CN112708571B - 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 - Google Patents
发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112708571B CN112708571B CN202110069401.2A CN202110069401A CN112708571B CN 112708571 B CN112708571 B CN 112708571B CN 202110069401 A CN202110069401 A CN 202110069401A CN 112708571 B CN112708571 B CN 112708571B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chondroitin sulfate
- ggt
- chondroitin
- kfoc
- tuad
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01022—UDP-glucose 6-dehydrogenase (1.1.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01017—Glucuronosyltransferase (2.4.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01226—N-Acetylgalactosaminyl-proteoglycan 3-beta-glucuronosyltransferase (2.4.1.226), i.e. chondroitin sulfate glucuronyltransferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
- C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
- C12Y208/02005—Chondroitin 4-sulfotransferase (2.8.2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
- C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
- C12Y208/02017—Chondroitin 6-sulfotransferase (2.8.2.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01183—UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase (hydrolysing) (3.2.1.183)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/0202—Chondroitin-sulfate-ABC endolyase (4.2.2.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
- C12Y402/02021—Chondroitin-sulfate-ABC exolyase (4.2.2.21)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母及其应用,属于生物工程技术领域。本发明利用合成生物学技术和基因工程手段,以毕赤酵母GS115为出发菌株,在细胞内异源表达了硫酸软骨素合成途径相关蛋白:来自大肠杆菌K4的KfoC,KfoA,来自小鼠的软骨素硫酸转移酶C4ST或C6ST,来自枯草芽孢杆菌的UDP‑葡萄糖脱氢酶TuaD,来自普通变形杆菌的硫酸软骨素裂解酶ABCI,得到合成硫酸软骨素A(CSA)和硫酸软骨素C(CSC)的生产菌株,通过控制诱导剂甲醇的浓度和诱导的时间可以得到特定分子量的硫酸软骨素A和C。本发明首次实现了利用微生物发酵碳源合成分子量可控的特定构型的硫酸软骨素。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用,属于生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺经过交替连接而成的线性多糖,以蛋白聚糖的形式广泛分布在软骨组织中。CS有着重要的生物学功能。其骨架硫酸软骨素是软骨素经过硫酸转移酶的硫酸化修饰所形成的,根据硫酸化修饰位置的不同,硫酸软骨素可以被分为以下四种类型:硫酸软骨素A(4-O-硫酸化)、硫酸软骨素C(6-O-硫酸化)、硫酸软骨素D(2,6-di-O-硫酸化)和硫酸软骨素E(4,6-di-O-硫酸化)。由于CS有着优良的生物相容性,其应用范围非常广泛,例如医疗健康,保健品,食品及化妆品领域。硫酸化的形式与其生物活性及应用领域息息相关。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C常被用于治疗关节炎,硫酸软骨素E可促进原代神经元的神经突向外生长。
不同分子量的硫酸软骨素其应用范围与功能效果也存在差异。目前商品化的硫酸软骨素严重依赖于动物组织提取。该方法存在许多问题,比如原料周期长,潜在动物病毒传染,环境污染,组织提取的硫酸软骨素结构高度不均一,存在潜在的致病因子,且含有过硫酸角质素,降低医药活性甚至导致失活等。为了得到结构均一性较好、生物安全的硫酸软骨素,许多新的硫酸软骨素获取方式被提出。CN106755205A、CN111621533A公开了利用微生物酶法成功实现了特定构型硫酸软骨素的合成,但是该生产方法需要纯化大量的酶,步骤繁琐,也不能达到对分子量进行调控的目的。本专利为首次报道通过微生物进行特定分子量硫酸软骨素合成。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有制备硫酸软骨素的方法,不能对硫酸软骨素的分子量进行调控,从而实现特定分子量硫酸软骨素的合成。
[技术方案]
本发明的目的在于为了克服现有技术中的问题,通过甘油为碳源首先实现硫酸软骨素的合成,然后通过甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达,实现微生物法定向生产分子量范围为1.2kDa~40kDa的硫酸软骨素A和分子量范围为1.2KDa~32kDa的硫酸软骨素C。
本发明提供了用于发酵生产分子量可控的硫酸软骨素的重组酵母菌,所述重组酵母菌整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI后可实现硫酸软骨素A的合成;或者,整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI后可实现硫酸软骨素C的合成。
所述的重组酵母菌中整合的外源基因KfoC、KfoA来源于大肠杆菌K4;所述TuaD来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168;所述C4ST和C6ST来自家鼠(Mus musculus);所述硫酸软骨素裂解酶ABCI来自普通变形杆菌。天然的大肠杆菌K4具有合成软骨素能力,其基因组上有软骨素合成相关的至关重要的两个基因即kfoC和kfoA,Bacillus subtilis168的tuaD对软骨素的合成有很好的促进作用,家鼠来源的C4ST和C6ST是目前唯一在微生物中实现活性表达的软骨素4-O-硫酸转移酶、软骨素6-O-硫酸转移酶,普通变形杆菌来源的ABCI可以实现高活性表达。
所述的软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD和软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST,或软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD和软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST,以pGAPZB为表达载体,以PGAP为启动子,形成组成型表达框,在酵母中持续表达;硫酸软骨素裂解酶ABCI以pAO815为表达载体,以PAOX为启动子,形成诱导型表达框,在重组酵母菌中用甲醇诱导表达。
所述的KfoC、KfoA、TuaD、C4ST、C6ST和ABCI的编码基因的核苷酸序列分别为SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
所述的重组酵母菌中,多个基因之间通过来自病毒的自切割短肽编码序列连接构建,自切割短肽可选择以下任何一种或几种:P2A、T2A、E2A和F2A,其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;或,多个基因之间通过C-末端具有NPGP氨基酸的类似的短肽的编码基因连接构建。
本发明还提供利用所述重组酵母菌株发酵制备特定分子量范围的硫酸软骨素A或硫酸软骨素C的方法,是先利用甘油为碳源培养重组酵母菌株使之合成硫酸软骨素,然后以甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达,以降解硫酸软骨素;通过控制甲醇表达的时间来控制硫酸软骨素的分子量。诱导时间越长,硫酸软骨素的分子量越小。
所述重组酵母菌株的发酵培养基配方为:以g/L计,甘油40,K2SO4 18,MgSO4·7H2O14.9,KOH 4.13,85%H3PO4 26.7mL/L,CaSO4·2H2O 0.93,4.35mL/PTM1微量元素,其中,PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6,KI 0.09,MnSO4·H2O 3,H3BO3 0.02,MoNa2O4·2H2O 0.2,CoCl2·6H2 O 0.5,ZnCl2 20,FeSO4·7H2O 65,生物素0.2,H2SO4 5.0mL。
[有益效果]
1、本发明首次以毕赤酵母为宿主,实现了硫酸软骨素裂解酶的活性表达。
2、本发明克服了毕赤酵母遗传操作的困难,实现了多个基因的整合表达,菌株培养过程中实现抗生素的零添加。
2、本发明的重组酵母菌通过代谢甘油或者葡萄糖可以直接合成特定结构的硫酸软骨素A和C;重组酵母菌Pp001的硫酸软骨素A产量为2.3g/L,重组酵母菌Pp002的硫酸软骨素C产量为1.6g/L。
3、本发明的重组酵母菌通过代谢甘油或者葡萄糖可以直接合成特定分子量的硫酸软骨素,硫酸软骨素A的分子量范围为1.2kDa~40kDa,硫酸软骨素C的分子量范围为1.2KDa~32kDa。
4、本发明利用微生物细胞直接合成硫酸软骨素,与传统组织提取法获得的硫酸软骨素相比,产品结构均一,分子量可控,无潜在致病因子,其质量安全性得以保证。
5、本发明利用微生物直接合成硫酸软骨素,与其他体外酶法催化合成硫酸软骨素相比,简化了操作的繁琐性,避免了体外进行酶的提取纯化及后催化过程,显著的提高了生产效率,降低了成本。
附图说明
图1是部分构建重组质粒图谱,(A):pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD,(B):pAO815-ABCI,(C):pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD。
图2是重组酵母菌Pp001生产硫酸软骨素A的LC-MS图。
图3是重组酵母菌Pp002生产硫酸软骨素C的LC-MS图。
图4重组酵母菌Pp001在控制1%甲醇时分子量随时间的变化曲线。
图5重组酵母菌Pp002在控制1%甲醇时分子量随时间的变化曲线。
具体实施方式
材料:
1.毕赤酵母GS115购自NTCC典型培养物保藏中心。
2.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNA Marker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
4.胶回收试剂盒,快切酶购自Thermo fisher Scientific公司。
5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
6.各种分析纯试剂购自国药集团。
7.GS115感受态制备方法及转化步骤参照Thermo Fisher Invitrogen's PichiaEasyCompo Kit。
8.培养基:LB固体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠10,琼脂粉20。
LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠10。
种子培养基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20。
毕赤酵母重组菌发酵培养基(g/L):甘油40,K2SO4 18,MgSO4·7H2O 14.9,KOH4.13,85%H3PO4 26.7mL/L,CaSO4·2H2O 0.93,4.35mL/PTM1微量元素,其中,PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6,KI 0.09,MnSO4·H2O 3,H3BO3 0.02,MoNa2O4·2H2O 0.2,CoCl2·6H2 O 0.5,ZnCl2 20,FeSO4·7H2O 65,生物素0.2,H2SO4 5.0mL。
实施例中设计的引物具体如表1所示。
表1引物序列表
注:下划线序列为同源臂
实施例1:构建pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒和重组菌株Pp001
(1)以合成的基因C4ST,kfoC,kfoA和tuaD(序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ IDNO.5-7所示)为模板,以引物C4-F/C4-R,kfoC-F/kfoC-R,kfoA-F/kfoA-R,tuaD-F/tuaD-R分别进行PCR扩增4个基因,利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上,构建成pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒,其中T2A,T2A2和T2A3氨基酸序列均为SEQ ID NO.2,但是具有不同的核苷酸序列,T2A所用的核苷酸序列为GAAGGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGTGGT GAT GTT GAAGAAAAC CCA GGT CCA;T2A2所用核苷酸序列为GAA GGT CGT GGATCCCTACTT ACT TGC GGT GAC GTAGAG GAA AAC CCT GGT CCG;T2A3所用核苷酸序列为GAG GGTAGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTT GAG GAA AAC CCA GGT CCA。
(2)制备毕赤酵母GS115感受态细胞,将上述获得的质粒pGAPZB-C4ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD用快切酶AvrII线性化后转化到感受态细胞中,通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆,得到整合了基因C4ST,kfoC,kfoA和tuaD的重组酵母菌株Pp001。
实施例2:构建pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒和重组菌株Pp002
(1)以合成的基因C6ST,kfoC,kfoA和tuaD(序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.5~7所示)为模板,以引物C6-F/C6-R,kfoC-F/kfoC-R,kfoA-F/kfoA-R,tuaD-F/tuaD-R分别进行PCR扩增4个基因,利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上,构建成pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD质粒,其中T2A、T2A2、T2A3序列设计在引物上。
(2)制备毕赤酵母GS115感受态细胞,将上述获得的质粒pGAPZB-C6ST-T2A-kfoC-T2A2-kfoA-T2A3-tuaD用快切酶AvrII线性化后转化到感受态细胞中,通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆,得到整合了基因C6ST,kfoC,kfoA和tuaD的重组酵母菌株Pp002。
实施例3:pAO815-ABCI质粒的构建
以合成的基因ABCI(序列分别如SEQ ID NO.10所示)为模板,以引物ABCI-F/ABCI-R,进行PCR扩增,利用一步克隆酶组装连接到pAO815载体上,构建成pAO815-ABCI质粒。
实施例4:Pp003菌株的构建
制备Pp001重组菌感受态细胞,将实施例3获得的pAO815-ABCI质粒用快切酶SalI线性化后电转整合到Pp001重组菌感受态细胞中,用MD平板筛选得到阳性克隆子命名为Pp003重组菌株。
实施例5:Pp004菌株的构建
制备Pp002重组菌感受态细胞,将实施例3获得的pAO815-ABCI质粒用快切酶SalI线性化后电转整合到Pp002重组菌感受态细胞中,用MD平板筛选得到阳性克隆子命名为Pp004重组菌株。
实施例6:重组酵母菌发酵生产特定分子量硫酸软骨素A和C
培养重组菌株产硫酸软骨素
将重组菌株Pp003和Pp004分别进行3-L分批补料发酵。首先,分区划线得到单菌落,挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中,在30℃220rpm条件下培养16-18h,然后按10%接种量转接至三瓶50mL YPD液体培养基中,于30℃220rpm培养24h左右,然后按10%接种量接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中,控制发酵温度为30℃,pH为5.0,通气量为4.0vvm,搅拌转速和溶氧相关联,控制溶氧在30%,搅拌转速在300-1000rpm。待发酵培养基中的甘油被消耗殆尽后,以恒速流加方式进行50%(m/v,g/100mL)甘油(含12mL/L PTM1)补料,补料速率为30mL·h-1·L-1,持续补料12h。补料结束后继续培养至溶氧反弹。然后添加甲醇进入诱导阶段,转速不变。含12mL·L-1PTM1的甲醇用于流加诱导并且终浓度控制在1%,甲醇流加速率和培养基中甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。
特定分子量硫酸软骨素A和C样品的收集和处理
硫酸软骨素A和C的分子量大小通过控制甲醇的浓度及发酵时间来获得。当甲醇终浓度控制在1%,诱导培养时间在0~12h时,收集发酵得到的菌体,硫酸软骨素A和C分子量较大,存在于细胞内。如图4所示,当诱导时间为0h时,硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为40kDa和32kDa;当诱导时间为12h时,硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为12kDa和5kDa。诱导培养时间在16~36h时,离心收集发酵液,此时硫酸软骨素A和C分子量小于10kDa,分泌到细胞外。当诱导时间为16h时,硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量分别为8kDa和3kDa;当诱导时间为36h时,硫酸软骨素A和硫酸软骨素C分子量均为1.2kDa。在诱导时间超过36h后,硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的分子量变化得不明显,依然基本接近于1.2kDa。
对于收集得到的菌体的处理方法:用去离子水洗涤菌体两遍后重悬菌体,采用高压匀浆破壁释放细胞内容物。将破壁后的样品置于70℃水浴锅中加热2h沉淀部分蛋白,离心后收集上清。向上清中加4倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素,离心得到沉淀。沉淀复溶于去离子水中,再次加入4倍预冷的无水乙醇沉淀硫酸软骨素。离心得到沉淀烘干后复溶于20mM Tris-HCl(pH7.4)中即为硫酸软骨素样品。
对于收集得到的发酵液的处理方法:向收集得到的发酵上清中加3倍预冷的无水乙醇沉淀大分子的多糖和杂质,离心去除沉淀,小分子量的硫酸软骨素A和C溶解在上清中。将含有乙醇的样品进行冷冻干燥得到小分子的硫酸软骨素A和C的样品。
硫酸软骨素A和C的质谱鉴定
取500μl硫酸软骨素A和C样品,加入5μl硫酸软骨素裂解酶ABCI,置于37℃水浴锅中处理10h。将裂解后的溶液置于90℃加热10min使蛋白失活变性,离心后取上清进行LC-MS检测。
LC-MS检测使用HILIC色谱柱(3μm,2.0×150mm,YMC,Japan)。洗脱液A为超纯水,洗脱液B为乙腈。所用的洗脱梯度设定如下:0-2分钟,90%B;2-8分钟,90-50%B;8-12分钟,50%B;12-13分钟,90%B。柱温保持在35℃,流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 100-800的质量范围进行扫描监测。硫酸软骨素A和硫酸软骨素C的二糖分子在负离子模式下质荷比应为458.05。如图2、图3所示的质谱结果可以看出本实施例实现了硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的合成。
硫酸软骨素A和C分子量的测定
取前述步骤收集和处理得到的细胞内和发酵液上清的样品,通过高效体积排阻色谱系统(High performance size exclusion chromatography,HPSEC)检测分子量大小和分子量分布。HPSEC体系是一套安捷伦1260系统,由G1310A泵和G1329B针头和G1362A示差检测器组成。分析条件:色谱柱:UltrahydrogelTM Linear column 7.8×300mm;流动相:0.1mol/L NaNO3溶液;流速:0.9mL/min;柱温:40℃;进样量:30μl。根据葡聚糖标准样品的洗脱体积,使用凝胶渗透色谱分析法(Gel permeation chromatography,GPC)制作出分子量和洗脱体积之间的标准曲线。在相同的条件下,测出每个样品的洗脱体积,GPC软件可计算出每个样品的重均分子量、数均分子量及分子量分布。根据前述步骤收集和处理细胞内、发酵液上清获取样品的方法,以添加甲醇浓度为1%时为例,检测不同诱导时间下对应分子量大小,如图4和图5分别为硫酸软骨素A和C在不同时间点的分子量大小。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用
<130> BAA201521A
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 病毒
<400> 1
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 病毒
<400> 2
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 病毒
<400> 3
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 病毒
<400> 4
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 5
<211> 2058
<212> DNA
<213> 大肠杆菌K4
<400> 5
atgtcaattt tgaatcaagc tattaatttg tacaagaata agaactacag acaagcattg 60
tcattgttcg aaaaggttgc tgaaatctat gatgtttctt gggttgaagc aaacatcaag 120
ttgtgtcaaa ctgctttgaa tttgtctgaa gaagttgata agttgaacag aaaggctgtt 180
attgatatcg atgctgcaac aaagatcatg tgttctaacg ctaaggcaat ctcattgaac 240
gaagttgaaa agaatgaaat catctcaaag tacagagaaa ttactgctaa gaaatctgaa 300
agagctgaat tgaaagaagt tgaaccaatt ccattagatt ggccatcaga tttgacttta 360
ccaccattgc cagaatctac aaatgattat gtttgggctg gtaaaagaaa ggaattggat 420
gattacccaa gaaagcaatt gatcatcgat ggtttgtcta ttgttattcc aacatacaac 480
agagctaaga tcttggcaat cactttggct tgtttgtgta accaaaagac tatctatgat 540
tacgaagtta ttgttgctga tgatggttca aaagaaaata ttgaagaaat tgttagagaa 600
ttcgaatctt tgttgaacat caagtatgtt agacaaaaag attatggtta ccaattgtgt 660
gcagttagaa atttgggttt gagagctgca aagtacaact acgttgcaat cttggattgt 720
gatatggctc caaatccatt atgggttcaa tcatacatgg aattgttagc agttgatgat 780
aatgttgctt tgatcggtcc aagaaagtac atcgatactt ctaagcatac atacttggat 840
ttcttgtctc aaaaatcatt gattaatgaa atcccagaaa tcatcactaa caatcaagtt 900
gctggtaaag ttgaacaaaa taagtcagtt gattggagaa tcgaacattt caagaacact 960
gataatttga gattatgtaa tacacctttt agatttttct ctggtggtaa tgttgctttt 1020
gctaagaaat ggttgtttag agcaggttgg tttgatgaag aattcactca ttggggtggt 1080
gaagataacg aattcggtta cagattgtac agagaaggtt gttactttag atcagttgaa 1140
ggtgctatgg cataccatca agaaccacca ggtaaagaaa atgaaactga tagagctgca 1200
ggtaaaaata tcacagttca attgttgcaa caaaaggttc catacttcta cagaaagaaa 1260
gaaaagattg aatctgcaac tttgaagaga gttccattag tttctatcta tatcccagct 1320
tacaactgtt caaagtacat cgttagatgt gttgaatctg cattgaacca aactatcaca 1380
gatttggaag tttgtatctg tgatgatggt tcaactgatg atacattgag aattttacaa 1440
gaacattatg ctaatcatcc aagagttaga ttcatttctc aaaagaataa gggtattggt 1500
tctgcatcaa atacagctgt tagattgtgt agaggttttt acattggtca attggattct 1560
gatgatttct tggaaccaga tgctgttgaa ttgtgtttgg atgaattcag aaaggatttg 1620
tcattggcat gtgtttacac tacaaacaga aacatcgata gagagggtaa tttgatctct 1680
aacggttaca actggccaat atattctaga gaaaagttga cttcagctat gatctgtcat 1740
catttcagaa tgttcactgc tagagcatgg aatttgacag aaggttttaa tgaatctatc 1800
tcaaatgcag ttgattacga tatgtacttg aagttgtcag aagttggtcc ttttaaacat 1860
atcaataaga tctgttacaa cagagttttg catggtgaaa acacatctat taagaaattg 1920
gatatccaaa aggaaaatca ttttaaagtt gttaatgaat ctttgtcaag attgggtatt 1980
aagaaataca aatactctcc attgactaat ttgaacgaat gtagaaagta cacatgggaa 2040
aagattgaaa acgatttg 2058
<210> 6
<211> 1017
<212> DNA
<213> 大肠杆菌K4
<400> 6
atgaatattt tggttactgg tggtgctggt tatattggtt cacatacatc tttatgtttg 60
ttaaataagg gttacaatgt tgttattatt gataatttga ttaattcttc atgtgaatct 120
attagaagaa ttgaattgat tgctaaaaag aaagttactt tctacgaatt gaacatcaac 180
aacgaaaaag aagttaatca aattttgaag aaacataaat ttgattgtat tatgcatttt 240
gctggtgcaa aatcagttgc tgaatctttg attaaaccaa ttttctatta cgataacaac 300
gtttcaggta cattgcaatt gattaattgt gctattaaaa atgatgttgc aaacttcatt 360
ttctcttctt ctgcaactgt ttacggtgaa tctaagatca tgccagttac agaagattgt 420
catattggtg gtactttgaa cccatacggt acatcaaagt acatctctga attgatgatt 480
agagatattg ctaagaaata ttcagatact aatttcttgt gtttaagata ctttaatcca 540
acaggtgctc atgaatctgg tatgattggt gaatctccag cagatatccc atcaaatttg 600
gttccataca tcttgcaagt tgctatgggt aaattggaaa agttgatggt tttcggtggt 660
gactatccaa ctaaagatgg tacaggtgtt agagattaca tccatgttat ggatttggca 720
gaaggtcatg ttgctgcatt gtcttatttg tttagagata acaacactaa ctaccatgtt 780
tttaatttgg gtactggtaa aggttactct gttttggaat tagtttcaac tttcgaaaag 840
atttctggtg ttagaattcc atacgaaatc gtttcaagaa gagatggtga cattgctgaa 900
tcttggtcat ctccagaaaa ggctaataag tatttgaact ggaaggcaaa gagagaattg 960
gaaacaatgt tagaagatgc atggagatgg caaatgaaaa atccaaatgg ttacatt 1017
<210> 7
<211> 1386
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis 168
<400> 7
atgaagaaaa ttgctgttat tggtactggt tatgttggtt tggtttctgg tacatgtttt 60
gcagaaatcg gtaataaggt tgtttgttgt gatatcgatg aatctaagat cagatcattg 120
aaaaatggtg ttattccaat ctatgaacca ggtttggctg atttggttga aaagaatgtt 180
ttggatcaaa gattgacttt tacaaacgat atcccatctg ctatcagagc atcagatatc 240
atctatattg ctgttggtac tccaatgtca aaaacaggtg aagcagattt gacttatgtt 300
aaagctgcag ctaagacaat cggtgaacat ttgaacggtt acaaagttat tgttaataag 360
tcaactgttc cagttggtac tggtaaattg gttcaatcta tcgttcaaaa agcatctaag 420
ggtagatact cattcgatgt tgtttctaac ccagaatttt tgagagaagg ttctgctatt 480
catgatacta tgaatatgga aagagcagtt attggttcta catcacataa agcagctgca 540
atcatcgaag aattgcatca accattccat gctccagtta ttaaaactaa tttggaatca 600
gcagaaatga tcaagtacgc tgcaaacgca tttttggcaa caaaaatttc ttttattaac 660
gatatcgcta atatttgtga aagagttggt gctgatgttt caaaagttgc agatggtgtt 720
ggtttggatt ctagaatcgg tagaaagttc ttgaaggctg gtatcggttt tggtggttca 780
tgttttccaa aagatactac agcattgttg caaatcgcta agtctgcagg ttaccctttt 840
aaattgattg aagctgttat tgaaacaaat gaaaagcaaa gagttcatat cgttgataaa 900
ttgttgactg ttatgggttc agttaagggt agaacaatct ctgttttggg tttggctttt 960
aaaccaaaca caaacgatgt tagatcagct ccagcattgg atatcatccc aatgttgcaa 1020
caattaggtg ctcatgttaa agcatatgat ccaattgcta ttccagaagc atctgcaatc 1080
ttgggtgaac aagttgaata ctacactgat gtttacgctg caatggaaga tactgatgca 1140
tgtttgatct tgacagattg gccagaagtt aaggaaatgg aattggttaa ggttaagaca 1200
ttgttgaagc aaccagttat tatcgatggt agaaatttgt tttcattaga agaaatgcaa 1260
gctgcaggtt atatctatca ttcaattggt agaccagctg ttagaggtac tgaaccatct 1320
gataaatact ttccaggttt gccattagaa gaattggcaa aagatttggg ttctgttaat 1380
ttgtaa 1386
<210> 8
<211> 1200
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 8
atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60
gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120
aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180
gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240
ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtgctacg 300
tatatcgagg gaaggtctcc attgcaagaa ttgtacaacc caattcaatt ggaattgtct 360
aacactgcta ttttgcatca aatgagaaga gatcaagtta ctgatacttg tagagctaac 420
tctgctatgt ctagaaagag aagagttttg actccaaacg atttgaaaca tttggttgtt 480
gatgaagatc atgaattgat ttactgttac gttcctaaag ttgcttgtac taattggaaa 540
agattgatga tggttttgtc tggtagaggt aaatattctg atccaatgga aattccagct 600
aacgaagctc atgtttctgc taacttgaag actttgaacc aatactctat tcctgaaatt 660
aatcatagat tgaagtctta catgaagttc ttgtttgtta gagaaccatt tgaaagattg 720
gtttctgctt acagaaacaa gtttactcaa aagtacaata cttcttttca taagagatac 780
ggtactaaga ttattagaag acaaagaaag aatgctactc aagaagcttt gagaaaaggt 840
gatgatgtta aattcgaaga attcgttgct tatttgattg atcctcatac tcaaagagaa 900
gaacctttta atgaacattg gcaaactgtt tactctttgt gtcatccttg tcatattcat 960
tatgatttgg ttggtaagta cgaaactttg gaagaagatt ctaattatgt tttgcaattg 1020
gctggtgttt ctggttactt gaaattccct acttatgcta aatctactag aactactgat 1080
gaaatgacta ctgaattctt ccaaaatatt tctgctgaac atcaaactca attgtatgaa 1140
gtttataaat tggatttctt gatgttcaat tattctgttc ctaattattt gaaattggat 1200
<210> 9
<211> 1416
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
atggaaaagg gtttggcttt gccacaagat tttagagatt tggttcattc tttgaagatt 60
agaggtagat acgttttgtt tttggctttt gttgttattg tttttatttt tattgaaaag 120
gaaaacaaga ttatttctag agtttctgat aagttgaagc aaattccaca ttttgttgct 180
gatgctaact ctactgatcc agctttgttg ttgtctgaaa acgcttcttt gttgtctttg 240
tctgaattgg attctacttt ttctcatttg agatctagat tgcataactt gtctttgcaa 300
ttgggtgttg aaccagctat ggaatctcaa gaagctggtg ctgaaaaacc ttctcaacaa 360
gctggtgctg gtactagaag acatgttttg ttgatggcta ctactagaac tggttcttct 420
tttgttggtg aattttttaa ccaacaaggt aacatttttt acttgtttga accattgtgg 480
catattgaaa gaactgtttt cttccaacaa agaggtgctt ctgctgctgg ttctgctttg 540
gtttatagag atgttttgaa acaattgttg ttgtgtgatt tgtacgtttt ggaacctttc 600
atttctcctc ctcctgaaga tcatttgact caatttttgt ttagaagagg ttcttctaga 660
tctttgtgtg aagatccagt ttgtactcca tttgttaaaa aagttttcga aaagtaccat 720
tgtagaaaca gaagatgtgg tccattgaat gttactttgg ctggtgaagc ttgtagaaga 780
aaggatcatg ttgctttgaa agctgttaga attagacaat tggaattctt gcaaccattg 840
gttgaagatc caagattgga tttgagagtt attcaattgg ttagagatcc tagagctgtt 900
ttggcttcta gaattgttgc tttcgctggt aagtacgaaa attggaagaa gtggttgtct 960
gaaggtcaag atcaattgtc tgaagatgaa gttcaaagat tgagaggtaa ttgtgaatct 1020
attagattgt ctgctgaatt gggtttgaga caaccagctt ggttgagagg tagatatatg 1080
ttggttagat acgaagatgt tgctagaaga cctttgcaaa aagctagaga aatgtattct 1140
ttcgctggta ttcctttgac tccacaagtt gaagattgga ttcaaaagaa tactcaagct 1200
actagagatt cttctgatgt ttattctact caaaaaaatt cttctgaaca attcgaaaaa 1260
tggagattct ctatgccatt caaattggct caagttgttc aagctgcttg tggtcctact 1320
atgcatttgt tcggttataa attggctaga gatgctgctt ctttgactaa tagatctatt 1380
tctttgttgg aagaaagagg tactttctgg gttact 1416
<210> 10
<211> 2967
<212> DNA
<213> 普通变形杆菌
<400> 10
atggccacca gcaatcctgc atttgatcct aaaaatctga tgcagtcaga aatttaccat 60
tttgcacaaa ataacccatt agcagacttc tcatcagata aaaactcaat actaacgtta 120
tctgataaac gtagcattat gggaaaccaa tctcttttat ggaaatggaa aggtggtagt 180
agctttactt tacataaaaa actgattgtc cccaccgata aagaagcatc taaagcatgg 240
ggacgctcat ctacccccgt tttctcattt tggctttaca atgaaaaacc gattgatggt 300
tatcttacta tcgatttcgg agaaaaactc atttcaacca gtgaggctca ggcaggcttt 360
aaagtaaaat tagatttcac tggctggcgt gctgtgggag tctctttaaa taacgatctt 420
gaaaatcgag agatgacctt aaatgcaacc aatacctcct ctgatggtac tcaagacagc 480
attgggcgtt ctttaggtgc taaagtcgat agtattcgtt ttaaagcgcc ttctaatgtg 540
agtcagggtg aaatctatat cgaccgtatt atgttttctg tcgatgatgc tcgctaccaa 600
tggtctgatg atcacgtcaa aactcgctac caaattcctg aaattaattt tacacctgaa 660
aatttagcgg ccattgatct tattcgccaa cgtctaatta atgaatttgt cggaggtgaa 720
aaagagacaa acctcgcatt agaagagaat atcagcaaat taaaaagtga tttcgatgct 780
cttaatattc acactttagc aaatggtgga acgcaaggca gacatctggt cactgataaa 840
caaatcatta tttatcaacc agagaatcca aactcccaag ataaacaact atttgataat 900
tatgttattt taggtaatta cacgacatta atgtttaata ttagccgtgc ttatgtgctg 960
gaaaaagatc ccacacaaaa ggcgcaacta aagcagatgt acttattaat gacaaagcat 1020
ttattagatc aaggctttgt taaagggagt gctttagtga caacccatca ctggggatac 1080
agttctcgtt ggtggtatat ttccacgtta ttaatgtctg atgcactaaa agaagcgaac 1140
ctacaaactc aagtttatga ttcattactg tggtattcac gtgagtttaa aagtagtttt 1200
gatatgaaag taagtgctga tagctctgat ctattttatt tcaatacctt atctcgccaa 1260
catttagcct tattattact agagcctgat gatcaaaagc gtatcaactt agttaatact 1320
ttcagccatt atatcactgg cgcattaacg caagtgccac cgggtggtaa agatggttta 1380
cgcccggatg gtaccgcttg gcgccatgaa ggcaactatc cgggctatag ctttccggcc 1440
ttcaaaaacg ccagccagct gatctatctg ctgcgcgata ccccgtttag cgtgggtgaa 1500
agtggttgga ataacctgaa aaaagcgatg gtttcagcgt ggatctacag taatccagaa 1560
gttggattac cgcttgcagg aagacaccct tttaactcac cttcgttaaa atcagtcgct 1620
caaggctatt actggcttgc catgtctgca aaatcatcgc ctgataaaac acttgcatct 1680
atttatcttg cgattagtga taaaacacaa aatgaatcaa ctgctatttt tggagaaact 1740
attacaccag cgtctttacc tcaaggtttc tatgccttta atggcggtgc ttttggtatt 1800
catcgttggc aagataaaat ggtgacactg aaagcttata acaccaatgt ttggtcatct 1860
gaaatttata acaaagataa ccgttatggc cgttaccaaa gtcatggtgt cgctcaaata 1920
gtgagtaatg gctcgcagct ttcacagggc tatcagcaag aaggttggga ttggaataga 1980
atggaagggg caaccactat tcaccttcct cttaaagact tagacagtcc taaacctcat 2040
accttaatgc aacgtggaga gcgtggattt agcggaacat catcccttga aggtcaatat 2100
ggcatgatgg cattcaatct tatttatccc gccaatcttg agcgttttga tcctaatttc 2160
actgcgaaaa agagtgtatt agccgctgat aatcacttaa tttttattgg tagcaatata 2220
aatagtagtg ataaaaataa aaatgttgaa acgaccttat tccaacatgc cattactcca 2280
acattaaata ccctttggat taatggacaa aagatagaaa acatgcctta tcaaacaaca 2340
cttcaacaag gtgattggtt aattgatagc aatggcaatg gttacttaat tactcaagca 2400
gaaaaagtaa atgtaagtcg ccaacatcag gtttcagcgg aaaataaaaa tcgccaaccg 2460
acagaaggaa actttagctc ggcatggatc gatcacagca ctcgccccaa agatgccagt 2520
tatgagtata tggtcttttt agatgcgaca cctgaaaaaa tgggagagat ggcacaaaaa 2580
ttccgtgaaa ataatgggtt atatcaggtt cttcgtaagg ataaagacgt tcatattatt 2640
ctcgataaac tcagcaatgt aacgggatat gccttttatc agccagcatc aattgaagac 2700
aaatggatca aaaaggttaa taaacctgca attgtgatga ctcatcgaca aaaagacact 2760
cttattgtca gtgcagttac acctgattta aatatgactc gccaaaaagc agcaactcct 2820
gtcaccatca atgtcacgat taatggcaaa tggcaatctg ctgataaaaa tagtgaagtg 2880
aaatatcagg tttctggtga taacactgaa ctgacgttta cgagttactt tggtattcca 2940
caagaaatca aactctcgcc actccct 2967
<210> 11
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctctgttaaa gcaagcagga gacgtggaag aaaaccccgg tcctatgtct atcttaaatc 60
aagcaattaa cctg 74
<210> 12
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
accacaagtc agaagagaac cacgaccttc tccggatcct tacaaatcgt tttcgatttt 60
ctccc 65
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttctcttct gacttgtggt gatgttgaag aaaacccagg tccaatgaac atcctggtca 60
cgggaggcgc 70
<210> 14
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtcaccgcaa gtaagtaggg atccacgacc ttctccggat ccttaaatgt acccgttagg 60
gtttttcatc tgccagc 77
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cctacttact tgcggtgacg tagaggaaaa ccctggtccg atgaaaaaaa tagctgtcat 60
tggaacagg 69
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctggcggccg ccgcggctcg aggtacctta taaattgacg cttcccaagt ctttagcc 58
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatttcgaaa cgaggaattc gccaccatgt cggactcaga agtcaatcaa gaag 54
<210> 18
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacgtctcct gcttgcttta acagagagaa gttcgtggct ccggatcctt aatccaattt 60
caaataatta ggaacagaat aattgaacat caag 94
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tatttcgaaa cgaggaattc gccaccatgt ctccattgca agaattgtac aaccc 55
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cacgtctcct gcttgcttta acagagagaa gttcgtggct ccggatccca atttcaaata 60
attaggaac 69
<210> 21
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctaattattc gaaacgagga attcatggcc accagcaatc ctgcatttga tcctaaaaat 60
c 61
<210> 22
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctgaggaaca gtcatgtcta aggcagggag tggcgagagt ttgatttctt gtgg 54
Claims (3)
1.用于发酵生产硫酸软骨素的重组酵母菌,其特征在于,以毕赤酵母GS115为出发菌株整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素4-O-硫酸转移酶C4ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI,用于合成硫酸软骨素A;或者,以毕赤酵母GS115为出发菌株整合表达了软骨素合成酶KfoC、UDP-N-乙酰葡萄糖胺C4异构酶KfoA、UDP-葡萄糖脱氢酶TuaD、软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST和硫酸软骨素裂解酶ABCI,用于合成硫酸软骨素C;
所述KfoC、KfoA来源于大肠杆菌K4;所述TuaD来源于枯草芽孢杆菌168;所述C4ST和C6ST来自家鼠;所述硫酸软骨素裂解酶ABCI来自普通变形杆菌;
所述的KfoC、KfoA、TuaD和C4ST,或KfoC、KfoA、TuaD和软骨素6-O-硫酸转移酶C6ST,以pGAPZB为表达载体,以PGAP为启动子,形成组成型表达框,在酵母中持续表达;ABCI以pAO815为表达载体,以PAOX为启动子,形成诱导型表达框,在重组酵母菌中用甲醇诱导表达;
C4ST、KfoC、KfoA、TuaD的编码基因之间分别用T2A、T2A2、T2A3连接,T2A的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGT GGT GAT GTT GAA GAA AAC CCA GGT CCA;T2A2的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGA TCC CTA CTT ACT TGC GGT GAC GTA GAG GAA AACCCT GGT CCG;T2A3的核苷酸序列为GAG GGT AGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTTGAG GAA AAC CCA GGT CCA;
C6ST、KfoC、KfoA、TuaD的编码基因之间分别用T2A、T2A2、T2A3连接,T2A的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGT TCT CTT CTG ACT TGT GGT GAT GTT GAA GAA AAC CCA GGT CCA;T2A2的核苷酸序列为GAA GGT CGT GGA TCC CTA CTT ACT TGC GGT GAC GTA GAG GAA AACCCT GGT CCG;T2A3的核苷酸序列为GAG GGT AGA GGT TCT TTG CTT ACT TGC GGT GAC GTTGAG GAA AAC CCA GGT CCA。
2.应用权利要求1所述的重组酵母菌发酵生产硫酸软骨素A或硫酸软骨素C的方法,其特征在于,是先利用甘油为碳源培养重组酵母菌株使之合成硫酸软骨素,然后以甲醇为诱导剂诱导硫酸软骨素裂解酶ABCI的可控表达,以降解硫酸软骨素;通过控制甲醇表达的时间来控制硫酸软骨素的分子量。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,种子液的制备:将重组酵母菌单克隆接种至种子培养基中,培养至对数中后期;
第二步,分批发酵:在发酵罐中装入发酵培养基,灭菌后加入第一步制备的种子液,25~32℃发酵72-120 h,搅拌转速为200~800 rpm,通气量为2 ~4 vvm;
第三步,补料发酵:当培养基中葡萄糖或者甘油残留量不足5 g/L时开始流加50%(m/v)甘油,直到细胞OD达到350~450后停止补料;
第四步,诱导表达:直到培养基中无葡萄糖或者甘油后,流加终浓度为0.8%-3%的甲醇,转速保持恒定,25~32℃继续发酵培养0~36 h。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110069401.2A CN112708571B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110069401.2A CN112708571B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112708571A CN112708571A (zh) | 2021-04-27 |
CN112708571B true CN112708571B (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=75549344
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110069401.2A Active CN112708571B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112708571B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115232805B (zh) * | 2022-06-02 | 2023-11-17 | 中国海洋大学 | 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108841771A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 江南大学 | 一种产软骨素的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10975405B2 (en) * | 2016-11-14 | 2021-04-13 | Jiangnan University | Method for do novo biosynthesis of chondroitin sulfate |
-
2021
- 2021-01-19 CN CN202110069401.2A patent/CN112708571B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108841771A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 江南大学 | 一种产软骨素的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
基于合成生物学策略实现糖胺聚糖的微生物合成;金学荣等;《中国科学:生命科学》;20190516(第05期);第553-562页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112708571A (zh) | 2021-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109913437B (zh) | 一种硫酸软骨素酶的筛选,鉴定及优化表达 | |
CN109609525A (zh) | 灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用 | |
CN109609530A (zh) | 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用 | |
CN112725319B (zh) | polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用 | |
CN114480465B (zh) | 一种产生2’-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN112708571B (zh) | 发酵生产可控分子量硫酸软骨素的重组酵母菌及其应用 | |
CN114107266B (zh) | 耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用 | |
CN108517327A (zh) | 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用 | |
CN112708569B (zh) | 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用 | |
CN112430589B (zh) | 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用 | |
CN109576239A (zh) | 耐热磷酸化酶及其应用 | |
CN101497863B (zh) | 一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌 | |
WO2023035584A1 (zh) | 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用 | |
CN109609485A (zh) | 一种甲壳素脱乙酰酶及其应用 | |
CN112391330B (zh) | 一种提高重组大肠杆菌酸胁迫抗性的方法 | |
CN117460821A (zh) | 生产透明质酸的重组细胞 | |
CN112725315B (zh) | 一种壳聚糖酶及其突变体在制备壳寡糖中的应用 | |
CN111808836B (zh) | 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用 | |
CN108587996A (zh) | 高产聚γ-谷氨酸的工程菌及其构建方法与应用 | |
CN109112151A (zh) | 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用 | |
CN108265068B (zh) | 重组精氨酸脱亚胺酶及其产业化制备方法和应用 | |
CN111471667A (zh) | 壳聚糖酶Csn-PT及其应用 | |
CN109022471A (zh) | 生产草酸氧化酶的大肠杆菌表达系统、草酸氧化酶的生产方法及其应用 | |
CN109182306A (zh) | 一种降解产物均一的β-琼胶酶及其应用 | |
CN111826368B (zh) | I型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |