CN109112151A

CN109112151A - 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用

Info

Publication number: CN109112151A
Application number: CN201710486320.6A
Authority: CN
Inventors: 李腾; 叶健文; 尹进; 陈祥斌
Original assignee: Beijing Langene Microbial Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Langene Microbial Technology Co Ltd
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2037-06-23
Also published as: CN109112151B; WO2018233703A1

Abstract

本发明涉及一种精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4‑羟基丁酸组成比例的基因盒，含有该基因盒的细菌重组菌，以及制备聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物的方法。所述基因盒包括启动子和4‑羟基丁酸辅酶A转移酶基因或具有4‑羟基丁酸辅酶A转移酶的功能的基因。

Description

一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，含有该基因盒的细菌重组菌，以及制备聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物的方法。

背景技术

全球的塑料产量一直以来都在增加，近年来产量达到了每年3亿吨。如此多的塑料累积在环境中带来了白色污染问题，不仅是影响了陆地环境，更是严重影响了海洋环境。为了解决白色污染问题，生物可降解塑料替代石油基不可降解塑料被认为是减轻塑料对环境负担的出路之一。

聚羟基脂肪酸酯PHA是一类生物聚酯的统称，是唯一完全由微生物合成的生物基材料。根据组成聚酯的单体的结构不同，PHA可以表现出多种力学、拉伸、弹性等材料性能，因此可应用于不同的场景。

在众多种类的PHA之中，目前仅有聚3-羟基丁酸酯(PHB)、聚-3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)、聚-3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)和聚-3-羟基丁酸-4-羟基丁酸酯(P3HB4HB)实现了商业化。PHB是结构最简单的PHA成员，但是因其结晶度高、断裂延伸率低，材料性能脆、韧性差，这些缺点加大了PHB处理的难度，限制了PHB的应用范围。相比而言，其他PHA材料中由于有其他单体组成的掺入，大大影响了PHA的理化性质。例如P3HB4HB中4HB单体含量的不同对其材料学性能有很大的影响，使之可以从硬的高度结晶体到软的弹性体之间变化，其热力学和机械性能也会随4HB单体含量的改变而改变。当4HB单体含量从64mol％上升到100mol％时，P3HB4HB拉伸强度由17Mpa上升至104Mpa；当4HB单体含量从0mol％上升到82mol％时，P3HB4HB的断裂伸长率从5％上升至1320％。这些优良性能使P3HB4HB被认为是最有应用前景的PHA材料之一。

P3HB4HB可通过一些野生型细菌或者经遗传改造的细菌来生产。例如重组大肠杆菌可实现4HB组成比例超过10mol％的P3HB4HB的合成(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichiacoli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)，但是发酵罐中细胞干重只达到23.5克/升，难以实现工业化生产。相比而言，一些野生型细菌在发酵过程中容易达到高密度的细胞生长和高含量的PHA，更适合大规模生产PHA。例如在PHA生产领域研究最广泛的罗氏真养菌，其在添加γ-丁内酯、4-羟基丁酸等相关前体的条件下能够合成P3HB4HB，发酵74h后细胞干重达到51克/升，P3HB4HB含量35％，4HB的比例为32mol％(Song,J.Y.,Kim,B.S.,2005.Characteristicsof Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)Production by Ralstoniaeutropha NCIMB11599and ATCC 17699.Biotechnology and Bioprocess Engineering,10,6,603-606.)。由于相关前体会抑制细菌生长，虽然4HB的比例很高，但是细胞干重和P3HB4HB含量偏低，生产强度只有0.24克/升/小时。目前仍鲜有报道能够同时实现高密度发酵和P3HB4HB中合适的4HB比例(>10mol％)。

盐单胞菌Halomonas是一种嗜盐菌，其特点是生长在高盐浓度环境，由于这种环境下其他微生物难以生长，因此盐单胞菌可用于开发无灭菌开放式连续发酵工艺。盐单胞菌Halomonas sp.TD01已被开发作为平台菌株生产PHB、PHBV及其PHA相关蛋白PhaR和PhaP等。盐单胞菌TD01及其衍生菌可在发酵中达到近80克/升的细胞干重，PHA含量近80％，有潜力作为PHA的工业生产菌(Tan,D.,Xue,Y.S.,Aibaidula,G.,Chen,G.Q.,2011.Unsterile andcontinuous production of polyhydroxybutyrate by HalomonasTD01.Bioresour.Technol.,102,17,8130.)。

盐单胞菌中有相应的遗传操作工具和手段可实现外源质粒转化、基因敲除、基因组上整合外源基因等基因改造。另外，类T7系统的开发实现了基因的可控表达(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-likeexpression systems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)。

野生型盐单胞菌TD01无法以γ-丁内酯、4-羟基丁酸等前体合成P3HB4HB，因为其缺乏能够将4-羟基丁酸转化为4-羟基丁酸辅酶A的酶，而只有辅酶A形态才能被PHA合酶催化为聚合物。因此需要对盐单胞菌进行基因改造，构建代谢通路才能实现P3HB4HB的合成。来自克氏梭状芽胞杆菌的orfZ基因具有4-羟基丁酸辅酶A转移酶的功能，能够将γ-丁内酯水解产生的4-羟基丁酸转化为4-羟基丁酸辅酶A，进而被细菌利用于P3HB4HB的合成。但是用强启动子过表达orfZ基因会对细胞生长产生抑制作用，因此为了在高密度细胞生长、高含量PHA和合适的4HB比例之间取得最佳平衡，需要精细控制orfZ在细菌中的表达量。

现有技术的缺点在于：

1.已有报道的基因改造菌和野生菌能够合成P3HB4HB，但是难以同时满足高细胞干重和合适的4HB比例，不适合工业生产。

2.盐单胞菌Halomonas TD01有潜力作为PHA的工业生产菌，但是野生型无法合成P3HB4HB。

3.合成P3HB4HB所需要导入的orfZ基因，其表达量需要精细调控，否则表达量过高会对细菌生长产生毒性，过低会导致4HB的比例过低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明人进行广泛深入的研究，并最终完成本发明。

本发明的一个目的是提供一种精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其包括启动子和4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因或具有4-羟基丁酸辅酶A转移酶的功能的基因。

本发明的另一个目的是提供一种细菌重组菌。

本发明的再一个目的是提供一种聚羟基脂肪酸酯共聚物的制备方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其包括启动子和4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因或具有4-羟基丁酸辅酶A转移酶的功能的基因。

本发明的基因盒中，所述具有4-羟基丁酸辅酶A转移酶的功能的基因可为将4-羟基丁酸催化为4-羟基丁酸辅酶A的酶的基因，其实例包括来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridium kluyveri)的orfZ基因。

本发明的基因盒中，优选地，所述启动子可为诱导型启动子或组成型启动子。由诱导型启动子表达orfZ的基因盒能够精细调控P3HB4HB中4HB的比例。由组成型启动子表达orfZ的基因盒能够使重组菌在不同尺度发酵过程中均能实现高密度发酵、高含量P3HB4HB生产，且4HB比例不低于10mol％。由组成型启动子表达orfZ的基因盒的效果与诱导型启动子表达orfZ的基因盒的最佳条件效果接近。更优选地，所述启动子可为tac启动子。最优选地，所述启动子可为SEQ ID NO:6所示的DNA分子，或SEQ ID NO:14所示的DNA分子，或将SEQID NO:6或SEQ ID NO:14经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14衍生的DNA分子。

本发明的基因盒中，优选地，所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的核酸序列可为SEQ IDNO:7，或将SEQ ID NO:7经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:7衍生的DNA分子。

本发明的基因盒中，优选地，所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶可为SEQ ID NO:8所示的蛋白质，或将SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:8衍生的蛋白质。

本发明的基因盒中，优选地，所述共聚物可以包括P3HB-co-4HB(3-羟基丁酸-4羟基丁酸共聚酯)，P3HB-co-4HB和P3HB(聚3-羟基丁酸)的掺和物，P3HB-co-4HB和P4HB(聚4-羟基丁酸)的掺和物，以及P3HB-co-4HB、P3HB和P4HB的掺和物。

根据本发明的另一个方面，提供了一种细菌重组菌，其含有本发明的基因盒。

本发明的细菌重组菌中，优选地，所述细菌包括大肠杆菌及其重组菌。

本发明的细菌重组菌中，优选地，所述细菌包括盐单胞菌TD及其重组菌。

本发明的细菌重组菌中，优选地，例如，所述细菌重组菌进一步含有lacI阻遏蛋白、lacO调控元件等。

从实施例结果可以看出，本发明的细菌重组菌中，导入了含有诱导型启动子的基因盒的细菌重组菌能实现P3HB-co-4HB的生产，4HB mol％从0.1％-30％；导入了含有组成型启动子的基因盒的细菌重组菌，其能实现P3HB-co-4HB的生产，4HB mol％为0.1％-30％。上述重组菌在不同尺度发酵罐中生产P3HB4HB表现稳定，具有作为P3HB4HB工业生产菌的潜力。

根据本发明的再一个方面，提供了一种聚羟基脂肪酸酯共聚物的制备方法，其特征在于，利用含有本发明的基因盒的细菌重组菌制备聚羟基脂肪酸酯。

本发明的方法中，优选地，所述共聚物可以包括P3HB-co-4HB(3-羟基丁酸-4羟基丁酸共聚酯)，P3HB-co-4HB和P3HB(聚3-羟基丁酸)的掺和物，P3HB-co-4HB和P4HB(聚4-羟基丁酸)的掺和物，以及P3HB-co-4HB、P3HB和P4HB的掺和物。

本发明的方法中，优选地，所述细菌包括大肠杆菌及其重组菌。

本发明的方法中，优选地，所述细菌包括盐单胞菌TD及其重组菌。

本发明构建的表达orfZ的基因盒，在导入到嗜盐菌Halomonas TD01及其衍生菌后使得重组菌合成的PHA中含有4HB的组分，且4HB的比例可以被精细调控；同时不影响细菌生长，在发酵过程中既能实现高密度生长(细胞干重高)，也能保证P3HB4HB中合适的4HB比例。因此本发明所构建的表达orfZ的基因盒在P3HB4HB的工业生产上具有重要的应用价值。

附图说明

图1为诱导型启动子表达orfZ的基因盒示意图。

具体实施方式

在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)大肠杆菌培养基

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

2)嗜盐菌培养基

60LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

60MMG培养基：60g/L NaCl，30g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L NH₄Cl，0.2g/LMgSO₄，9.65g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，10ml/L微量元素溶液I和1ml/L微量元素溶液II。其中，微量元素溶液I的组成为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl₂，用1M HCl配制。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO₄·7H₂O，30mg/L MnCl₂·4H₂O，300mg/L H₃BO₃，200mg/LCoCl₂·6H₂O，10mg/L CuSO₄·5H₂O，20mg/L NiCl₂·6H₂O，30mg/L NaMoO₄·2H₂O，用1M HCl配制。培养基的最终pH用5M NaOH溶液调至8.5。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。

在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素或25μg/mL的氯霉素。

实施例1：诱导型启动子表达orfZ基因作为基因盒调控P3HB4HB中4HB的比例

用引物(MmP1-orfZ-f和MmP1-orfZ-r)以p68orfZ(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineeredEscherichia coli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板扩增得到orfZ基因片段，用另一对引物(p321-MmP1-f和p321-MmP1-r)以p321-MmP1-gfp(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expression systems used forHalomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)为模板扩增得到质粒骨架片段，通过GibsonAssembly方法连接两个片段，即得到质粒p321-MmP1-orfZ，用MmP1启动子表达orfZ基因。使用的引物如下表：

所得到的诱导型启动子表达orfZ的基因盒序列为：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGCCCATGAGTTAATTATATTTGTGGCATTATAGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACTGGTAACTGCAGAAAAAGCTGTTTCAAAAATAGAAAACCATAGCAGGGTAGTTTTTGCACATGCAGTAGGAGAACCCGTAGATTTAGTAAATGCACTAGTTAAAAATAAGGATAATTATATAGGACTAGAAATAGTTCACATGGTAGCTATGGGCAAAGGTGAATATACAAAAGAGGGTATGCAAAGACATTTTAGACATAATGCTTTATTTGTAGGCGGATGTACTAGAGATGCAGTAAATTCAGGAAGAGCAGATTATACACCTTGTTTTTTCTATGAAGTGCCAAGTTTGTTTAAAGAAAAACGTTTGCCTGTAGATGTAGCACTTATTCAGGTAAGTGAGCCAGATAAATATGGCTACTGCAGTTTTGGAGTTTCCAATGACTATACCAAGCCAGCAGCAGAAAGTGCTAAGCTTGTAATTGCAGAAGTGAATAAAAACATGCCAAGAACTCTTGGAGATTCTTTTATACATGTATCAGATATTGATTATATAGTGGAAGCTTCACACCCATTGTTAGAATTGCAGCCTCCTAAATTGGGAGATGTAGAAAAAGCCATAGGAGAAAACTGTGCATCTTTAATTGAAGATGGAGCTACTCTTCAGCTTGGAATAGGTGCTATACCAGATGCGGTACTTTTATTCTTAAAGAACAAAAAGAATTTAGGAATACATTCTGAGATGATATCAGATGGTGTGATGGAACTGGTGAAGGCAGGGGTTATCAATAACAAGAAAAAGACCCTCCATCCAGGCAAAATAGTTGTAACATTTTTAATGGGAACAAAAAAATTATATGATTTTGTAAACAATAATCCAATGGTAGAAACTTATTCTGTAGATTATGTAAATAATCCACTGGTAATTATGAAAAATGACAATATGGTTTCAATAAATTCTTGTGTTCAAGTAGACTTAATGGGACAAGTATGTTCTGAAAGTATAGGATTGAAACAGATAAGTGGAGTGGGAGGCCAGGTAGATTTTATTAGAGGAGCTAATCTATCAAAGGGTGGAAAGGCTATTATAGCTATACCTTCCACAGCTGGAAAAGGAAAAGTTTCAAGAATAACTCCACTTCTAGATACTGGTGCTGCAGTTACAACTTCTAGAAATGAAGTAGATTATGTAGTTACTGAATATGGTGTTGCTCATCTTAAGGGCAAAACTTTAAGAAATAGGGCAAGAGCTCTAATAAATATCGCTCATCCAAAATTCAGAGAATCATTAATGAATGAATTTAAAAAGAGATTTTAG(SEQ ID NO:5)

所述诱导型启动子表达orfZ的基因盒由两部分组成，其一是诱导型启动子，其二是orfZ基因。

所述诱导型启动子序列为SEQ ID NO:6：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGCCCATGAGTTAATTATATTTGTGGCATTATAGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG

所述orfZ基因序列为SEQ ID NO:7：

ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACTGGTAACTGCAGAAAAAGCTGTTTCAAAAATAGAAAACCATAGCAGGGTAGTTTTTGCACATGCAGTAGGAGAACCCGTAGATTTAGTAAATGCACTAGTTAAAAATAAGGATAATTATATAGGACTAGAAATAGTTCACATGGTAGCTATGGGCAAAGGTGAATATACAAAAGAGGGTATGCAAAGACATTTTAGACATAATGCTTTATTTGTAGGCGGATGTACTAGAGATGCAGTAAATTCAGGAAGAGCAGATTATACACCTTGTTTTTTCTATGAAGTGCCAAGTTTGTTTAAAGAAAAACGTTTGCCTGTAGATGTAGCACTTATTCAGGTAAGTGAGCCAGATAAATATGGCTACTGCAGTTTTGGAGTTTCCAATGACTATACCAAGCCAGCAGCAGAAAGTGCTAAGCTTGTAATTGCAGAAGTGAATAAAAACATGCCAAGAACTCTTGGAGATTCTTTTATACATGTATCAGATATTGATTATATAGTGGAAGCTTCACACCCATTGTTAGAATTGCAGCCTCCTAAATTGGGAGATGTAGAAAAAGCCATAGGAGAAAACTGTGCATCTTTAATTGAAGATGGAGCTACTCTTCAGCTTGGAATAGGTGCTATACCAGATGCGGTACTTTTATTCTTAAAGAACAAAAAGAATTTAGGAATACATTCTGAGATGATATCAGATGGTGTGATGGAACTGGTGAAGGCAGGGGTTATCAATAACAAGAAAAAGACCCTCCATCCAGGCAAAATAGTTGTAACATTTTTAATGGGAACAAAAAAATTATATGATTTTGTAAACAATAATCCAATGGTAGAAACTTATTCTGTAGATTATGTAAATAATCCACTGGTAATTATGAAAAATGACAATATGGTTTCAATAAATTCTTGTGTTCAAGTAGACTTAATGGGACAAGTATGTTCTGAAAGTATAGGATTGAAACAGATAAGTGGAGTGGGAGGCCAGGTAGATTTTATTAGAGGAGCTAATCTATCAAAGGGTGGAAAGGCTATTATAGCTATACCTTCCACAGCTGGAAAAGGAAAAGTTTCAAGAATAACTCCACTTCTAGATACTGGTGCTGCAGTTACAACTTCTAGAAATGAAGTAGATTATGTAGTTACTGAATATGGTGTTGCTCATCTTAAGGGCAAAACTTTAAGAAATAGGGCAAGAGCTCTAATAAATATCGCTCATCCAAAATTCAGAGAATCATTAATGAATGAATTTAAAAAGAGATTTTAG

所述orfZ基因所编码的4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:8：

MEWEEIYKEKLVTAEKAVSKIENHSRVVFAHAVGEPVDLVNALVKNKDNYIGLEIVHMVAMGKGEYTKEGMQRHFRHNALFVGGCTRDAVNSGRADYTPCFFYEVPSLFKEKRLPVDVALIQVSEPDKYGYCSFGVSNDYTKPAAESAKLVIAEVNKNMPRTLGDSFIHVSDIDYIVEASHPLLELQPPKLGDVEKAIGENCASLIEDGATLQLGIGAIPDAVLLFLKNKKNLGIHSEMISDGVMELVKAGVINNKKKTLHPGKIVVTFLMGTKKLYDFVNNNPMVETYSVDYVNNPLVIMKNDNMVSINSCVQVDLMGQVCSESIGLKQISGVGGQVDFIRGANLSKGGKAIIAIPSTAGKGKVSRITPLLDTGAAVTTSRNEVDYVVTEYGVAHLKGKTLRNRARALINIAHPKFRESLMNEFKKRF*(*代表蛋白质的终止密码子)

将质粒p321-MmP1-orfZ转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，再通过接合转化方法(Fu XZ,Tan D,Aibaidula G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a hostfor open production of chemicals.Metab Eng 23:78–91)将质粒最终转入嗜盐菌Halomonas TD-MmP1(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expression systems used for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)。Halomonas TD-MmP1为TD01的改造菌，其基因组上整合了MmP1的RNA聚合酶基因，在添加诱导剂IPTG的情况下表达，表达后特异性识别MmP1启动子，从而实现通过诱导剂调控MmP1启动子下游的基因的表达。因此所得到的重组菌Halomonas TD-MmP1/p321-MmP1-orfZ可调控orfZ基因的表达。相关原理示意图见附图1。

重组菌在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，200rmp，37℃，培养48小时。接种4小时后添加5克/升的γ-丁内酯；同时添加不同浓度的IPTG调控orfZ基因表达，IPTG浓度分别为0μM，1μM，5μM，10μM，50μM，100μM，200μM，400μM，1000μM。

48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，方法如下：

用量筒量取30ml菌液放入50ml离心管，10000rpm离心10min收集菌体。用去离子水重悬细胞洗涤一次，10000rpm离心10min，弃掉上清。将菌体在-80℃冷冻1h后，进行真空冷冻干燥12h以上至完全去除水分。称量取样前后离心管重量，其差值为细胞干重CDW。

酯化液的配制：取485ml无水甲醇，加入1g/L苯甲酸，缓慢加入15ml浓硫酸，即制成约500ml的酯化液。

样品制备：称取30至60mg冷冻干燥后的菌体，精确称重后置于酯化管中，加入2ml酯化液和2ml氯仿。称取10mg左右的PHA样品，同样方式处理作为标准样品。酯化管加盖密封后100度反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1ml去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(GC)分析。

GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，丙酮为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240℃，检测器温度250℃，柱温起始温度为80℃，维持1.5分钟；以30℃/分钟的速率升至140℃并维持0分钟；以40℃/分钟的速率升至240℃并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHA组成及含量。

重组菌Halomonas TD-MmP1/p321-MmP1-orfZ在不同浓度IPTG诱导下合成P3HB4HB的结果如下表所示：

IPTG浓度从0增加到10μM时，重组菌Halomonas TD-MmP1/p321-MmP1-orfZ所合成的P3HB4HB中4HB的比例逐渐增加；当IPTG浓度大于10M时，4HB比例呈下降趋势，且细胞干重CDW也有下降趋势，说明orfZ基因表达量过高影响细胞生长和P3HB4HB中4HB成分的合成。通过诱导剂精细调控orfZ的表达，可控制P3HB4HB中4HB的比例从2.2mol％到11.20mol％的变化范围。

实施例2：组成型启动子表达orfZ基因作为基因盒

上述实施例中可通过诱导剂的浓度来调控重组菌合成的P3HB4HB中的4HB比例，然而在工业生产中诱导剂的添加会带来额外的成本增加。选用合适的组成型启动子，该启动子的表达强度与上述实施例中MmP1启动子在10μM诱导剂浓度下的表达强度相当，则能够在无需添加诱导剂的条件下达到orfZ表达的近似效果。

所用的组成型启动子为tac启动子，来源于p321-Ptac-GFP(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expression systemsused for Halomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)。用引物(Ptac-orfZ-f和Ptac-orfZ-r)以p68orfZ(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources bymetabolically engineered Escherichia coli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板扩增得到orfZ基因片段，该片段替换质粒p321-Ptac-GFP中的gfp基因，得到质粒p321-Ptac-orfZ，该质粒含有组成型的tac启动子表达orfZ基因的基因盒。使用的引物如下表：

所得到的组成型启动子表达orfZ的基因盒序列为：

TGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACTGGTAACTGCAGAAAAAGCTGTTTCAAAAATAGAAAACCATAGCAGGGTAGTTTTTGCACATGCAGTAGGAGAACCCGTAGATTTAGTAAATGCACTAGTTAAAAATAAGGATAATTATATAGGACTAGAAATAGTTCACATGGTAGCTATGGGCAAAGGTGAATATACAAAAGAGGGTATGCAAAGACATTTTAGACATAATGCTTTATTTGTAGGCGGATGTACTAGAGATGCAGTAAATTCAGGAAGAGCAGATTATACACCTTGTTTTTTCTATGAAGTGCCAAGTTTGTTTAAAGAAAAACGTTTGCCTGTAGATGTAGCACTTATTCAGGTAAGTGAGCCAGATAAATATGGCTACTGCAGTTTTGGAGTTTCCAATGACTATACCAAGCCAGCAGCAGAAAGTGCTAAGCTTGTAATTGCAGAAGTGAATAAAAACATGCCAAGAACTCTTGGAGATTCTTTTATACATGTATCAGATATTGATTATATAGTGGAAGCTTCACACCCATTGTTAGAATTGCAGCCTCCTAAATTGGGAGATGTAGAAAAAGCCATAGGAGAAAACTGTGCATCTTTAATTGAAGATGGAGCTACTCTTCAGCTTGGAATAGGTGCTATACCAGATGCGGTACTTTTATTCTTAAAGAACAAAAAGAATTTAGGAATACATTCTGAGATGATATCAGATGGTGTGATGGAACTGGTGAAGGCAGGGGTTATCAATAACAAGAAAAAGACCCTCCATCCAGGCAAAATAGTTGTAACATTTTTAATGGGAACAAAAAAATTATATGATTTTGTAAACAATAATCCAATGGTAGAAACTTATTCTGTAGATTATGTAAATAATCCACTGGTAATTATGAAAAATGACAATATGGTTTCAATAAATTCTTGTGTTCAAGTAGACTTAATGGGACAAGTATGTTCTGAAAGTATAGGATTGAAACAGATAAGTGGAGTGGGAGGCCAGGTAGATTTTATTAGAGGAGCTAATCTATCAAAGGGTGGAAAGGCTATTATAGCTATACCTTCCACAGCTGGAAAAGGAAAAGTTTCAAGAATAACTCCACTTCTAGATACTGGTGCTGCAGTTACAACTTCTAGAAATGAAGTAGATTATGTAGTTACTGAATATGGTGTTGCTCATCTTAAGGGCAAAACTTTAAGAAATAGGGCAAGAGCTCTAATAAATATCGCTCATCCAAAATTCAGAGAATCATTAATGAATGAATTTAAAAAGAGATTTTAG(SEQ IDNO:13)

所述组成型启动子表达orfZ的基因盒由两部分组成，其一是组成型启动子，其二是orfZ基因。

所述组成型启动子序列为SEQ ID NO:14：

TGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAAATTTAACAAGACAGGATAGGGAGGAGATAACTTTT

所述orfZ基因序列同实施例1。

所述orfZ基因所编码的4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸序列同实施例1。

将质粒p321-Ptac-orfZ转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法导入盐单胞菌Halomonas TD01(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4353)，得到重组菌Halomonas TD01/p321-Ptac-orfZ。该重组菌为基因盒以质粒形式导入到嗜盐菌中。

质粒载体表达基因的时候需要向培养基中添加抗生素来维持质粒稳定性，这在工业生产中也会带来额外成本。将基因整合到细菌的基因组上则无需添加抗生素也能使基因稳定存在，因此更适合工业生产的需求。本实施例中将Ptac-orfZ的基因盒整合到了Halomonas TD01的基因组上，具体步骤如下：

以Halomonas TD01基因组为模板进行PCR扩增得到片段H1和H2，以p321-Ptac-orfZ为模板PCR扩增得到Ptac-orfZ片段，将H1、H2和Ptac-orfZ进行overlap extensionPCR(OE PCR)，得到H1-Ptac-orfZ-H2片段。将该片段通过Gibson Assembly方法连入质粒pRE112-6IsceI(Fu,X.Z.,Tan,D.,Aibaidula,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as a host for open production ofchemicals.Metab.Eng.,23,2,78-91.)的XbaI和SphI位点之间，得到重组质粒pRE112-6ISceI-orfZ。使用的引物如下表：

将重组质粒pRE112-6ISceI-orfZ转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Halomonas TD01中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用25g/ml氯霉素抗性的60LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

诱导质粒pBBR1MCS1-ISceI(Fu,X.Z.,Tan,D.,Aibaidula,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as a host for open production ofchemicals.Metab.Eng.,23,2,78-91.)表达一种归为内切酶I-SceI，将第一次同源重组菌的基因组上的6个I-SceI位点进行切割，产生双链DNA缺口，从而诱发第二次同源重组的发生，产生突变型或者野生型，然后通过特异的PCR引物将突变株筛选出来。将诱导质粒pBBR1MCS1-ISceI通过接合转化方法导入上述第一次同源重组菌，在100g/ml壮观霉素的60LB平板上筛选得到阳性克隆。该阳性克隆为基因组上整合了Ptac-orfZ基因盒，能够组成型表达orfZ基因，得到的重组菌为Halomonas TD40。

本实施例中Ptac-orfZ基因盒在基因组上整合的位点包括但不限于上文所述的特定位点。其他位点的选择由引物H1-pre112-f/H1-pre112-r和H2-pre112-f/H2-pre112-r的具体序列所决定。

综上所述，重组菌Halomonas TD40为基因盒Ptac-orfZ(组成型启动子)在基因组上表达；重组菌Halomonas TD01/p321-Ptac-orfZ为基因盒Ptac-orfZ在质粒上表达；重组菌Halomonas TD-MmP1/p321-MmP1-orfZ为基因盒MmP1-orfZ(诱导型启动子)在质粒上表达。上述3个重组菌与出发菌Halomonas TD01均在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，200rmp，37℃，培养48小时。接种4小时后添加5克/升的γ-丁内酯。其中Halomonas TD-MmP1/p321-MmP1-orfZ接种4小时后额外添加10μM的IPTG。

48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，方法同实施例1所述，结果如下表所示：

出发菌Halomonas TD01只能合成P3HB而不含4HB组分，3个重组菌导入了表达orfZ的基因盒后均能合成P3HB4HB。组成型启动子表达orfZ的基因盒Ptac-orfZ导入到嗜盐菌Halomonas后合成的P3HB4HB中4HB比例达到8.86mol％以上，与诱导型启动子表达orfZ的最优条件相当。

实施例3：重组菌通过高密度发酵生产P3HB4HB

重组菌Halomonas TD40分别在1升、7升、1000升发酵罐中进行P3HB4HB的发酵生产，具体方法如下：

1升发酵罐中装液量为600毫升；培养基为60MMG，其中酵母膏替换为20克/升的玉米浆，NH₄Cl的用量为3克/升，另外添加2克/升的尿素；发酵温度控制在37℃，pH通过5MNaOH溶液控制在8.5；初始搅拌速度为200rpm，最高为800rpm；采用溶氧控制策略，保持溶氧在20％以上；空气通气量为0.7vvm；补料溶液为800克/升葡萄糖、18克/升NH₄Cl和30克/升γ-丁内酯，采用流加方式并保持发酵液中葡萄糖浓度在5-10克/升。48小时结束发酵过程，检测发酵液中的细胞干重CDW和PHA含量及4HB比例，检测方法同实施例1中所述。

7升发酵罐中装液量为3升，其余条件同上述1升发酵罐。48小时结束发酵过程，检测发酵液中的细胞干重CDW和PHA含量及4HB比例，检测方法同上所述。

1000升发酵罐中装液量为600升。1级种子液为250毫升摇瓶中装有120毫升培养基，37℃200rpm培养12h；接入装有1.2升培养基的5升摇瓶中，37℃200rpm培养12h，为2级种子液；接入装有60升培养基的100升发酵罐中，为3级种子液，发酵温度控制在37℃，pH通过5M NaOH溶液控制在8.5，初始搅拌速度为200rpm，最高为800rpm，采用溶氧控制策略，保持溶氧在20％以上，空气通气量为0.7vvm。3级种子液的培养基全部接种至1000升发酵罐中，培养条件同上1升和7升发酵罐。48小时结束发酵过程，检测发酵液中的细胞干重CDW和PHA含量及4HB比例，检测方法同上所述。

1升、7升、1000升发酵罐中重组菌Halomonas TD40生产P3HB4HB的相关检测结果如下表所示：

重组菌Halomonas TD40在不同尺度发酵过程中均能实现高密度发酵、高含量P3HB4HB生产，且4HB比例不低于10mol％，具有作为P3HB4HB工业生产菌的潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京蓝晶微生物科技有限公司

<120> 一种精细调控共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒及其应用

<130> DI17-0807-XC37

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MmP1-orfZ-f

<400> 1

ctagagaaag aggagaaata ctagatggag tgggaagaga tata 44

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MmP1-orfZ-r

<400> 2

atttgatgcc tggcttatca ctaaaatctc tttttaaatt cattc 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p321-MmP1-f

<400> 3

gaatgaattt aaaaagagat tttagtgata agccaggcat caaat 45

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p321-MmP1-r

<400> 4

tatatctctt cccactccat ctagtatttc tcctctttct ctag 44

<210> 5

<211> 1473

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 诱导型启动子表达orfZ的基因盒

<400> 5

atgcctccac accgctcgtc acatcctgcc catgagttaa ttatatttgt ggcattatag 60

ggaattgtga gcgctcacaa ttagctgtca ccggatgtgc tttccggtct gatgagtccg 120

tgaggacgaa acagcctcta caaataattt tgtttaatac tagagaaaga ggagaaatac 180

tagatggagt gggaagagat atataaagag aaactggtaa ctgcagaaaa agctgtttca 240

aaaatagaaa accatagcag ggtagttttt gcacatgcag taggagaacc cgtagattta 300

gtaaatgcac tagttaaaaa taaggataat tatataggac tagaaatagt tcacatggta 360

gctatgggca aaggtgaata tacaaaagag ggtatgcaaa gacattttag acataatgct 420

ttatttgtag gcggatgtac tagagatgca gtaaattcag gaagagcaga ttatacacct 480

tgttttttct atgaagtgcc aagtttgttt aaagaaaaac gtttgcctgt agatgtagca 540

cttattcagg taagtgagcc agataaatat ggctactgca gttttggagt ttccaatgac 600

tataccaagc cagcagcaga aagtgctaag cttgtaattg cagaagtgaa taaaaacatg 660

ccaagaactc ttggagattc ttttatacat gtatcagata ttgattatat agtggaagct 720

tcacacccat tgttagaatt gcagcctcct aaattgggag atgtagaaaa agccatagga 780

gaaaactgtg catctttaat tgaagatgga gctactcttc agcttggaat aggtgctata 840

ccagatgcgg tacttttatt cttaaagaac aaaaagaatt taggaataca ttctgagatg 900

atatcagatg gtgtgatgga actggtgaag gcaggggtta tcaataacaa gaaaaagacc 960

ctccatccag gcaaaatagt tgtaacattt ttaatgggaa caaaaaaatt atatgatttt 1020

gtaaacaata atccaatggt agaaacttat tctgtagatt atgtaaataa tccactggta 1080

attatgaaaa atgacaatat ggtttcaata aattcttgtg ttcaagtaga cttaatggga 1140

caagtatgtt ctgaaagtat aggattgaaa cagataagtg gagtgggagg ccaggtagat 1200

tttattagag gagctaatct atcaaagggt ggaaaggcta ttatagctat accttccaca 1260

gctggaaaag gaaaagtttc aagaataact ccacttctag atactggtgc tgcagttaca 1320

acttctagaa atgaagtaga ttatgtagtt actgaatatg gtgttgctca tcttaagggc 1380

aaaactttaa gaaatagggc aagagctcta ataaatatcg ctcatccaaa attcagagaa 1440

tcattaatga atgaatttaa aaagagattt tag 1473

<210> 6

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 诱导型启动子

<400> 6

atgcctccac accgctcgtc acatcctgcc catgagttaa ttatatttgt ggcattatag 60

ggaattgtga gcgctcacaa ttagctgtca ccggatgtgc tttccggtct gatgagtccg 120

tgaggacgaa acagcctcta caaataattt tgtttaatac tagagaaaga ggagaaatac 180

tag 183

<210> 7

<211> 1290

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ基因

<400> 7

atggagtggg aagagatata taaagagaaa ctggtaactg cagaaaaagc tgtttcaaaa 60

atagaaaacc atagcagggt agtttttgca catgcagtag gagaacccgt agatttagta 120

aatgcactag ttaaaaataa ggataattat ataggactag aaatagttca catggtagct 180

atgggcaaag gtgaatatac aaaagagggt atgcaaagac attttagaca taatgcttta 240

tttgtaggcg gatgtactag agatgcagta aattcaggaa gagcagatta tacaccttgt 300

tttttctatg aagtgccaag tttgtttaaa gaaaaacgtt tgcctgtaga tgtagcactt 360

attcaggtaa gtgagccaga taaatatggc tactgcagtt ttggagtttc caatgactat 420

accaagccag cagcagaaag tgctaagctt gtaattgcag aagtgaataa aaacatgcca 480

agaactcttg gagattcttt tatacatgta tcagatattg attatatagt ggaagcttca 540

cacccattgt tagaattgca gcctcctaaa ttgggagatg tagaaaaagc cataggagaa 600

aactgtgcat ctttaattga agatggagct actcttcagc ttggaatagg tgctatacca 660

gatgcggtac ttttattctt aaagaacaaa aagaatttag gaatacattc tgagatgata 720

tcagatggtg tgatggaact ggtgaaggca ggggttatca ataacaagaa aaagaccctc 780

catccaggca aaatagttgt aacattttta atgggaacaa aaaaattata tgattttgta 840

aacaataatc caatggtaga aacttattct gtagattatg taaataatcc actggtaatt 900

atgaaaaatg acaatatggt ttcaataaat tcttgtgttc aagtagactt aatgggacaa 960

gtatgttctg aaagtatagg attgaaacag ataagtggag tgggaggcca ggtagatttt 1020

attagaggag ctaatctatc aaagggtgga aaggctatta tagctatacc ttccacagct 1080

ggaaaaggaa aagtttcaag aataactcca cttctagata ctggtgctgc agttacaact 1140

tctagaaatg aagtagatta tgtagttact gaatatggtg ttgctcatct taagggcaaa 1200

actttaagaa atagggcaag agctctaata aatatcgctc atccaaaatt cagagaatca 1260

ttaatgaatg aatttaaaaa gagattttag 1290

<210> 8

<211> 429

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ基因所编码的4-羟基丁酸辅酶A转移酶的氨基酸

<400> 8

Met Glu Trp Glu Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala Glu Lys

1 5 10 15

Ala Val Ser Lys Ile Glu Asn His Ser Arg Val Val Phe Ala His Ala

20 25 30

Val Gly Glu Pro Val Asp Leu Val Asn Ala Leu Val Lys Asn Lys Asp

35 40 45

Asn Tyr Ile Gly Leu Glu Ile Val His Met Val Ala Met Gly Lys Gly

50 55 60

Glu Tyr Thr Lys Glu Gly Met Gln Arg His Phe Arg His Asn Ala Leu

65 70 75 80

Phe Val Gly Gly Cys Thr Arg Asp Ala Val Asn Ser Gly Arg Ala Asp

85 90 95

Tyr Thr Pro Cys Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Leu Phe Lys Glu Lys

100 105 110

Arg Leu Pro Val Asp Val Ala Leu Ile Gln Val Ser Glu Pro Asp Lys

115 120 125

Tyr Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Asn Asp Tyr Thr Lys Pro Ala

130 135 140

Ala Glu Ser Ala Lys Leu Val Ile Ala Glu Val Asn Lys Asn Met Pro

145 150 155 160

Arg Thr Leu Gly Asp Ser Phe Ile His Val Ser Asp Ile Asp Tyr Ile

165 170 175

Val Glu Ala Ser His Pro Leu Leu Glu Leu Gln Pro Pro Lys Leu Gly

180 185 190

Asp Val Glu Lys Ala Ile Gly Glu Asn Cys Ala Ser Leu Ile Glu Asp

195 200 205

Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Val Leu

210 215 220

Leu Phe Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Gly Ile His Ser Glu Met Ile

225 230 235 240

Ser Asp Gly Val Met Glu Leu Val Lys Ala Gly Val Ile Asn Asn Lys

245 250 255

Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Ile Val Val Thr Phe Leu Met Gly

260 265 270

Thr Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Val Asn Asn Asn Pro Met Val Glu Thr

275 280 285

Tyr Ser Val Asp Tyr Val Asn Asn Pro Leu Val Ile Met Lys Asn Asp

290 295 300

Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Val Gln Val Asp Leu Met Gly Gln

305 310 315 320

Val Cys Ser Glu Ser Ile Gly Leu Lys Gln Ile Ser Gly Val Gly Gly

325 330 335

Gln Val Asp Phe Ile Arg Gly Ala Asn Leu Ser Lys Gly Gly Lys Ala

340 345 350

Ile Ile Ala Ile Pro Ser Thr Ala Gly Lys Gly Lys Val Ser Arg Ile

355 360 365

Thr Pro Leu Leu Asp Thr Gly Ala Ala Val Thr Thr Ser Arg Asn Glu

370 375 380

Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Val Ala His Leu Lys Gly Lys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Asn Arg Ala Arg Ala Leu Ile Asn Ile Ala His Pro Lys

405 410 415

Phe Arg Glu Ser Leu Met Asn Glu Phe Lys Lys Arg Phe

420 425

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-orfZ-f

<400> 9

attcgcggcc gcttctagat tcgtcaggcc acatag 36

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-orfZ-r

<400> 10

agcttgcatg cctgcagcta aaatctcttt ttaaattcat tc 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p321-Ptac-f

<400> 11

gaatgaattt aaaaagagat tttagctgca ggcatgcaag ct 42

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p321-Ptac-r

<400> 12

ctatgtggcc tgacgaatct agaagcggcc gcgaat 36

<210> 13

<211> 1456

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 组成型启动子表达orfZ的基因盒

<400> 13

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcgctc acaattagct 60

gtcaccggat gtgctttccg gtctgatgag tccgtgagga cgaaacagcc tctacaaata 120

attttgttta aatttaacaa gacaggatag ggaggagata acttttatgg agtgggaaga 180

gatatataaa gagaaactgg taactgcaga aaaagctgtt tcaaaaatag aaaaccatag 240

cagggtagtt tttgcacatg cagtaggaga acccgtagat ttagtaaatg cactagttaa 300

aaataaggat aattatatag gactagaaat agttcacatg gtagctatgg gcaaaggtga 360

atatacaaaa gagggtatgc aaagacattt tagacataat gctttatttg taggcggatg 420

tactagagat gcagtaaatt caggaagagc agattataca ccttgttttt tctatgaagt 480

gccaagtttg tttaaagaaa aacgtttgcc tgtagatgta gcacttattc aggtaagtga 540

gccagataaa tatggctact gcagttttgg agtttccaat gactatacca agccagcagc 600

agaaagtgct aagcttgtaa ttgcagaagt gaataaaaac atgccaagaa ctcttggaga 660

ttcttttata catgtatcag atattgatta tatagtggaa gcttcacacc cattgttaga 720

attgcagcct cctaaattgg gagatgtaga aaaagccata ggagaaaact gtgcatcttt 780

aattgaagat ggagctactc ttcagcttgg aataggtgct ataccagatg cggtactttt 840

attcttaaag aacaaaaaga atttaggaat acattctgag atgatatcag atggtgtgat 900

ggaactggtg aaggcagggg ttatcaataa caagaaaaag accctccatc caggcaaaat 960

agttgtaaca tttttaatgg gaacaaaaaa attatatgat tttgtaaaca ataatccaat 1020

ggtagaaact tattctgtag attatgtaaa taatccactg gtaattatga aaaatgacaa 1080

tatggtttca ataaattctt gtgttcaagt agacttaatg ggacaagtat gttctgaaag 1140

tataggattg aaacagataa gtggagtggg aggccaggta gattttatta gaggagctaa 1200

tctatcaaag ggtggaaagg ctattatagc tataccttcc acagctggaa aaggaaaagt 1260

ttcaagaata actccacttc tagatactgg tgctgcagtt acaacttcta gaaatgaagt 1320

agattatgta gttactgaat atggtgttgc tcatcttaag ggcaaaactt taagaaatag 1380

ggcaagagct ctaataaata tcgctcatcc aaaattcaga gaatcattaa tgaatgaatt 1440

taaaaagaga ttttag 1456

<210> 14

<211> 166

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 组成型启动子

<400> 14

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcgctc acaattagct 60

gtcaccggat gtgctttccg gtctgatgag tccgtgagga cgaaacagcc tctacaaata 120

attttgttta aatttaacaa gacaggatag ggaggagata actttt 166

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H1-pre112-f

<400> 15

tgaactgcat gaattcccgg gagagctcga tatcgcatgc atcccgtacc cgtaaattg 59

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H1-pre112-r

<400> 16

gaaagctatg tggcctgacg aatccaagcc tatgattctt tc 42

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-pre112-f

<400> 17

gaaagaatca taggcttgga ttcgtcaggc cacatagctt tc 42

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-pre112-r

<400> 18

tgcagcctgc cagattctct aaaatctctt tttaaattca ttcattaatg attc 54

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H2-pre112-f

<400> 19

gaatcattaa tgaatgaatt taaaaagaga ttttagagaa tctggcaggc tgca 54

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> H2-pre112-r

<400> 20

aagtgatagg gcccgatccc aagcttcttc tagactgtca caggtcccaa cg 52

Claims

1.一种精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其包括启动子和4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因(优选来自克氏梭状芽胞杆菌的orfZ基因)或具有4-羟基丁酸辅酶A转移酶的功能的基因。

2.根据权利要求1所述的精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其中，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子，优选地，所述启动子为tac启动子，更优选地，所述启动子为SEQ ID NO:6所示的DNA分子，或SEQ ID NO:14所示的DNA分子，或将SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14衍生的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其中，所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶的核酸序列为SEQ ID NO:7，或将SEQ IDNO:7经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ IDNO:7衍生的DNA分子。

4.根据权利要求1所述的精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其中，所述4-羟基丁酸辅酶A转移酶为SEQ ID NO:8所示的蛋白质，或将SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:8衍生的蛋白质。

5.根据权利要求1所述的精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其中，所述基因盒的序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示。

6.根据权利要求1所述的精细调控聚羟基脂肪酸酯(PHA)共聚物中4-羟基丁酸组成比例的基因盒，其中，所述共聚物可以包括P3HB-co-4HB(3-羟基丁酸-4羟基丁酸共聚酯)，P3HB-co-4HB和P3HB(聚3-羟基丁酸)的掺和物，P3HB-co-4HB和P4HB(聚4-羟基丁酸)的掺和物，以及P3HB-co-4HB、P3HB和P4HB的掺和物。

7.一种细菌重组菌，其含有权利要求1所述的基因盒。

8.根据权利要求7所述的细菌重组菌，其中，所述细菌包括大肠杆菌及其重组菌，或者所述细菌包括盐单胞菌TD及其重组菌。

9.一种聚羟基脂肪酸酯共聚物的制备方法，其特征在于，利用含有权利要求7或8所述的细菌重组菌制备聚羟基脂肪酸酯。

10.根据权利要求8所述的聚羟基脂肪酸酯共聚物的制备方法，其中，所述共聚物包括P3HB-co-4HB(3-羟基丁酸-4羟基丁酸共聚酯)，P3HB-co-4HB和P3HB(聚3-羟基丁酸)的掺和物，P3HB-co-4HB和P4HB(聚4-羟基丁酸)的掺和物，以及P3HB-co-4HB、P3HB和P4HB的掺和物。