Lys Ser Phe Pro Asp Lys Asp Gly Lys Gln Pro

275 280 285

Pro Ser Pro Leu Ile Arg Ile Ala Ile Val Ser Leu Gly Pro Ile Val

290 295 300

Trp Asn Ala Ala Ile Leu Leu Val Leu Phe Met Phe Ser Leu Phe Leu

305 310 315 320

Gly Pro Met Leu Asp Thr Pro Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu Met Ala

325 330 335

Phe Leu Gly His Ser Leu Gly Val Ile Gly Met Ile Ala Phe Phe Glu

340 345 350

Phe Leu Trp Phe Leu Glu Leu Trp Asn Val Ala His Ala Val Leu Gly

355 360 365

Leu Ile Ala Val Ile Phe Ile Gln Arg Ala Ile His Lys Val Leu Ile

370 375 380

Ser Val Phe Leu Ser Arg Glu Phe Lys His Asp Glu Thr Asn Arg Ala

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Trp Trp Thr Gly Lys Trp Tyr Gly Arg Gly Leu Gly Ser His Ala Met

405 410 415

Ser Gln Pro Ala Arg Glu Phe Ile Val Lys Ile Ile Glu Leu Ser Leu

420 425 430

Trp Ser Ser Asp Phe Leu Thr Gly His Leu Leu Leu Phe Leu Leu Thr

435 440 445

Pro Pro Ile Leu Ile Pro Tyr Phe Asp Arg Leu His Ser Thr Met Leu

450 455 460

Phe Trp Leu Arg Pro Ser Lys Gln Ile Arg Ala Pro Leu Tyr Ser Ile

465 470 475 480

Lys Gln Lys Arg Gln Arg Arg Trp Ile Val Ile Lys Tyr Gly Ala Val

485 490 495

Tyr Val Leu Ala Ile Gly Ile Phe Val Ala Leu Ile Val Ile Pro Leu

500 505 510

Val Phe Arg Gln Ser Leu Thr Phe Asn Cys Ser Ile Cys Gln Gln Val

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<210> 6

<211> 1202

<212> PRT

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 6

Met Ala Gly Arg Ser Gly Pro Arg Ser Gln Glu Gly Met Tyr Val Ser

1 5 10 15

Ser Ser Pro Ser Ser Asp Pro His Asp Pro Phe Ser Asn Val His Ala

20 25 30

Gln Met Pro Glu Pro Gln Arg Tyr Tyr Asp Asn Asp Ser Asp Gln Ile

35 40 45

Asp Asn Tyr Gly Arg Arg Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Gly Ser Asn Gly

50 55 60

Gly Asn Asp Asp Asp Arg Tyr Tyr Asp His Asn Gly Ala Tyr Asp Pro

65 70 75 80

Tyr Gly Pro Gln Pro Asp Thr Asp Ser Asp Val Asp Val Tyr Gly Gln

85 90 95

Lys Tyr Ala Pro Ser Ala Glu Ser Leu Gly Pro Pro Arg Val Gly Val

100 105 110

Ser Glu Ser Ser Thr Pro Thr Phe Ile Asp His Asn Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Arg Glu Pro Tyr Pro Ala Trp Ser Ser Glu Arg Gln Ile Pro Leu Ser

130 135 140

Lys Glu Glu Ile Glu Asp Ile Phe Leu Asp Leu Thr Gln Lys Phe Gly

145 150 155 160

Phe Gln Arg Asp Ser Met Arg Asn Met Phe Asp Phe Thr Met Gln Leu

165 170 175

Leu Asp Ser Arg Ala Ser Arg Met Ser Pro Asn Gln Ala Leu Leu Thr

180 185 190

Leu His Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Gln His Ala Asn Tyr Arg Lys Trp

195 200 205

Tyr Phe Ala Ala Gln Leu Asp Leu Asp Asp Ala Ile Gly Gln Thr Gln

210 215 220

Asn Pro Gly Leu Arg Ser Thr Lys Arg Lys Gly His Lys Ala Val Glu

225 230 235 240

Lys Ser Leu Asn Ile Ala Leu Asp Arg Trp Arg Gln Ala Met Asn Asn

245 250 255

Met Ser Gln Tyr Asp Arg Met Arg Gln Ile Ala Leu Tyr Leu Leu Cys

260 265 270

Trp Gly Glu Ala Ala Gln Val Arg Phe Val Pro Glu Cys Leu Cys Phe

275 280 285

Ile Phe Lys Cys Ala Asp Asp Tyr Tyr Arg Ser Pro Glu Cys Gln Ser

290 295 300

Arg Ile Asp Pro Val Pro Glu Gly Leu Tyr Leu His Ala Val Ile Lys

305 310 315 320

Pro Leu Tyr Arg Phe Ile Arg Asp Gln Gly Tyr Glu Val Val Asp Gly

325 330 335

Lys Phe Val Arg Arg Glu Lys Asp His Asp Thr Ile Ile Gly Tyr Asp

340 345 350

Asp Val Asn Gln Leu Phe Trp Tyr Pro Glu Gly Ile Ala Arg Ile Val

355 360 365

Leu Ala Asp Lys Thr Arg Leu Val Asp Leu Ala Pro Ala Gln Arg Phe

370 375 380

Met Lys Phe Asp Arg Ile Asp Trp Asn Arg Ala Phe Phe Lys Thr Ile

385 390 395 400

Trp Val Ile His Val Ser Met Tyr Trp Tyr Tyr Thr Ala Tyr Asn Ser

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Pro Thr Val Tyr Asn Gly Ile Arg Ser Thr Ala Met Arg Trp Ser Ala

420 425 430

Thr Ala Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ile Met Ile Leu Ala Thr

435 440 445

Leu Ala Glu Phe Ser Tyr Ile Pro Thr Thr Trp Asn Asn Thr Ser His

450 455 460

Leu Thr Arg Arg Leu Ile Phe Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu Thr Ala

465 470 475 480

Gly Pro Thr Phe Tyr Ile Ala Ile Ala Glu Ser Ser Ser Pro Gly Gly

485 490 495

Ser Leu Ala Leu Ile Leu Gly Ile Val Gln Phe Phe Ile Ser Val Val

500 505 510

Ala Thr Leu Leu Phe Ala Phe Leu Pro Ser Gly Arg Met Phe Gly Asp

515 520 525

Arg Val Ala Gly Lys Ser Arg Lys Tyr Leu Ala Ser Gln Thr Phe Thr

530 535 540

Ala Ser Tyr Pro Thr Leu Lys Ala Ser Ala Arg Leu Ala Ser Val Cys

545 550 555 560

Leu Trp Ile Leu Val Phe Gly Cys Lys Phe Thr Glu Ser Tyr Phe Leu

565 570 575

Ala Ser Val Cys Leu Trp Ile Leu Val Phe Gly Cys Lys Phe Thr Glu

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Ser Tyr Phe Phe Asn Asp Lys Tyr Phe Gly Asp Asn Leu Cys Arg Asn

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Gln Ala Ala Phe Thr Leu Thr Ile Met Tyr Leu Met Asp Leu Val Leu

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Phe Phe Leu Asp Thr Phe Leu Trp Trp Ile Ile Trp Asn Thr Val Phe

625 630 635 640

Ser Ile Ala Arg Ser Phe Met Leu Gly Leu Ser Ile Trp Thr Pro Trp

645 650 655

Lys Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Pro Lys Arg Ile Tyr Ser Lys Leu Leu

660 665 670

Ala Thr Ser Asp Met Glu Thr Lys Tyr Lys Pro Lys Val Leu Val Ser

675 680 685

Gln Ile Trp Asn Ala Ile Ile Ile Ser Met Tyr Arg Glu His Leu Leu

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Ser Ile Asp His Val Gln Lys Leu Leu Tyr His Gln Val Asp Ala Gly

705 710 715 720

Gln Asp Gly Arg Arg Ser Leu Arg Ala Pro Pro Phe Phe Ile Ser Gln

725 730 735

Ser Asp Lys Gly Phe Lys Gly Glu Phe Phe Thr Pro Gly Ser Glu Ala

740 745 750

Glu Arg Arg Ile Ser Phe Phe Ala Gln Ser Leu Thr Thr Ala Val Pro

755 760 765

Glu Pro Leu Pro Val Asp Ala Met Pro Thr Phe Thr Val Leu Thr Pro

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His Tyr Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Leu Arg Glu Ile Ile Arg Glu

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Glu Asp Gln Asn Thr Arg Val Thr Leu Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Leu

805 810 815

His Pro Val Glu Trp Asp Asn Phe Val Lys Asp Thr Lys Ile Leu Ala

820 825 830

Glu Glu Ser Ala Met Tyr Asn Gly Pro Ser Pro Phe Gly Thr Asp Glu

835 840 845

Lys Gly Gln Ser Lys Thr Asp Asp Leu Pro Phe Tyr Cys Ile Gly Phe

850 855 860

Lys Ser Ala Ala Pro Glu Phe Thr Leu Arg Thr Arg Ile Trp Ala Ser

865 870 875 880

Leu Arg Ala Gln Thr Leu Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Met Asn Tyr

885 890 895

Ser Lys Ala Ile Lys Leu Leu Tyr Arg Val Glu Asn Pro Glu Val Val

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Gln Leu Phe Gly Gly Asn Thr Asp Lys Leu Glu Arg Glu Leu Glu Arg

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Met Ala Arg Arg Lys Phe Lys Phe Val Val Ser Met Gln Arg Tyr Ser

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Lys Phe Asn Arg Glu Glu Gln Glu Asn Ala Glu Phe Leu Leu Arg Ala

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Glu Phe Ile Asn Glu Ser Gly Arg Arg Arg Pro Lys Phe Arg Ile Glu

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Gly Glu Phe Glu Glu Tyr Ser Val Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ala Gln

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<213> 灰树花(Grifola frondosa)

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Tyr Ser Asn Asp Ser Asp Gly Asp Ser Tyr Met Ser Arg Asn Ala Ser

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Ser Ala Ser Ala Ser Leu Ser Leu Arg Gly Gly Glu Arg Gln Ile Pro

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Ser Ala Pro Met Thr Trp Ser Ala Ser Ala Leu Gly Gly Ala Val Ala

355 360 365

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370 375 380

Thr Thr Trp Asn Asn Ala Ser His Leu Thr Thr Arg Leu Ile Phe Leu

385 390 395 400

Leu Val Val Leu Ala Leu Thr Gly Gly Pro Thr Val Tyr Ile Ala Ile

405 410 415

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<213> 灰树花(Grifola frondosa)

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Gln Ser Asn Leu Thr Phe Gly Gly Ala Arg Tyr Ile Ala Thr Gly Arg

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370 375 380

Gly Arg Gln Asn Pro Ser Pro Leu Ile Arg Ile Ala Val Ile Ala Val

385 390 395 400

Gly Pro Val Val Trp Asn Ala Ala Val Leu Leu Ser Leu Phe Phe Ile

405 410 415

Ser Leu Phe Leu Gly Pro Met Leu Glu Ser Trp Thr Lys Phe Ala Ser

420 425 430

Val Val Ala Ala Phe Ala His Phe Leu Ala Leu Ile Gly Leu Val Ala

435 440 445

Phe Phe Glu Phe Phe Trp Phe Leu Glu Leu Trp Asp Ala Ser His Ala

450 455 460

Val Leu Gly Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Gln Arg Ala Ile Gln Lys

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Phe Leu Ile Ser Val Phe Leu Ser Arg Glu Tyr Lys His Asp Glu Thr

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Asn Arg Ala Trp Trp Ser Gly Lys Trp Tyr Gly Arg Gly Leu Gly Thr

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Ser Ala Leu Ser Gln Pro Ala Arg Glu Phe Val Val Lys Ile Val Glu

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Leu Pro Ala Leu Phe Arg Asp His Ile Thr Leu His Cys Thr Val Cys

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<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

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gcgccatcca taaggtcctg atttcggtgt tcctgtcgcg cgagttcaag catgacgaga 60

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accggctaca ctcgacgatg ctctgtgagt agctatgcta tgatttatgc taatgatgtt 300

actgatatcg agtctgcagt ctggttgagg ccgtcaaaac aaatccgcgc accgttgtat 360

tccatcaagc agaagcggca acgtcggtgg attgtcatca agtatggtgc tgtctacgtg 420

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<210> 10

<211> 966

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 10

tcgggatccc cgtcgcatta cacacattgt tcgaacatgt acagagagtt tgacagacaa 60

aacagtaaca cttgtttcga gagagacgct cgtagctaaa cccgatgtcc gaagaggacc 120

ctccccacgc gagtccgcaa gatgaatgcg acagttggtt gccacgagca cagagagcgg 180

caaataccct cgagtcatcg tacggagctt gtcaatccag caaatgtaca cgagcatggc 240

aggatccaat cgtaattagg tggctgagat ctgaccaccg agaatgtgcg ccctagggga 300

tgagtaaacg cacgtttgcg cgtgaatcag cgatgatgct gtacggtggt gcttagagat 360

acgaaaagtt gcaagtgaac gtaaatggag gaaagggact ggttgggaat attcatgaca 420

agctggctag aacaagtcgg aaatctagtc tgaggcaaag ccaccagcgg agagccgttc 480

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agataacgat caccacccca ccctataaga cccctctcca tctctgctct tctccccatc 600

cttcgtctcc aaaaccatta tcctcagcaa tgccagtgag tcctgcagac aatctgcatc 660

gtcttcgagc atccgtctca cccgtggttt tcacaggtca aggtcggaat caacgggtgc 720

gtcggctgtg ggtgtgtgaa cgttcagact gattaatacc gtttctcgtg tcgccctact 780

ccagcttcgg taagaacttg catatttgct ggcttcgccg tgctcacggc agtgtgtagg 840

tcgcattggc cgtattgtgc tccgtaatgc tctcctcaac cccgaaatcg aggtcgtcgc 900

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ccagta 966

<210> 11

<211> 977

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 11

gatttcggca cggctacgga agacggagaa gccaccttca gtggactcga gtaccattta 60

attctatttg tgtttgatcg agacctaata cagcccctac aacgaccatc aaagtcgtat 120

agctaccagt gaggaagtgg actcaaatcg acttcagcaa catctcctgg ataaacttta 180

agcctaaact atacagaata agataggtgg agagcttata ccgagctccc aaatctgtcc 240

agatcatggt tgaccggtgc ctggatcttc ctatagaatc atccttattc gttgacctag 300

ctgattctgg agtgacccag agggtcatga cttgagccta aaatccgccg cctccaccat 360

ttgtagaaaa atgtgacgaa ctcgtgagct ctgtacagtg accggtgact ctttctggca 420

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tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg gaccggccgc ccctccgccc 540

cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat ctattgcatc atcggagaat 600

atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa tgtgaagcca ggggtgtata 660

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gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc gaagtaggta gagcgagtac ccggcgcgta 780

agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct 840

ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga 900

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<210> 12

<211> 1587

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 12

atgcttgtca tcctgtccgt tcagatattc attgtgacga tggttttctt ggggacgttg 60

aacgaccagc tgctcgtctg caagtattcc tcttcgggcc agtttatcgg tacaacagga 120

tgctacaatc tcactcctgc gttccagtgg atcgaccatt gcatcatcag tattttcttg 180

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gagaaattgt cgggtgacgt cccgcgtgcg ggctggcgag cggtcttgtt ctcggaggtc 780

atcttcccca tcgtgatggc caccctgttc gtcatcgcat acatgctcgt gaagtcgttc 840

ccggacaagg atgggaagca accgcccagc cccctcattc gaatcgcaat cgtatctctt 900

gggccgattg tttggaatgc tgcgatattg ctcgtcctgt tcatgttctc gcttttcctt 960

ggaccgatgc tcgacacacc gttccccaag ttcggatcat tgatggcttt ccttgggcac 1020

tcgctcggtg tcatcggcat gatcgcattc ttcgagttcc tctggttcct cgagctgtgg 1080

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aaggtcctga tttcggtgtt cctgtcgcgc gagttcaagc atgacgagac gaaccgggcg 1200

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cgagagttca tcgtgaagat catcgagctg tcgctgtgga gctcagattt cctcactggc 1320

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aagcagaagc ggcaacgtcg gtggattgtc atcaagtatg gtgctgtcta cgtgctcgcg 1500

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aactgcagca tttgccaaca ggtctga 1587

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acagaagggt ctgcacctta a 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtatatgtcg tggagatcta tagg 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgtaagaga aacgcacata ga 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgcagagcac aaataacaca taac 24

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccctcccact tagacccaac 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctggaagtt tagaatggtg cc 22

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagcccttat gcacaatgg 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggtctgtcg tgcacttgtt a 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttctgggtat ccatcctcgc 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatacccaga agtaggtca 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cccatcagtt ctcttttgcg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aagaagaaga ggctcgggca 20

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cccaagcttg cgccatccat aaggtcct 28

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggggtaccga cgatgagggc aacgaag 27

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgggatcccg ttcgcattac acacattg 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggggtaccac tggtgggtac aaatgacg 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgggatcccg ttcgcattac acacattg 28

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggggtaccac tggtgggtac aaatgacg 28

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cccaagcttg cgccatccat aaggtcct 28

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggggtaccga cgatgagggc aacgaag 27

Claims

1.一种分离的灰树花葡聚糖合成酶的编码基因，其包括SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述基因还包括SEQ ID NO .2、SEQID NO .3和SEQ ID NO .4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1-2任一项所述的编码基因，其特征在于，所述基因包括SEQ ID NO .9所示的基因保守序列。

4.权利要求1-3任一项所述基因在改变灰树花葡聚糖合成量中的用途；所述用途包括上调或下调灰树花葡聚糖的合成量。

5.权利要求1-3中任一项所述编码基因编码的蛋白。

6.含有SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的载体，所述载体还包括灰树花gpd启动子序列和构巢曲霉35s启动子序列，所述灰树花gpd启动子序列如SEQ ID NO .10所示，所述构巢曲霉35s启动子序列如SEQ ID NO .11所示。

8.含有权利要求6或7所述重组表达载体的重组工程菌。

9.一种改变灰树花葡聚糖合成量的方法，其特征在于，采用权利要求8所述的重组工程菌，以葡萄糖、淀粉水解物或木质纤维素等底物生产，包括如下步骤：

（2）培养权利要求8所述的重组工程菌，在培养基中活化工程菌种子液，并在相应规模的发酵罐中逐级放大制备种子培养液；

10.根据权利要求9所述的一种改变灰树花葡聚糖合成量的方法，其特征在于，所述发酵罐培养条件：20℃-30℃，通气量0.5-2.0 vvm，搅拌转速50 -500 rpm，培养3-10d；所述摇瓶条件为：20 -30℃，转速80 -200 rpm，培养3-10d。