CN112708571B

CN112708571B - 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用

Info

Publication number: CN112708571B
Application number: CN202110069401.2A
Authority: CN
Inventors: 康振; 陈坚; 堵国成; 金学荣; 李江华; 盛靖雨
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112708571A

Abstract

本发明公开了发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，以毕赤酵母GS115为出发菌株，在细胞内异源表达了硫酸软骨素合成途径相关蛋白：来自大肠杆菌K4的KfoC，KfoA，来自小鼠的软骨素硫酸转移酶C4ST或C6ST，来自枯草芽孢杆菌的UDP‑葡萄糖脱氢酶TuaD，来自普通变形杆菌的硫酸软骨素裂解酶ABCI，得到合成硫酸软骨素A(CSA)和硫酸软骨素C(CSC)的生产菌株，通过控制诱导剂甲醇的浓度和诱导的时间可以得到特定分子量的硫酸软骨素A和C。本发明首次实现了利用微生物发酵碳源合成分子量可控的特定构型的硫酸软骨素。

Description

发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用

技术领域

本发明涉及发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺经过交替连接而成的线性多糖，以蛋白聚糖的形式广泛分布在软骨组织中。CS有着重要的生物学功能。其骨架硫酸软骨素是软骨素经过硫酸转移酶的硫酸化修饰所形成的，根据硫酸化修饰位置的不同，硫酸软骨素可以被分为以下四种类型：硫酸软骨素A(4-O-硫酸化)、硫酸软骨素C(6-O-硫酸化)、硫酸软骨素D(2,6-di-O-硫酸化)和硫酸软骨素E(4,6-di-O-硫酸化)。由于CS有着优良的生物相容性，其应用范围非常广泛，例如医疗健康，保健品，食品及化妆品领域。硫酸化的形式与其生物活性及应用领域息息相关。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C常被用于治疗关节炎，硫酸软骨素E可促进原代神经元的神经突向外生长。

不同分子量的硫酸软骨素其应用范围与功能效果也存在差异。目前商品化的硫酸软骨素严重依赖于动物组织提取。该方法存在许多问题，比如原料周期长，潜在动物病毒传染，环境污染，组织提取的硫酸软骨素结构高度不均一，存在潜在的致病因子，且含有过硫酸角质素，降低医药活性甚至导致失活等。为了得到结构均一性较好、生物安全的硫酸软骨素，许多新的硫酸软骨素获取方式被提出。CN106755205A、CN111621533A公开了利用微生物酶法成功实现了特定构型硫酸软骨素的合成，但是该生产方法需要纯化大量的酶，步骤繁琐，也不能达到对分子量进行调控的目的。本专利为首次报道通过微生物进行特定分子量硫酸软骨素合成。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有制备硫酸软骨素的方法，不能对硫酸软骨素的分子量进行调控，从而实现特定分子量硫酸软骨素的合成。

[技术方案]

本发明的目的在于为了克服现有技术中的问题，通过甘油为碳源首先实现硫酸软骨素的合成，然后通过甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达，实现微生物法定向生产分子量范围为1.2kDa～40kDa的硫酸软骨素A和分子量范围为1.2KDa～32kDa的硫酸软骨素C。

本发明提供了用于发酵生产分子量可控的硫酸软骨素的重组酵母菌，所述重组酵母菌整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI后可实现硫酸软骨素A的合成；或者，整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI后可实现硫酸软骨素C的合成。

所述的重组酵母菌中整合的外源基因KfoC、KfoA来源于大肠杆菌K4；所述TuaD来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168；所述C4ST和C6ST来自家鼠(Mus musculus)；所述硫酸软骨素裂解酶ABCI来自普通变形杆菌。天然的大肠杆菌K4具有合成软骨素能力，其基因组上有软骨素合成相关的至关重要的两个基因即kfoC和kfoA，Bacillus subtilis168的tuaD对软骨素的合成有很好的促进作用，家鼠来源的C4ST和C6ST是目前唯一在微生物中实现活性表达的软骨素4-O-硫酸转移酶、软骨素6-O-硫酸转移酶，普通变形杆菌来源的ABCI可以实现高活性表达。

所述的软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD和软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST，或软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD和软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST，以pGAPZB为表达载体，以P_GAP为启动子，形成组成型表达框，在酵母中持续表达；硫酸软骨素裂解酶ABCI以pAO815为表达载体，以P_AOX为启动子，形成诱导型表达框，在重组酵母菌中用甲醇诱导表达。

所述的KfoC、KfoA、TuaD、C4ST、C6ST和ABCI的编码基因的核苷酸序列分别为SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

所述的重组酵母菌中，多个基因之间通过来自病毒的自切割短肽编码序列连接构建，自切割短肽可选择以下任何一种或几种：P2A、T2A、E2A和F2A，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；或，多个基因之间通过C-末端具有NPGP氨基酸的类似的短肽的编码基因连接构建。

本发明还提供利用所述重组酵母菌株发酵制备特定分子量范围的硫酸软骨素A或硫酸软骨素C的方法，是先利用甘油为碳源培养重组酵母菌株使之合成硫酸软骨素，然后以甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达，以降解硫酸软骨素；通过控制甲醇表达的时间来控制硫酸软骨素的分子量。诱导时间越长，硫酸软骨素的分子量越小。

所述重组酵母菌株的发酵培养基配方为：以g/L计，甘油40，K₂SO₄ 18，MgSO₄·7H₂O14.9，KOH 4.13，85％H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93，4.35mL/PTM1微量元素，其中，PTM1(g/L)：CuSO₄·5H₂O 6，KI 0.09，MnSO₄·H₂O 3，H₃BO₃ 0.02，MoNa₂O₄·2H₂O 0.2，CoCl₂·6H₂ O 0.5，ZnCl₂ 20，FeSO₄·7H₂O 65，生物素0.2，H₂SO₄ 5.0mL。

[有益效果]

1、本发明首次以毕赤酵母为宿主，实现了硫酸软骨素裂解酶的活性表达。

2、本发明克服了毕赤酵母遗传操作的困难，实现了多个基因的整合表达，菌株培养过程中实现抗生素的零添加。

2、本发明的重组酵母菌通过代谢甘油或者葡萄糖可以直接合成特定结构的硫酸软骨素A和C；重组酵母菌Pp001的硫酸软骨素A产量为2.3g/L，重组酵母菌Pp002的硫酸软骨素C产量为1.6g/L。

3、本发明的重组酵母菌通过代谢甘油或者葡萄糖可以直接合成特定分子量的硫酸软骨素，硫酸软骨素A的分子量范围为1.2kDa～40kDa，硫酸软骨素C的分子量范围为1.2KDa～32kDa。

4、本发明利用微生物细胞直接合成硫酸软骨素，与传统组织提取法获得的硫酸软骨素相比，产品结构均一，分子量可控，无潜在致病因子，其质量安全性得以保证。

5、本发明利用微生物直接合成硫酸软骨素，与其他体外酶法催化合成硫酸软骨素相比，简化了操作的繁琐性，避免了体外进行酶的提取纯化及后催化过程，显著的提高了生产效率，降低了成本。

附图说明

图1是部分构建重组质粒图谱，(A)：pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD，(B)：pAO815-ABCI，(C)：pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD。

图2是重组酵母菌Pp001生产硫酸软骨素A的LC-MS图。

图3是重组酵母菌Pp002生产硫酸软骨素C的LC-MS图。

图4重组酵母菌Pp001在控制1％甲醇时分子量随时间的变化曲线。

图5重组酵母菌Pp002在控制1％甲醇时分子量随时间的变化曲线。

具体实施方式

材料：

1.毕赤酵母GS115购自NTCC典型培养物保藏中心。

2.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。

3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。

4.胶回收试剂盒，快切酶购自Thermo fisher Scientific公司。

5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。

6.各种分析纯试剂购自国药集团。

7.GS115感受态制备方法及转化步骤参照Thermo Fisher Invitrogen's PichiaEasyCompo Kit。

8.培养基：LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。

种子培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

毕赤酵母重组菌发酵培养基(g/L)：甘油40，K₂SO₄ 18，MgSO₄·7H₂O 14.9，KOH4.13，85％H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93，4.35mL/PTM1微量元素，其中，PTM1(g/L)：CuSO₄·5H₂O 6，KI 0.09，MnSO₄·H₂O 3，H₃BO₃ 0.02，MoNa₂O₄·2H₂O 0.2，CoCl₂·6H₂ O 0.5，ZnCl₂ 20，FeSO₄·7H₂O 65，生物素0.2，H₂SO₄ 5.0mL。

实施例中设计的引物具体如表1所示。

表1引物序列表

注：下划线序列为同源臂

实施例1：构建pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒和重组菌株Pp001

(1)以合成的基因C4ST，kfoC，kfoA和tuaD(序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ IDNO.5-7所示)为模板，以引物C4-F/C4-R，kfoC-F/kfoC-R，kfoA-F/kfoA-R，tuaD-F/tuaD-R分别进行PCR扩增4个基因，利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒，其中T2A，T2A2和T2A3氨基酸序列均为SEQ ID NO.2，但是具有不同的核苷酸序列，T2A所用的核苷酸序列为GAAGGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGTGGT GAT GTT GAAGAAAAC CCA GGT CCA；T2A2所用核苷酸序列为GAA GGT CGT GGATCCCTACTT ACT TGC GGT GAC GTAGAG GAA AAC CCT GGT CCG；T2A3所用核苷酸序列为GAG GGTAGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTT GAG GAA AAC CCA GGT CCA。

(2)制备毕赤酵母GS115感受态细胞，将上述获得的质粒pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD用快切酶AvrII线性化后转化到感受态细胞中，通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆，得到整合了基因C4ST，kfoC，kfoA和tuaD的重组酵母菌株Pp001。

实施例2：构建pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒和重组菌株Pp002

(1)以合成的基因C6ST，kfoC，kfoA和tuaD(序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.5～7所示)为模板，以引物C6-F/C6-R，kfoC-F/kfoC-R，kfoA-F/kfoA-R，tuaD-F/tuaD-R分别进行PCR扩增4个基因，利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒，其中T2A、T2A2、T2A3序列设计在引物上。

(2)制备毕赤酵母GS115感受态细胞，将上述获得的质粒pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD用快切酶AvrII线性化后转化到感受态细胞中，通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆，得到整合了基因C6ST，kfoC，kfoA和tuaD的重组酵母菌株Pp002。

实施例3：pAO815-ABCI质粒的构建

以合成的基因ABCI(序列分别如SEQ ID NO.10所示)为模板，以引物ABCI-F/ABCI-R，进行PCR扩增，利用一步克隆酶组装连接到pAO815载体上，构建成pAO815-ABCI质粒。

实施例4：Pp003菌株的构建

制备Pp001重组菌感受态细胞，将实施例3获得的pAO815-ABCI质粒用快切酶SalI线性化后电转整合到Pp001重组菌感受态细胞中，用MD平板筛选得到阳性克隆子命名为Pp003重组菌株。

实施例5：Pp004菌株的构建

制备Pp002重组菌感受态细胞，将实施例3获得的pAO815-ABCI质粒用快切酶SalI线性化后电转整合到Pp002重组菌感受态细胞中，用MD平板筛选得到阳性克隆子命名为Pp004重组菌株。

实施例6：重组酵母菌发酵生产特定分子量硫酸软骨素A和C

培养重组菌株产硫酸软骨素

将重组菌株Pp003和Pp004分别进行3-L分批补料发酵。首先，分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中，在30℃220rpm条件下培养16-18h，然后按10％接种量转接至三瓶50mL YPD液体培养基中，于30℃220rpm培养24h左右，然后按10％接种量接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为30℃，pH为5.0，通气量为4.0vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-1000rpm。待发酵培养基中的甘油被消耗殆尽后，以恒速流加方式进行50％(m/v，g/100mL)甘油(含12mL/L PTM1)补料，补料速率为30mL·h^-1·L^-1，持续补料12h。补料结束后继续培养至溶氧反弹。然后添加甲醇进入诱导阶段，转速不变。含12mL·L^-1PTM1的甲醇用于流加诱导并且终浓度控制在1％，甲醇流加速率和培养基中甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。

特定分子量硫酸软骨素A和C样品的收集和处理

硫酸软骨素A和C的分子量大小通过控制甲醇的浓度及发酵时间来获得。当甲醇终浓度控制在1％，诱导培养时间在0～12h时，收集发酵得到的菌体，硫酸软骨素A和C分子量较大，存在于细胞内。如图4所示，当诱导时间为0h时，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为40kDa和32kDa；当诱导时间为12h时，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为12kDa和5kDa。诱导培养时间在16～36h时，离心收集发酵液，此时硫酸软骨素A和C分子量小于10kDa，分泌到细胞外。当诱导时间为16h时，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为8kDa和3kDa；当诱导时间为36h时，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量均为1.2kDa。在诱导时间超过36h后，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的分子量变化得不明显，依然基本接近于1.2kDa。

对于收集得到的菌体的处理方法：用去离子水洗涤菌体两遍后重悬菌体，采用高压匀浆破壁释放细胞内容物。将破壁后的样品置于70℃水浴锅中加热2h沉淀部分蛋白，离心后收集上清。向上清中加4倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素，离心得到沉淀。沉淀复溶于去离子水中，再次加入4倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素。离心得到沉淀烘干后复溶于20mM Tris-HCl(pH7.4)中即为硫酸软骨素样品。

对于收集得到的发酵液的处理方法：向收集得到的发酵上清中加3倍预冷的无水乙醇沉淀大分子的多糖和杂质，离心去除沉淀，小分子量的硫酸软骨素A和C溶解在上清中。将含有乙醇的样品进行冷冻干燥得到小分子的硫酸软骨素A和C的样品。

硫酸软骨素A和C的质谱鉴定

取500μl硫酸软骨素A和C样品，加入5μl硫酸软骨素裂解酶ABCI，置于37℃水浴锅中处理10h。将裂解后的溶液置于90℃加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行LC-MS检测。

LC-MS检测使用HILIC色谱柱(3μm，2.0×150mm，YMC,Japan)。洗脱液A为超纯水，洗脱液B为乙腈。所用的洗脱梯度设定如下：0-2分钟，90％B；2-8分钟，90-50％B；8-12分钟，50％B；12-13分钟，90％B。柱温保持在35℃，流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 100-800的质量范围进行扫描监测。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的二糖分子在负离子模式下质荷比应为458.05。如图2、图3所示的质谱结果可以看出本实施例实现了硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的合成。

硫酸软骨素A和C分子量的测定

取前述步骤收集和处理得到的细胞内和发酵液上清的样品，通过高效体积排阻色谱系统(High performance size exclusion chromatography，HPSEC)检测分子量大小和分子量分布。HPSEC体系是一套安捷伦1260系统，由G1310A泵和G1329B针头和G1362A示差检测器组成。分析条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TM Linear column 7.8×300mm；流动相：0.1mol/L NaNO₃溶液；流速：0.9mL/min；柱温：40℃；进样量：30μl。根据葡聚糖标准样品的洗脱体积，使用凝胶渗透色谱分析法(Gel permeation chromatography，GPC)制作出分子量和洗脱体积之间的标准曲线。在相同的条件下，测出每个样品的洗脱体积，GPC软件可计算出每个样品的重均分子量、数均分子量及分子量分布。根据前述步骤收集和处理细胞内、发酵液上清获取样品的方法，以添加甲醇浓度为1％时为例，检测不同诱导时间下对应分子量大小，如图4和图5分别为硫酸软骨素A和C在不同时间点的分子量大小。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用

<130> BAA201521A

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 1

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 2

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 3

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 病毒

<400> 4

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 5

<211> 2058

<212> DNA

<213> 大肠杆菌K4

<400> 5

atgtcaattt tgaatcaagc tattaatttg tacaagaata agaactacag acaagcattg 60

tcattgttcg aaaaggttgc tgaaatctat gatgtttctt gggttgaagc aaacatcaag 120

ttgtgtcaaa ctgctttgaa tttgtctgaa gaagttgata agttgaacag aaaggctgtt 180

attgatatcg atgctgcaac aaagatcatg tgttctaacg ctaaggcaat ctcattgaac 240

gaagttgaaa agaatgaaat catctcaaag tacagagaaa ttactgctaa gaaatctgaa 300

agagctgaat tgaaagaagt tgaaccaatt ccattagatt ggccatcaga tttgacttta 360

ccaccattgc cagaatctac aaatgattat gtttgggctg gtaaaagaaa ggaattggat 420

gattacccaa gaaagcaatt gatcatcgat ggtttgtcta ttgttattcc aacatacaac 480

agagctaaga tcttggcaat cactttggct tgtttgtgta accaaaagac tatctatgat 540

tacgaagtta ttgttgctga tgatggttca aaagaaaata ttgaagaaat tgttagagaa 600

ttcgaatctt tgttgaacat caagtatgtt agacaaaaag attatggtta ccaattgtgt 660

gcagttagaa atttgggttt gagagctgca aagtacaact acgttgcaat cttggattgt 720

gatatggctc caaatccatt atgggttcaa tcatacatgg aattgttagc agttgatgat 780

aatgttgctt tgatcggtcc aagaaagtac atcgatactt ctaagcatac atacttggat 840

ttcttgtctc aaaaatcatt gattaatgaa atcccagaaa tcatcactaa caatcaagtt 900

gctggtaaag ttgaacaaaa taagtcagtt gattggagaa tcgaacattt caagaacact 960

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gctaagaaat ggttgtttag agcaggttgg tttgatgaag aattcactca ttggggtggt 1080

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ggtaaaaata tcacagttca attgttgcaa caaaaggttc catacttcta cagaaagaaa 1260

gaaaagattg aatctgcaac tttgaagaga gttccattag tttctatcta tatcccagct 1320

tacaactgtt caaagtacat cgttagatgt gttgaatctg cattgaacca aactatcaca 1380

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gaacattatg ctaatcatcc aagagttaga ttcatttctc aaaagaataa gggtattggt 1500

tctgcatcaa atacagctgt tagattgtgt agaggttttt acattggtca attggattct 1560

gatgatttct tggaaccaga tgctgttgaa ttgtgtttgg atgaattcag aaaggatttg 1620

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aacggttaca actggccaat atattctaga gaaaagttga cttcagctat gatctgtcat 1740

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atcaataaga tctgttacaa cagagttttg catggtgaaa acacatctat taagaaattg 1920

gatatccaaa aggaaaatca ttttaaagtt gttaatgaat ctttgtcaag attgggtatt 1980

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<211> 1017

<212> DNA

<213> 大肠杆菌K4

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ttaaataagg gttacaatgt tgttattatt gataatttga ttaattcttc atgtgaatct 120

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gctggtgcaa aatcagttgc tgaatctttg attaaaccaa ttttctatta cgataacaac 300

gtttcaggta cattgcaatt gattaattgt gctattaaaa atgatgttgc aaacttcatt 360

ttctcttctt ctgcaactgt ttacggtgaa tctaagatca tgccagttac agaagattgt 420

catattggtg gtactttgaa cccatacggt acatcaaagt acatctctga attgatgatt 480

agagatattg ctaagaaata ttcagatact aatttcttgt gtttaagata ctttaatcca 540

acaggtgctc atgaatctgg tatgattggt gaatctccag cagatatccc atcaaatttg 600

gttccataca tcttgcaagt tgctatgggt aaattggaaa agttgatggt tttcggtggt 660

gactatccaa ctaaagatgg tacaggtgtt agagattaca tccatgttat ggatttggca 720

gaaggtcatg ttgctgcatt gtcttatttg tttagagata acaacactaa ctaccatgtt 780

tttaatttgg gtactggtaa aggttactct gttttggaat tagtttcaac tttcgaaaag 840

atttctggtg ttagaattcc atacgaaatc gtttcaagaa gagatggtga cattgctgaa 900

tcttggtcat ctccagaaaa ggctaataag tatttgaact ggaaggcaaa gagagaattg 960

gaaacaatgt tagaagatgc atggagatgg caaatgaaaa atccaaatgg ttacatt 1017

<210> 7

<211> 1386

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis 168

<400> 7

atgaagaaaa ttgctgttat tggtactggt tatgttggtt tggtttctgg tacatgtttt 60

gcagaaatcg gtaataaggt tgtttgttgt gatatcgatg aatctaagat cagatcattg 120

aaaaatggtg ttattccaat ctatgaacca ggtttggctg atttggttga aaagaatgtt 180

ttggatcaaa gattgacttt tacaaacgat atcccatctg ctatcagagc atcagatatc 240

atctatattg ctgttggtac tccaatgtca aaaacaggtg aagcagattt gacttatgtt 300

aaagctgcag ctaagacaat cggtgaacat ttgaacggtt acaaagttat tgttaataag 360

tcaactgttc cagttggtac tggtaaattg gttcaatcta tcgttcaaaa agcatctaag 420

ggtagatact cattcgatgt tgtttctaac ccagaatttt tgagagaagg ttctgctatt 480

catgatacta tgaatatgga aagagcagtt attggttcta catcacataa agcagctgca 540

atcatcgaag aattgcatca accattccat gctccagtta ttaaaactaa tttggaatca 600

gcagaaatga tcaagtacgc tgcaaacgca tttttggcaa caaaaatttc ttttattaac 660

gatatcgcta atatttgtga aagagttggt gctgatgttt caaaagttgc agatggtgtt 720

ggtttggatt ctagaatcgg tagaaagttc ttgaaggctg gtatcggttt tggtggttca 780

tgttttccaa aagatactac agcattgttg caaatcgcta agtctgcagg ttaccctttt 840

aaattgattg aagctgttat tgaaacaaat gaaaagcaaa gagttcatat cgttgataaa 900

ttgttgactg ttatgggttc agttaagggt agaacaatct ctgttttggg tttggctttt 960

aaaccaaaca caaacgatgt tagatcagct ccagcattgg atatcatccc aatgttgcaa 1020

caattaggtg ctcatgttaa agcatatgat ccaattgcta ttccagaagc atctgcaatc 1080

ttgggtgaac aagttgaata ctacactgat gtttacgctg caatggaaga tactgatgca 1140

tgtttgatct tgacagattg gccagaagtt aaggaaatgg aattggttaa ggttaagaca 1200

ttgttgaagc aaccagttat tatcgatggt agaaatttgt tttcattaga agaaatgcaa 1260

gctgcaggtt atatctatca ttcaattggt agaccagctg ttagaggtac tgaaccatct 1320

gataaatact ttccaggttt gccattagaa gaattggcaa aagatttggg ttctgttaat 1380

ttgtaa 1386

<210> 8

<211> 1200

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 8

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtgctacg 300

tatatcgagg gaaggtctcc attgcaagaa ttgtacaacc caattcaatt ggaattgtct 360

aacactgcta ttttgcatca aatgagaaga gatcaagtta ctgatacttg tagagctaac 420

tctgctatgt ctagaaagag aagagttttg actccaaacg atttgaaaca tttggttgtt 480

gatgaagatc atgaattgat ttactgttac gttcctaaag ttgcttgtac taattggaaa 540

agattgatga tggttttgtc tggtagaggt aaatattctg atccaatgga aattccagct 600

aacgaagctc atgtttctgc taacttgaag actttgaacc aatactctat tcctgaaatt 660

aatcatagat tgaagtctta catgaagttc ttgtttgtta gagaaccatt tgaaagattg 720

gtttctgctt acagaaacaa gtttactcaa aagtacaata cttcttttca taagagatac 780

ggtactaaga ttattagaag acaaagaaag aatgctactc aagaagcttt gagaaaaggt 840

gatgatgtta aattcgaaga attcgttgct tatttgattg atcctcatac tcaaagagaa 900

gaacctttta atgaacattg gcaaactgtt tactctttgt gtcatccttg tcatattcat 960

tatgatttgg ttggtaagta cgaaactttg gaagaagatt ctaattatgt tttgcaattg 1020

gctggtgttt ctggttactt gaaattccct acttatgcta aatctactag aactactgat 1080

gaaatgacta ctgaattctt ccaaaatatt tctgctgaac atcaaactca attgtatgaa 1140

gtttataaat tggatttctt gatgttcaat tattctgttc ctaattattt gaaattggat 1200

<210> 9

<211> 1416

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

atggaaaagg gtttggcttt gccacaagat tttagagatt tggttcattc tttgaagatt 60

agaggtagat acgttttgtt tttggctttt gttgttattg tttttatttt tattgaaaag 120

gaaaacaaga ttatttctag agtttctgat aagttgaagc aaattccaca ttttgttgct 180

gatgctaact ctactgatcc agctttgttg ttgtctgaaa acgcttcttt gttgtctttg 240

tctgaattgg attctacttt ttctcatttg agatctagat tgcataactt gtctttgcaa 300

ttgggtgttg aaccagctat ggaatctcaa gaagctggtg ctgaaaaacc ttctcaacaa 360

gctggtgctg gtactagaag acatgttttg ttgatggcta ctactagaac tggttcttct 420

tttgttggtg aattttttaa ccaacaaggt aacatttttt acttgtttga accattgtgg 480

catattgaaa gaactgtttt cttccaacaa agaggtgctt ctgctgctgg ttctgctttg 540

gtttatagag atgttttgaa acaattgttg ttgtgtgatt tgtacgtttt ggaacctttc 600

atttctcctc ctcctgaaga tcatttgact caatttttgt ttagaagagg ttcttctaga 660

tctttgtgtg aagatccagt ttgtactcca tttgttaaaa aagttttcga aaagtaccat 720

tgtagaaaca gaagatgtgg tccattgaat gttactttgg ctggtgaagc ttgtagaaga 780

aaggatcatg ttgctttgaa agctgttaga attagacaat tggaattctt gcaaccattg 840

gttgaagatc caagattgga tttgagagtt attcaattgg ttagagatcc tagagctgtt 900

ttggcttcta gaattgttgc tttcgctggt aagtacgaaa attggaagaa gtggttgtct 960

gaaggtcaag atcaattgtc tgaagatgaa gttcaaagat tgagaggtaa ttgtgaatct 1020

attagattgt ctgctgaatt gggtttgaga caaccagctt ggttgagagg tagatatatg 1080

ttggttagat acgaagatgt tgctagaaga cctttgcaaa aagctagaga aatgtattct 1140

ttcgctggta ttcctttgac tccacaagtt gaagattgga ttcaaaagaa tactcaagct 1200

actagagatt cttctgatgt ttattctact caaaaaaatt cttctgaaca attcgaaaaa 1260

tggagattct ctatgccatt caaattggct caagttgttc aagctgcttg tggtcctact 1320

atgcatttgt tcggttataa attggctaga gatgctgctt ctttgactaa tagatctatt 1380

tctttgttgg aagaaagagg tactttctgg gttact 1416

<210> 10

<211> 2967

<212> DNA

<213> 普通变形杆菌

<400> 10

atggccacca gcaatcctgc atttgatcct aaaaatctga tgcagtcaga aatttaccat 60

tttgcacaaa ataacccatt agcagacttc tcatcagata aaaactcaat actaacgtta 120

tctgataaac gtagcattat gggaaaccaa tctcttttat ggaaatggaa aggtggtagt 180

agctttactt tacataaaaa actgattgtc cccaccgata aagaagcatc taaagcatgg 240

ggacgctcat ctacccccgt tttctcattt tggctttaca atgaaaaacc gattgatggt 300

tatcttacta tcgatttcgg agaaaaactc atttcaacca gtgaggctca ggcaggcttt 360

aaagtaaaat tagatttcac tggctggcgt gctgtgggag tctctttaaa taacgatctt 420

gaaaatcgag agatgacctt aaatgcaacc aatacctcct ctgatggtac tcaagacagc 480

attgggcgtt ctttaggtgc taaagtcgat agtattcgtt ttaaagcgcc ttctaatgtg 540

agtcagggtg aaatctatat cgaccgtatt atgttttctg tcgatgatgc tcgctaccaa 600

tggtctgatg atcacgtcaa aactcgctac caaattcctg aaattaattt tacacctgaa 660

aatttagcgg ccattgatct tattcgccaa cgtctaatta atgaatttgt cggaggtgaa 720

aaagagacaa acctcgcatt agaagagaat atcagcaaat taaaaagtga tttcgatgct 780

cttaatattc acactttagc aaatggtgga acgcaaggca gacatctggt cactgataaa 840

caaatcatta tttatcaacc agagaatcca aactcccaag ataaacaact atttgataat 900

tatgttattt taggtaatta cacgacatta atgtttaata ttagccgtgc ttatgtgctg 960

gaaaaagatc ccacacaaaa ggcgcaacta aagcagatgt acttattaat gacaaagcat 1020

ttattagatc aaggctttgt taaagggagt gctttagtga caacccatca ctggggatac 1080

agttctcgtt ggtggtatat ttccacgtta ttaatgtctg atgcactaaa agaagcgaac 1140

ctacaaactc aagtttatga ttcattactg tggtattcac gtgagtttaa aagtagtttt 1200

gatatgaaag taagtgctga tagctctgat ctattttatt tcaatacctt atctcgccaa 1260

catttagcct tattattact agagcctgat gatcaaaagc gtatcaactt agttaatact 1320

ttcagccatt atatcactgg cgcattaacg caagtgccac cgggtggtaa agatggttta 1380

cgcccggatg gtaccgcttg gcgccatgaa ggcaactatc cgggctatag ctttccggcc 1440

ttcaaaaacg ccagccagct gatctatctg ctgcgcgata ccccgtttag cgtgggtgaa 1500

agtggttgga ataacctgaa aaaagcgatg gtttcagcgt ggatctacag taatccagaa 1560

gttggattac cgcttgcagg aagacaccct tttaactcac cttcgttaaa atcagtcgct 1620

caaggctatt actggcttgc catgtctgca aaatcatcgc ctgataaaac acttgcatct 1680

atttatcttg cgattagtga taaaacacaa aatgaatcaa ctgctatttt tggagaaact 1740

attacaccag cgtctttacc tcaaggtttc tatgccttta atggcggtgc ttttggtatt 1800

catcgttggc aagataaaat ggtgacactg aaagcttata acaccaatgt ttggtcatct 1860

gaaatttata acaaagataa ccgttatggc cgttaccaaa gtcatggtgt cgctcaaata 1920

gtgagtaatg gctcgcagct ttcacagggc tatcagcaag aaggttggga ttggaataga 1980

atggaagggg caaccactat tcaccttcct cttaaagact tagacagtcc taaacctcat 2040

accttaatgc aacgtggaga gcgtggattt agcggaacat catcccttga aggtcaatat 2100

ggcatgatgg cattcaatct tatttatccc gccaatcttg agcgttttga tcctaatttc 2160

actgcgaaaa agagtgtatt agccgctgat aatcacttaa tttttattgg tagcaatata 2220

aatagtagtg ataaaaataa aaatgttgaa acgaccttat tccaacatgc cattactcca 2280

acattaaata ccctttggat taatggacaa aagatagaaa acatgcctta tcaaacaaca 2340

cttcaacaag gtgattggtt aattgatagc aatggcaatg gttacttaat tactcaagca 2400

gaaaaagtaa atgtaagtcg ccaacatcag gtttcagcgg aaaataaaaa tcgccaaccg 2460

acagaaggaa actttagctc ggcatggatc gatcacagca ctcgccccaa agatgccagt 2520

tatgagtata tggtcttttt agatgcgaca cctgaaaaaa tgggagagat ggcacaaaaa 2580

ttccgtgaaa ataatgggtt atatcaggtt cttcgtaagg ataaagacgt tcatattatt 2640

ctcgataaac tcagcaatgt aacgggatat gccttttatc agccagcatc aattgaagac 2700

aaatggatca aaaaggttaa taaacctgca attgtgatga ctcatcgaca aaaagacact 2760

cttattgtca gtgcagttac acctgattta aatatgactc gccaaaaagc agcaactcct 2820

gtcaccatca atgtcacgat taatggcaaa tggcaatctg ctgataaaaa tagtgaagtg 2880

aaatatcagg tttctggtga taacactgaa ctgacgttta cgagttactt tggtattcca 2940

caagaaatca aactctcgcc actccct 2967

<210> 11

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctctgttaaa gcaagcagga gacgtggaag aaaaccccgg tcctatgtct atcttaaatc 60

aagcaattaa cctg 74

<210> 12

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

accacaagtc agaagagaac cacgaccttc tccggatcct tacaaatcgt tttcgatttt 60

ctccc 65

<210> 13

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttctcttct gacttgtggt gatgttgaag aaaacccagg tccaatgaac atcctggtca 60

cgggaggcgc 70

<210> 14

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcaccgcaa gtaagtaggg atccacgacc ttctccggat ccttaaatgt acccgttagg 60

gtttttcatc tgccagc 77

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctacttact tgcggtgacg tagaggaaaa ccctggtccg atgaaaaaaa tagctgtcat 60

tggaacagg 69

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctggcggccg ccgcggctcg aggtacctta taaattgacg cttcccaagt ctttagcc 58

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tatttcgaaa cgaggaattc gccaccatgt cggactcaga agtcaatcaa gaag 54

<210> 18

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cacgtctcct gcttgcttta acagagagaa gttcgtggct ccggatcctt aatccaattt 60

caaataatta ggaacagaat aattgaacat caag 94

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tatttcgaaa cgaggaattc gccaccatgt ctccattgca agaattgtac aaccc 55

<210> 20

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cacgtctcct gcttgcttta acagagagaa gttcgtggct ccggatccca atttcaaata 60

attaggaac 69

<210> 21

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctaattattc gaaacgagga attcatggcc accagcaatc ctgcatttga tcctaaaaat 60

c 61

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctgaggaaca gtcatgtcta aggcagggag tggcgagagt ttgatttctt gtgg 54

Claims

1.用于发酵生产硫酸软骨素的重组酵母菌，其特征在于，以毕赤酵母GS115为出发菌株整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI，用于合成硫酸软骨素A；或者，以毕赤酵母GS115为出发菌株整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI，用于合成硫酸软骨素C；

所述KfoC、KfoA来源于大肠杆菌K4；所述TuaD来源于枯草芽孢杆菌168；所述C4ST和C6ST来自家鼠；所述硫酸软骨素裂解酶ABCI来自普通变形杆菌；

所述的KfoC、KfoA、TuaD和C4ST，或KfoC、KfoA、TuaD和软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST，以pGAPZB为表达载体，以P_GAP为启动子，形成组成型表达框，在酵母中持续表达；ABCI以pAO815为表达载体，以P_AOX为启动子，形成诱导型表达框，在重组酵母菌中用甲醇诱导表达；

C4ST、KfoC、KfoA、TuaD的编码基因之间分别用T2A、T2A2、T2A3连接，T2A的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGT GGT GAT GTT GAA GAA AAC CCA GGT CCA；T2A2的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGA TCC CTA CTT ACT TGC GGT GAC GTA GAG GAA AACCCT GGT CCG；T2A3的核苷酸序列为GAG GGT AGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTTGAG GAA AAC CCA GGT CCA；

C6ST、KfoC、KfoA、TuaD的编码基因之间分别用T2A、T2A2、T2A3连接，T2A的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGT GGT GAT GTT GAA GAA AAC CCA GGT CCA；T2A2的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGA TCC CTA CTT ACT TGC GGT GAC GTA GAG GAA AACCCT GGT CCG；T2A3的核苷酸序列为GAG GGT AGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTTGAG GAA AAC CCA GGT CCA。

2.应用权利要求1所述的重组酵母菌发酵生产硫酸软骨素A或硫酸软骨素C的方法，其特征在于，是先利用甘油为碳源培养重组酵母菌株使之合成硫酸软骨素，然后以甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达，以降解硫酸软骨素；通过控制甲醇表达的时间来控制硫酸软骨素的分子量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，种子液的制备：将重组酵母菌单克隆接种至种子培养基中，培养至对数中后期；

第二步，分批发酵：在发酵罐中装入发酵培养基，灭菌后加入第一步制备的种子液，25~32℃发酵72-120 h，搅拌转速为200~800 rpm，通气量为2 ~4 vvm；

第三步，补料发酵：当培养基中葡萄糖或者甘油残留量不足5 g/L时开始流加50%（m/v）甘油，直到细胞OD达到350~450后停止补料；

第四步，诱导表达：直到培养基中无葡萄糖或者甘油后，流加终浓度为0.8%-3%的甲醇，转速保持恒定，25~32℃继续发酵培养0~36 h。