CN114561415B - 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在微生物中用油酸或反油酸调控基因表达的方法及其应用，本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体中包含启动子和编码响应油酸或反油酸的蛋白质的核苷酸序列，所述的启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，并受油酸或反油酸的调控。

Description

一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种在微生物中用新型油酸启动系统调控基因表达的方法及其应用。
背景技术
生物传感器是基因工程的有效工具，可应用于微生物代谢工程、生物治疗与疾病诊断、污染物的定量检测等领域诸多。生物传感器大多由物理信号或者化学信号触发，并在转录调控因子的参与下调控相关基因的表达，进而实现其应用功能，常见的触发信号包括化合物、温度、光等。例如，文献：Escherichia coli “Marionette” strains with 12highly optimized small-molecule sensors（Meyeret al., 2019. Nat. Chem. Biol.15, 196–204.）公开了在微生物中用响应异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的生物传感器控制番茄红素的合成；文献：A green tea-triggered genetic control system for treatingdiabetes in mice and monkeys（Yinet al., 2019. Sci. Transl. Med. 11,eaav8826.）公开了在细胞中用响应原儿茶酸的生物传感器控制胰岛素的合成用于治疗2型糖尿病；文献：Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbialtherapeutics（Piraneret al., 2017. Nat. Chem. Biol. 13, 75–80.）公开了用响应温度变化的生物传感器进行发热诊断和治疗；以及文献：Synthetic far-red light-mediated CRISPR-dCas9 device for inducing functional neuronal differentiation（Shao et al., 2018. Proc. Natl. Acad. Sci. 115, E6722–E6730）、文献：A far-redlight-inducible CRISPR-Cas12a platform for remote-controlled genome editingand gene activation（Wang et al., 2021. Sci. Adv. 7, eabh2358）和文献：Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbialchemical production（Zhao et al., 2018. Nature 555, 683–687.）分别公开了用响应光照的生物传感器控制正丁醇的合成、细胞分化、基因编辑等。
油酸，化学式为C18H34O2，也称顺式-9-十八烯酸，是一种含有18个碳原子的不饱和脂肪酸，油酸在微生物中合成代谢与分解代谢的平衡由转录调控因子FadR控制，在油酸不足的情况下，脂肪酸合成代谢启动，FadR结合在细菌β-氧化通路基因fadBA的启动子P fadBA 上，抑制fadBA的表达，进而抑制细菌β-氧化的进行；在油酸剩余的情况下，脂肪酸分解代谢启动，FadR与油酸耦合后离开fadBA的启动子P fadBA ，fadBA表达，细菌β-氧化得以完成，参见文献：FadR, transcriptional co-ordination of metabolic expediency（Cronanetal., 1998. Mol. Microbiol. 29, 937–943.）。但是现有技术并没有明确FadR调控油酸的关键位点，更没有将该调控原理或者调控的关键位点应用于建立油酸诱导系统。
发明内容
基于油酸或反油酸在微生物中的调控原理，发明人经过反复的研究和实验验证，确定了FadR调控油酸或反油酸的关键位点，并将其用于油酸或反油酸诱导系统的设计中。具体的，在微生物中表达fadR基因，合成转录调控因子FadR，并用fadBA基因的启动子（或者包含关键位点的改造型组成型启动子）控制目的基因（（尤其是具体生物学功能的基因））的表达，实现了在加入油酸或反油酸的情况下基因表达开启、不加入油酸或反油酸的情况下基因表达关闭的效果。将其适用于微生物合成产品时，基因表达的强度、表达的时间进行调控，实现低成本、易操作的基因表达调控，有利于平衡微生物的生长与产物合成，提高产品的产量，该方法对于生物合成与生物制造有重要的意义。
本发明的第一方面，提供了一种表达载体。
优选的，所述的表达载体中包含编码响应油酸或反油酸的蛋白质的核苷酸序列和启动子。
优选的，所述的启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。
优选的，所述的启动子受油酸或反油酸的调控。
优选的，可以选自现有技术中常规的启动子，只要该启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，且具有启动子的活性。进一步优选的，所述的启动子选自fadBA或改造的组成型启动子，所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。优选的所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入一个或多个响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。
优选的，所述的组成型启动子可以为porin启动子或其突变体，例如文献：Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB) Production by Halomonas bluephagenesis（Shen Rui, Yin Jin, Ye Jianwen等. ACS Synthetic Biology 7(2018) 1897–1906）中所记载的。
优选的，加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点的位置可以为-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
优选的，所述结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
优选的，所述的结合位点或者所述的启动子还包含使其功能加强或减弱的诱变DNA序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的改造的组成型启动子包含SEQ ID NO：3-9和15-18中的任一项或者包含与SEQ ID NO：3-9和15-18中的任一项具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子为fadBA，其核苷酸序列包含SEQID NO：2或者包含与SEQ ID NO：2具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
优选的，所述的响应油酸或反油酸的蛋白质可以为脂肪酸代谢调控蛋白，进一步优选为FadR（序列可以参见CAA30881.1）。
优选的，所述的表达载体中可以包含一个或两个以上启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达载体包含2个启动子，其中一个启动子为fadBA或改造的组成型启动子，另一个为表达响应油酸或反油酸的蛋白质的启动子（优选可以为孔蛋白或其突变体的启动子或者也可以为例如包含SEQ ID NO：11-14中的任一个启动子）。
所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
优选的，所述的表达载体还包含外源基因。
优选的，所述的表达载体表达外源基因，可以在表达载体上表达也可以在基因组上表达。
在本发明的一个具体实施方式中，将包含外源基因的表达载体导入宿主细胞中，表达载体表达的响应油酸或反油酸的蛋白质与启动子上的结合位点结合，阻止启动子进行产物的合成，基因表达关闭，加入油酸或反油酸后，油酸或反油酸将响应油酸或反油酸的蛋白质拉离启动子，响应油酸或反油酸的蛋白质与油酸或反油酸结合后游离于细胞中，基因表达开启。该表达载体的一个目的在于调控产物的合成，需要提高产物产量时加入油酸或反油酸，需要降低产量时减少油酸或反油酸，另一个目的在于在生产的前期启动子过强次级代谢产物会对微生物有负反馈作用，故前期采用响应油酸或反油酸的蛋白质阻止启动子的表达，以使得微生物正常有序生长、繁殖。
本发明的第二方面，提供了一种启动子，所述的启动子为在组成型启动子或其突变体上加入一个或多个响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，所述的启动子受油酸或反油酸的调控。
优选的，所述的响应油酸或反油酸的蛋白质可以为脂肪酸代谢调控蛋白，进一步优选为FadR（序列可以参见CAA30881.1）。
优选的，所述的组成型启动子可以为porin启动子或其突变体，例如文献：Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB) Production by Halomonas bluephagenesis（Shen Rui, Yin Jin, Ye Jianwen等. ACS Synthetic Biology 7(2018) 1897–1906）中所记载的。
优选的，加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点的位置可以为-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
优选的，所述的结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3-9或15-18中的任一项。
本发明的第三方面，提供了一种调控元件，所述的调控元件包含启动子和编码响应油酸或反油酸的蛋白质的核苷酸序列，所述的启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，所述的启动子受油酸或反油酸的调控。
优选的，所述的响应油酸或反油酸的蛋白质可以为脂肪酸代谢调控蛋白，进一步优选为FadR（序列可以参见CAA30881.1）。
优选的，可以选自现有技术中常规的启动子，只要该启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，且具有启动子的活性。进一步优选的，所述的启动子选自fadBA或改造的组成型启动子，所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。优选的所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入一个或多个响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。
优选的，所述的组成型启动子可以为porin启动子或其突变体，例如文献：Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB) Production by Halomonas bluephagenesis（Shen Rui, Yin Jin, Ye Jianwen等. ACS Synthetic Biology 7(2018) 1897–1906）中所记载的。
优选的，加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点的位置可以为-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
优选的，所述的结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3-9或15-18中的任一项。
本发明的第四方面，提供了一种骨架载体，所述的骨架载体包含启动子和编码响应油酸或反油酸的蛋白质的核苷酸序列，所述的启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，所述的启动子受油酸或反油酸的调控。
优选的，所述的响应油酸或反油酸的蛋白质可以为脂肪酸代谢调控蛋白，进一步优选为FadR（序列可以参见CAA30881.1）。
优选的，可以选自现有技术中常规的启动子，只要该启动子包含响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点，且具有启动子的活性。进一步优选的，所述的启动子选自fadBA或改造的组成型启动子，所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。优选的所述的改造的组成型启动子为在组成型启动子上加入一个或多个响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点。
优选的，所述的组成型启动子可以为porin启动子或其突变体，例如文献：Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB) Production by Halomonas bluephagenesis（Shen Rui, Yin Jin, Ye Jianwen等. ACS Synthetic Biology 7(2018) 1897–1906）中所记载的。
优选的，加入响应油酸或反油酸的蛋白质的结合位点的位置可以为-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
优选的，所述的结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3-9或15-18中的任一项。
本发明的第五方面，提供了一种细胞，所述的细胞包含上述表达载体、上述启动子、上述调控元件或上述骨架载体。
本发明的第六方面，提供了一种上述表达载体、上述启动子、上述调控元件、上述骨架载体或上述细胞在生产产品或构建重组菌中的应用。
本发明的第七方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌中包含：
A）上述的表达载体；
B）上述的启动子；
C）上述的骨架载体；或者，
D）上述的调控元件。
优选的，所述的重组菌为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌（优选Escherichia coli S17-1）、罗氏真养杆菌（优选RalstoniaeutrophaH16）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（优选为Pseudomonas entomophilaLAC31）、气生单胞菌属或嗜盐菌（Halomonas spp.）中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌选自嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.），所述的嗜盐单胞菌为Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No. 4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593和Halomonas aydingkolgenesis M1CGMCC No.19880。
本发明的第八方面，提供了一种上述的重组菌的制备方法，所述的制备方法包括将上述的表达载体、上述的启动子、上述的骨架载体或上述的调控元件导入重组菌中。
优选的，所述的重组菌为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌（优选Escherichia coli S17-1）、罗氏真养杆菌（优选RalstoniaeutrophaH16）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（优选为Pseudomonas entomophilaLAC31）、气生单胞菌属或嗜盐菌（Halomonas spp.）中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌选自嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.），所述的嗜盐单胞菌为Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No. 4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No.6593和Halomonas aydingkolgenesis M1CGMCC No.19880。
优选的，所述表达载体将启动子整合至重组菌染色体基因组中或者所述表达载体游离在重组菌中。
本发明的第九方面，提供了一种在微生物中用油酸或反油酸调控基因表达的方法。
优选的，所述的方法包括将上述表达载体、上述的启动子、上述的骨架载体或上述的调控元件导入微生物中，培养微生物。
优选的，所述的调控包括上调或下调。所述的上调可以在培养过程中加入油酸或反油酸。其中，所述的油酸或反油酸既可以作为微生物生长的碳源也可以作为基因表达的诱导剂。所述的下调可以为不加入油酸或反油酸或者加入中和或者抑制油酸或反油酸的物质。
进一步优选的，所述的方法还包括：
a）调节启动子中SEQ ID NO：1的位置；
b）调节启动子中SEQ ID NO：1的个数；
c）调节fadR基因的表达量；
d）调节FadR蛋白功能；
e）调节加入油酸或反油酸的浓度；
f）调节加入油酸或反油酸的时间；或，
g）同时使用上述a）-f）中的两种以上。
优选的，所述的调节启动子中SEQ ID NO：1的位置包括但不限于组成型启动子P porin “-35区之前”、“-35区到-10区之间”、“-10区之后”、“-35区之前”和“-35区到-10区之间”、“-35区之前”和“-10区之后”、“-35区到-10区之间”和“-10区之后”或“-35区之前”、“-35区到-10区之间”和“-10区之后”。
优选的，所述的调节启动子中SEQ ID NO：1的个数包括但不限于一个、两个、三个或四个以上。
优选的，所述的调节fadR基因的表达量可以通过调节启动fadR基因的组成型启动子的表达强度或者加入fadR基因的拷贝数等等。
优选的，所述的调节FadR蛋白功能包括但不限于在表达载体、调控元件或骨架载体上加入功能加强或减弱的诱变DNA序列。
优选的，所述的加入油酸或反油酸的浓度可以为0-30mM，优选0.5-20mM，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18mM及以上。
优选的，所述的加入油酸或反油酸的时间包括但不限于与初始培养基同时加入、与补料一同加入、微生物生长阶段（例如对数期）或者产物合成阶段加入。
优选的，所述的重组菌为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌（优选Escherichia coli S17-1）、罗氏真养杆菌（优选RalstoniaeutrophaH16）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（优选为Pseudomonas entomophilaLAC31）、气生单胞菌属或嗜盐菌（Halomonas spp.）中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，在微生物中用油酸或反油酸调控基因表达的方法包括但不限于用fadBA启动子或改造的组成型启动子连接一或多个待调控基因，连同fadR基因导入微生物，以油酸作为诱导剂，通过提高或降低油酸的浓度控制待调控基因表达强度的高或低。
本发明的第十方面，提供了一种发酵方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。
优选的，所述发酵的培养基为常规培养基或者为了适应微生物的生存和产生产物适当的调整培养基的成分。
优选的，所述发酵的条件可以根据具体重组菌适当调整。
优选的，所述发酵的设备可以为摇瓶、小试发酵罐、中试发酵罐或者工业大量生产的大型发酵罐。
本发明的第十一方面，提供了上述的表达载体、上述的启动子、上述的调控元件、上述的骨架载体、上述的细胞、上述的重组菌、上述的在微生物中用油酸或反油酸调控基因表达的方法和/或上述的发酵方法在基因编辑或发酵生产代谢产物的应用。
本发明的第十二方面，提供了一种生产PHA的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。
本发明的第十三方面，提供了一种促进细胞增长的方法，所述的方法包括发酵培养上述的重组菌。优选的，所述的重组菌为向Halomonas bluephagenesis TD01中导入包含minCD的上述表达载体。
本发明所述的“响应油酸或反油酸的蛋白质”为对油酸或反油酸敏感或者对油酸或反油酸的浓度敏感的蛋白质，例如可以将油酸或反油酸作为一种信号向下游传递或者该蛋白质可以直接或者间接与油酸或者反油酸结合，油酸或反油酸的浓度可以控制其结合的强度。
本发明所述的“PHA”为均聚PHA和/或共聚PHA。优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸（3HB）均聚物PHB，3-羟基丁酸（3HB）和4-羟基丁酸(4HB)二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸（3HB）、4-羟基丁酸(4HB)和3-羟基戊酸三元共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HV)，3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸（3HP）的均聚物或共聚物，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的均聚物为P3HP，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。在本发明的一个具体实施方式中，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
本发明所述的“组成PHA的单体”包括但不限于3-羟基丁酰辅酶A（3HB-CoA），4-羟基丁酰辅酶A（4HB-CoA），3-羟基戊酰辅酶A（3HV-CoA），5-羟基戊酰辅酶A（5HV-CoA），3-羟基己酰辅酶A（3HHx-CoA），6-羟基己酰辅酶A（6HHx-CoA）。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本申请中简写与全称对照：
FITC：异硫氰酸荧光素，是一种有机荧光染料。
FSC：前向散射。
SSC：侧散射。
PHB：3-羟基丁酸（3HB）均聚物。
fadBA：脂肪酸氧化复合体α亚基和3-酮酯酰辅酶A硫解酶编码基因。
FadR：脂肪酸代谢转录调控蛋白。
4hbd：4-羟基丁酸脱氢酶编码基因。
sucD：琥珀酸半醛脱氢酶编码基因。
ogdA：α-酮戊二酸脱氢酶编码基因。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：不同浓度油酸诱导表达minCD对Halomonas bluephagenesis TD01的细胞形态变化的影响。
具体实施方法
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例有图或表示出，以方便实施例的理解，但并不能用于限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01
发明人通过筛选得到的一株耐盐、耐碱、天然生产PHB的革兰氏阴性嗜盐细菌，此菌自身即可积累较高含量的聚羟基脂肪酸，具有好的工业化生产应用前景。记载于“TanDan, Wu Qiong, Chen Jinchun and Chen Guo-Qiang. Engineering Halomonas TD01for Low Cost Production of Polyhydroxyalkanoates. Metabolic Engineering 26(2014) 34–47”一文，公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，本申请示例性的以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01作为底盘微生物进行验证。
2、培养基配方
（1）LB培养基：含5g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10 g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。60LB培养基为LB培养基含有60g/L NaCl，其余成分和制备条件与LB培养基相同。20LB培养基为LB培养基含有20g/L NaCl，其余成分和制备条件与LB培养基相同。
（2）60MM培养基含：60g/L NaCl，1g/L酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)，30g/L葡萄糖，0.5g/L尿素，0.2 g/L MgSO4，9.65g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/LKH2PO4，0.05g/L柠檬酸铁铵, 0.02g/L CaCl2，0.1g/L ZnSO4·7H2O，0.03g/L MnCl2·4H2O，0.3g/L H3BO3，0.2g/L CoCl2·6H2O，0.01g/L CuSO4·5H2O，0.02g/L NiCl2·6H2O，0.03g/LNaMoO4·2H2O，其余为水。实验所用嗜盐单胞菌最适pH在8-9左右，用NaOH调节培养基pH。
3、pSEVA321质粒
欧洲标准系列质粒，含有氯霉素抗性基因，具体序列信息记载于“Silva-RochaRafael, Martínez-García Esteban, Calles Belén等. The Standard European VectorArchitecture (SEVA): a coherent platform for the analysis and deployment ofcomplex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research 41 (2013) D666–D675”一文，公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
4、fadR基因与sfgfp基因
fadR基因：来源于大肠杆菌Escherichia coli MG1655，其DNA序列如SEQ ID NO：19所示；
sfgfp基因为报告基因，全称为“super fold green fluorescent protein”，是在细菌中适用的GFP荧光蛋白基因，其DNA序列如SEQ ID NO：20所示；
5、质粒的接合转化方法
（1）将制备的质粒转入大肠杆菌S17-1，得到重组大肠杆菌
（2）将大肠杆菌和底盘微生物置于20LB固体培养基上共培养(37℃，8h)，然后挑菌苔，涂布于含25mg/L氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h
（3）完成步骤(2)后，挑取单菌落，在含25mg/L氯霉素的60LB固体培养基上划线，37℃培养过夜
6、用流式细胞仪测量绿色荧光蛋白(GFP)荧光强度的方法
（1）向深孔板每孔加入1ml含有25mg/L氯霉素的60LB液体培养基，分别挑取少量带有质粒的盐单胞菌加入培养基中，37℃，1000rpm，振荡12h；
（2）向含有25mg/L氯霉素的60LB液体培养基中加入所需用量的诱导剂油酸和培养基体积0.5%的温和非离子型去垢剂乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，加入NaOH调节pH值至8-9，振荡混匀后取1ml加入深孔板中，取2μL培养12h的菌液转接到该培养基中，37℃，1000rpm，振荡12h；
（3）完成步骤(2)后，取2μL菌液转接到250μL PBS缓冲液中，用流式细胞仪(美国BDbioscience 公司，型号LSRFortessa4)进行荧光强度的测试，流式细胞仪激发光设置为488nm，荧光分析信号通过FITC、FSC和SSC通道捕获，流速为0.5μL/s，每个样品至少记录50,000个细胞。
实施例1：开发微生物适用的油酸诱导系统并用油酸作为诱导剂控制基因表达
制备质粒pP lacI -fadR-P fadBA -sfgfp，质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
P lacI 是组成型启动子（如SEQ ID NO：10所示），用于表达fadR基因。
5’-GCGGCGCGCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAAT-3’（SEQ ID NO：10）
P fadBA 是fadBA的启动子（如SEQ ID NO：2所示），用于表达sfgfp基因。
5’-ATCGGCATTTCTTTAATCTTTTGTTTGCATATTTTTAACACAAAATACACACTTCGACTCATCTGGTACGACCAGATCACC-3’（SEQ ID NO：2）
用前述接合转化法将制备的质粒导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01，得到重组盐单胞菌。
用油酸诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组盐单胞菌的诱导效果，结果显示，与不加入油酸相比，在10mM油酸诱导下，基因的表达强度提高了5倍以上，结果如表1所示。
结果说明，可以在微生物中建立油酸诱导系统，并用油酸控制基因的表达。
表1 建立油酸诱导系统及其在油酸诱导下的表达强度
实施例2：改造油酸诱导系统中受油酸控制的启动子并用油酸作为诱导剂控制基因表达
制备质粒pP lacI -fadR-P fadO1-sfgfp、pP lacI -fadR-P fadO2-sfgfp、pP lacI -fadR-P fadO3-sfgfp、pP lacI -fadR-P fadO12-sfgfp、pP lacI -fadR-P fadO13-sfgfp、pP lacI -fadR-P fadO23-sfgfp和pP lacI -fadR-P fadO123-sfgfp，上述质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
fadO为fadBA启动子中的一段序列（如SEQ ID NO：1所示）。
5’-ATCTGGTACGACCAGAT-3’（SEQ ID NO：1）
P fadO1为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区之前”DNA序列而成的启动子（如SEQID NO：3所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACAATCTGGTACGACCAGATTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTTTGACCTGCGAGCA-3’（SEQ ID NO：3）
P fadO2为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区到-10区之间”DNA序列而成的启动子（如SEQ ID NO：4所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGTTGCGTATCTGGTACGACCAGATTAGAGTTTGACCTGCGAGCA-3’（SEQ ID NO：4）
P fadO3为用fadO替换组成型启动子P porin “-10区之后”DNA序列而成的启动子（如SEQID NO：5所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTATCTGGTACGACCAGAT-3’（SEQ ID NO：5）
P fadO12为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区之前”和“-35区到-10区之间”2个区域的DNA序列而成的启动子（如SEQ ID NO：6所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACAATCTGGTACGACCAGATTTGCGTATCTGGTACGACCAGATTAGAGTTTGACCTGCGAGCA-3’（SEQ ID NO：6）
P fadO13为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区之前”和“-10区之后”2个区域的DNA序列而成的启动子（如SEQ ID NO：7所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACAATCTGGTACGACCAGATTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTATCTGGTACGACCAGAT-3’（SEQ ID NO：7）
P fadO23为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区到-10区之间”和“-10区之后”2个区域的DNA序列而成的启动子（如SEQ ID NO：8所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGTTGCGTATCTGGTACGACCAGATTAGAGTATCTGGTACGACCAGAT-3’（SEQ ID NO：8）
P fadO123为用fadO替换组成型启动子P porin “-35区之前”、“-35区到-10区之间”和“-10区之后”3个区域的DNA序列而成的启动子（如SEQ ID NO：9所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACAATCTGGTACGACCAGATTTGCGTATCTGGTACGACCAGATTAGAGTATCTGGTACGACCAGAT-3’（SEQ ID NO：9）
组成型启动子P porin （如SEQ ID NO：23所示），记载于“Shen Rui, Yin Jin, YeJianwen等. Promoter Engineering for Enhanced P(3HB-co-4HB) Production byHalomonas bluephagenesis. ACS Synthetic Biology 7 (2018) 1897–1906”一文。
5’-atgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccannntagagtttgacctgcgagca-3’（SEQ ID NO：23）
用前述接合转化法将制备的质粒分别导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01，得到重组盐单胞菌。
用油酸诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组盐单胞菌的诱导效果，结果显示，与改造前相比，上述改造后的油酸诱导系统在10mM油酸诱导下，基因的表达强度提高了3.5倍至33倍不等，结果如表2所示。
结果说明，改造油酸诱导系统中受油酸控制的启动子可以改变油酸诱导最高基因表达强度，改变油酸诱导系统的动态调控范围。
表2 构建油酸诱导系统中受油酸控制的启动子及其表达强度
实施例3：调整油酸诱导系统中fadR基因的表达强度并用油酸作为诱导剂控制基因的表达
制备质粒PJ23107-fadR-P fadO3-sfgfp、PJ23105-fadR-P fadO3-sfgfp、PJ23115-fadR-P fadO3-sfgfp和PJ23117-fadR-P fadO3-sfgfp，上述质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。其中，启动子J23107、J23105、J23115、J23117的强度逐渐变弱。
PJ23107为组成型启动子（如SEQ ID NO：11所示）：
5’-TTTACGGCTAGCTCAGCCCTAGGTATTATGCTAGC-3’（SEQ ID NO：11）
PJ23105为组成型启动子（如SEQ ID NO：12所示）：
5’-TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGC-3’（SEQ ID NO：12）
PJ23115为组成型启动子（如SEQ ID NO：13所示）：
5’-TTTATAGCTAGCTCAGCCCTTGGTACAATGCTAGC-3’（SEQ ID NO：13）
PJ23117为组成型启动子（如SEQ ID NO：14所示）：
5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTGTGCTAGC-3’（SEQ ID NO：14）
用前述接合转化法将制备的质粒分别导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01，得到重组盐单胞菌。
用油酸诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组盐单胞菌的诱导效果，结果显示，在调整fadR基因表达强度后，与不加入油酸相比，在10mM油酸诱导下，上述重组盐单胞菌的基因表达强度分别提高了2倍至9倍不等，结果如表3所示。
结果说明，调整油酸诱导系统中fadR基因的表达强度可以改变本底表达强度，改变油酸诱导系统的动态调控范围。
表3 调整油酸诱导系统中fadR基因的表达强度对本底表达强度的影响
实施例4：调整受油酸控制的启动子所含fadO数量并用油酸作为诱导剂控制基因的表达
制备质粒P lacI -fadR-P1-fadO3-sfgfp、P lacI -fadR-P2-fadO3-sfgfp、P lacI -fadR-P3-fadO3-sfgfp和P lacI -fadR-P4-fadO3-sfgfp，上述质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
P1-fadO3为含有1个fadO的P fadO3启动子（如SEQ ID NO：15所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGGGAGACCTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTGGTCTCAGGGGATCTGGTACGACCAGATC-3’（SEQ ID NO：15）
P2-fadO3为含有2个fadO的P fadO3启动子（如SEQ ID NO：16所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGGGAGACCTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTGGTCTCAGGGGATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATC-3’（SEQ ID NO：16）
P3-fadO3为含有3个fadO的P fadO3启动子（如SEQ ID NO：17所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGGGAGACCTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTGGTCTCAGGGGATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATC-3’（SEQ IDNO：17）
P4-fadO3为含有4个fadO的P fadO3启动子（如SEQ ID NO：18所示），受油酸调控。
5’-ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGGGAGACCTTGCGTTCACTGGAATCCCAGTATAGAGTGGTCTCAGGGGATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATCATCTGGTACGACCAGATC-3’（SEQ ID NO：18）
用前述接合转化法将制备的质粒分别导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01，得到重组盐单胞菌。
用油酸诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组盐单胞菌的诱导效果，结果显示，在调整fadO数量后，与不加入油酸相比，在10mM油酸诱导下，上述重组盐单胞菌的基因表达强度分别提高了6倍至16倍不等，结果如表4所示。
结果说明，调整油酸诱导系统中受油酸控制的启动子所含fadO数量可以改变本底表达强度，改变油酸诱导系统的动态调控范围。
表4 调整油酸诱导系统中受油酸控制的启动子所含fadO数量对本底表达强度的影响
实施例5：油酸浓度对Halomonas bluephagenesis TD01的细胞形态的影响
制备质粒pPJ23107-fadR-P3-fadO3-minCD，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PJ23107、fadR和P3-fadO3如前所述，minCD代表串联而成的细胞分裂相关基因minC和minD基因，是与细胞形态相关的基因，其DNA序列如SEQ ID NO：21所示。
用前述接合转化法将制备的质粒导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesisTD01，得到重组盐单胞菌。
将上述重组盐单胞菌接种至60LB培养基中，培养12h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10h后，将2.5mL菌液接种至47.5mL 60MM培养基中，进行摇瓶实验，转速为200rpm，发酵时间为48h，在接种菌液的同时分别加入0、0.5、1和5mM油酸作为诱导剂，诱导minC和minD基因的表达。
发酵结束后，用透射电子显微镜观察细胞的形态，结果显示，在油酸的诱导下细胞出现纤长化现象，细胞长度明显增加，细胞体积明显增大，细胞内的PHA颗粒明显增多，并且在不同浓度的油酸诱导下，细胞变化程度不同，在本实施例浓度范围内基因表达强度与加入的油酸浓度成正比，如图1所示。
结果说明，可以通过改变油酸的浓度，控制minC和minD基因表达强度的高或低，进而控制细胞的形态结构。
实施例6：加入油酸的时间对Halomonas bluephagenesis TD01细胞形态变化的影响
制备实施例5所述质粒和重组盐单胞菌。
将上述重组盐单胞菌接种至60LB培养基中，培养12h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10h后，将2.5mL菌液接种至47.5mL 60MM培养基中，进行摇瓶实验，转速为200rpm，发酵时间为48h，在接种菌液的同时以及发酵进行的第8、12以及16h分别加入1mM油酸作为诱导剂，诱导minC和minD基因的表达。
发酵结束后，进行菌体离心、冷冻干燥、称重、酯化反应和气相色谱分析，结果如表5所示。发现在不同时间用油酸诱导minC和minD基因表达后，细胞干重在10g/L以上，PHA含量在78%以上。其中在摇瓶发酵的第12h加入油酸诱导minC和minD基因表达，细胞干重为10.89g/L，PHA含量为90.88%。
结果说明，可以通过改变加入油酸的时间，控制minC和minD基因表达的时间，平衡细胞生长和细胞形态结构变化，提高细胞干重和产物的产量。
表5 用油酸控制Halomonas bluephagenesis TD01细胞形态变化对生长和PHA合成的影响
实施例7：加入油酸的浓度对Halomonas bluephagenesis TD01合成P(3HB-co-4HB)的影响
制备质粒pPJ23107-fadR-P3-fadO23-4hbd-sucD-ogdA，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PJ23107、fadR和P3-fadO23如前所述，4hbd-sucD-ogdA代表串联而成的4hbd、sucD和ogdA基因，是P(3HB-co-4HB)中与4HB单体合成相关的基因，4hbd-sucD-ogdA的DNA序列如SEQ IDNO：22所示。
用前述接合转化法将制备的质粒导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD68(Halomonas bluephagenesis TD01基因组上插入4-羟基丁酸辅酶A转移酶基因orfZ的菌株)，得到重组盐单胞菌。
将上述重组盐单胞菌接种至60LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10h后，将2.5mL菌液接种至47.5mL 60MM培养基中，进行摇瓶实验，转速为200rpm，发酵时间为48h，在接种菌液的同时分别加入0、0.5、1、5和10mM油酸作为诱导剂，诱导4hbd、sucD和ogdA基因的表达。
发酵结束后，进行菌体离心、冷冻干燥、称重、酯化反应和气相色谱分析，发现在加入不同浓度的油酸诱导4hbd、sucD和ogdA基因表达后，细胞干重在4.7g/L至6.3g/L，PHA含量在50%至62%，4HB摩尔比例在5.5%至10.9%，如表6所示。
结果说明，可以通过改变油酸的浓度，控制4hbd、sucD和ogdA基因表达强度的高或低，进而调控4-羟基丁酸辅酶A(4HB-CoA)的合成，控制聚合物P(3HB-co-4HB)中4HB的比例。
表6 用油酸控制Halomonas bluephagenesis TD01生长以及合成P(3HB-co-4HB)
实施例8：加入油酸的时间对Halomonas bluephagenesis TD01合成4HB的影响
制备实施例7所述质粒和重组盐单胞菌。
将上述重组盐单胞菌接种至60LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10h后，将2.5mL菌液接种至47.5mL 60MM培养基中，进行摇瓶实验，转速为200rpm，发酵时间为48h，在接种菌液的同时以及发酵进行的第6、9以及12h分别加入5mM油酸作为诱导剂，诱导4hbd、sucD和ogdA基因的表达。
发酵结束后，经过离心、冷冻干燥、称重、酯化反应和气相色谱分析，发现在不同时间用油酸诱导4hbd、sucD和ogd基因表达后，细胞干重在6.0g/L至9.1g/L，PHA含量在58%至73%，4HB摩尔比例在4.9%至10.6%。其中在摇瓶发酵的第6h加入油酸诱导4hbd、sucD和ogdA基因表达，细胞干重为9.1g/L以上，PHA含量为65.57%，4HB摩尔比例在9.57%，如表7所示。
表7 用油酸控制Halomonas bluephagenesis TD01合成4HB的时间
结果说明，可以通过改变加入油酸的时间，控制4hbd、sucD和ogd基因表达的时间，控制4HB-CoA的合成时间，调控共聚物P(3HB-co-4HB)中4HB的摩尔比例，平衡细胞生长和产物合成，提高细胞干重和产物的产量。
序列表
<110> 清华大学、北京微构工场生物技术有限公司
<120> P0102022020136YW
<130> 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctggtacg accagat 17
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acctgcgagc a 71
<210> 5
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagagtatc 60
tggtacgacc agat 74
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgcctccac aatctggtac gaccagattt gcgtatctgg tacgaccaga ttagagtttg 60
acctgcgagc a 71
<210> 7
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcctccac aatctggtac gaccagattt gcgttcactg gaatcccagt atagagtatc 60
tggtacgacc agat 74
<210> 8
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgtatctgg tacgaccaga ttagagtatc 60
tggtacgacc agat 74
<210> 9
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcctccac aatctggtac gaccagattt gcgtatctgg tacgaccaga ttagagtatc 60
tggtacgacc agat 74
<210> 10
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggcgcgcc atcgaatggc gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga 60
gagtcaattc agggtggtga at 82
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagc 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttacggcta gctcagtcct aggtactatg ctagc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttatagcta gctcagccct tggtacaatg ctagc 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgacagcta gctcagtcct agggattgtg ctagc 35
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgcctccac accgctcgtc acatcctggg agaccttgcg ttcactggaa tcccagtata 60
gagtggtctc aggggatctg gtacgaccag atc 93
<210> 16
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgcctccac accgctcgtc acatcctggg agaccttgcg ttcactggaa tcccagtata 60
gagtggtctc aggggatctg gtacgaccag atcatctggt acgaccagat c 111
<210> 17
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgcctccac accgctcgtc acatcctggg agaccttgcg ttcactggaa tcccagtata 60
gagtggtctc aggggatctg gtacgaccag atcatctggt acgaccagat catctggtac 120
gaccagatc 129
<210> 18
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgcctccac accgctcgtc acatcctggg agaccttgcg ttcactggaa tcccagtata 60
gagtggtctc aggggatctg gtacgaccag atcatctggt acgaccagat catctggtac 120
gaccagatca tctggtacga ccagatc 147
<210> 19
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat tgaaagtatc 60
tggaataacc gcttccctcc cgggactatt ttgcccgcag aacgtgaact ttcagaatta 120
attggcgtaa cgcgtactac gttacgtgaa gtgttacagc gtctggcacg agatggctgg 180
ttgaccattc aacatggcaa gccgacgaag gtgaataatt tctgggaaac ttccggttta 240
aatatccttg aaacactggc gcgactggat cacgaaagtg tgccgcagct tattgataat 300
ttgctgtcgg tgcgtaccaa tatttccact atttttattc gcaccgcgtt tcgtcagcat 360
cccgataaag cgcaggaagt gctggctacc gctaatgaag tggccgatca cgccgatgcc 420
tttgccgagc tggattacaa catattccgc ggcctggcgt ttgcttccgg caacccgatt 480
tacggtctga ttcttaacgg gatgaaaggg ctgtatacgc gtattggtcg tcactatttc 540
gccaatccgg aagcgcgcag tctggcgctg ggcttctacc acaaactgtc ggcgttgtgc 600
agtgaaggcg cgcacgatca ggtgtacgaa acagtgcgtc gctatgggca tgagagtggc 660
gagatttggc accggatgca gaaaaatctg ccgggtgatt tagccattca ggggcgataa 720
<210> 20
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgcgtaaag gcgaagagct gttcactggt gtcgtcccta ttctggtgga actggatggt 60
gatgtcaacg gtcataagtt ttccgtgcgt ggcgagggtg aaggtgacgc aactaatggt 120
aaactgacgc tgaagttcat ctgtactact ggtaaactgc cggtaccttg gccgactctg 180
gtaacgacgc tgacttatgg tgttcagtgc tttgctcgtt atccggacca tatgaagcag 240
catgacttct tcaagtccgc catgccggaa ggctatgtgc aggaacgcac gatttccttt 300
aaggatgacg gcacgtacaa aacgcgtgcg gaagtgaaat ttgaaggcga taccctggta 360
aaccgcattg agctgaaagg cattgacttt aaagaagacg gcaatatcct gggccataag 420
ctggaataca attttaacag ccacaatgtt tacatcaccg ccgataaaca aaaaaatggc 480
attaaagcga attttaaaat tcgccacaac gtggaggatg gcagcgtgca gctggctgat 540
cactaccagc aaaacactcc aatcggtgat ggtcctgttc tgctgccaga caatcactat 600
ctgagcacgc aaagcgttct gtctaaagat ccgaacgaga aacgcgatca tatggttctg 660
ctggagttcg taaccgcagc gggcatcacg catggtatgg atgaactgta caaatga 717
<210> 21
<211> 1726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgagcctca acgccaatag tgccgacatt gccttcacct tcaaaggtgg catgctgcca 60
atgaccgtca tggaattgag cagcgctgac ccggaacata tacgaagtca gctagctggc 120
aagttgtcgc aatcccccgc gttctttcag catacaccgg ttgtgctgag cgtggaaaaa 180
ctcgatgaac ctcacttggc gcttgagcgc atttgcgcgg tctgtcgcga tcataaatta 240
ttcccggtag ccgtacgtgg cggagctgaa cctgtacgcc aatctgcctg ggcattaggg 300
ctaggctggg ttgcgcctgt tgaagaaggg cggactaggc tgttagagag cgttggtcct 360
gccgcgatct ctgatgacgc catagaggag gtggaacctg ccgagcagga agtggtggcg 420
gtggcaacac gcttatttcg cggtacggtt cgctctggcc aacaggtgag cgcatcagaa 480
ggcgatctag tggtgattgg ggcagtaaat gcgggcgctg aagtgttggc ggccggtagt 540
atccatgtat acggagcact ccgtggacga gcgttagcgg gtattcatgg aaatactcag 600
gcgggtattt actgtcggga attagaagca gagcttctct ccgtggcagg gaattacaaa 660
cgcttagaag atattgattc tcagttgctt ggtcgcgcta cagaggtgca tttcgctcaa 720
gagcagctgg aaattaagcc gctgggataa ttcaaacgca tgagcgtgta ttggtgttta 780
atgcctagcg acgtcgcaag cgctatacgt tacagtgtgt catgttgttg acattgatgt 840
tcccgttatg cgcggtgcga ccctgtaaac gcgctcgcga tgaacgactt caagaaggaa 900
gtaactcttg gccaaaatta ttgtagtgac ctccggtaaa gggggggttg gtaagaccac 960
tagcgctgcc gccatttcaa caggcctcgc cctgcgtggt aaaaaaacag tcgtcattga 1020
tttcgatgtt ggtctacgta acctcgactt gatcatgggc tgtgagcgcc gcgttgttta 1080
tgacttggta aacgttatcc aaggggaagc agggcttaat caggcgctga ttcgcgataa 1140
acgcgttgaa accctattta ttctcccagc ctctcaaacg cgtgataaag atgcactaac 1200
gcaggaaggc gtagagcgaa tactcgagca gctcaaacaa gattttgatt ttatcttgtg 1260
tgactccccc gcaggcattg agcgaggtgc ccagctcgct atgtacttcg ctgatgaggc 1320
gattgttgtc acgaatcctg aagtttcctc agtgcgtgac tctgaccgca ttttggggct 1380
acttggttcc aagacgcggc gcgctgaaca aagcctggat ccggttaaag agcatttgct 1440
gattacgcgc tataaccctt ctcgcgtaac gtctggggat atgctgaccc tggatgacat 1500
tcgtgaaatc ttgtctattg atctgcttgg cctcatccct gaatccgaag cggtgctacg 1560
tgcatctaac caaggcgttc ctgttactca cgatgcagcg agcgatgcag gtcaggcgta 1620
ttcagatact gtatcgcgcc tgttaggtga agatatgcct ctgcgcttcc atgaagtaca 1680
gcgtaaggga ttgttgaacc gtatgttcgg gggtggtcgg cgatga 1726
<210> 22
<211> 4207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgaagttat taaaattggc acctgatgtt tataaatttg atactgcaga ggagtttatg 60
aaatacttta aggttggaaa aggtgacttt atacttacta atgaattttt atataaacct 120
ttccttgaga aattcaatga tggtgcagat gctgtatttc aggagaaata tggactcggt 180
gaaccttctg atgaaatgat aaacaatata attaaggata ttggagataa acaatataat 240
agaattattg ctgtaggggg aggatctgta atagatatag ccaaaatcct cagtcttaag 300
tatactgatg attcattgga tttgtttgag ggaaaagtac ctcttgtaaa aaacaaagaa 360
ttaattatag ttccaactac atgtggaaca ggttcagaag ttacaaatgt atcagttgca 420
gaattaaaga gaagacatac taaaaaagga attgcttcag acgaattata tgcaacttat 480
gcagtacttg taccagaatt tataaaagga cttccatata agttttttgt aaccagctcc 540
gtagatgcct taatacatgc aacagaagct tatgtatctc caaatgcaaa tccttatact 600
gatatgttta gtgtaaaagc tatggagtta attttaaatg gatacatgca aatggtagag 660
aaaggaaatg attacagagt tgaaataatt gaggattttg ttataggcag caattatgca 720
ggtatagctt ttggaaatgc aggagtggga gcggttcacg cactctcata tccaataggc 780
ggaaattatc atgtgcctca tggagaagca aattatctgt tttttacaga aatatttaaa 840
acttattatg agaaaaatcc aaatggcaag attaaagatg taaataaact attagcaggc 900
atactaaaat gtgatgaaag tgaagcttat gacagtttat cacaactttt agataaatta 960
ttgtcaagaa aaccattaag agaatatgga atgaaagagg aagaaattga aacttttgct 1020
gattcagtaa tagaaggaca gcagagactg ttggtaaaca attatgaacc tttttcaaga 1080
gaagacatag taaacacata taaaaagtta tattaatatg taacctacaa tcattaaata 1140
tcccatagtg ttttgaatat aggatccaag gagatatacc atgagtaatg aagtatctat 1200
aaaagaatta attgaaaagg caaaggtggc acaaaaaaaa ttggaagcct atagtcaaga 1260
acaagttgat gtactagtaa aagcactagg aaaagtggtt tatgataatg cagaaatgtt 1320
tgcaaaagaa gcagttgaag aaacagaaat gggtgtttat gaagataaag tagctaaatg 1380
tcatttgaaa tcaggagcta tttggaatca tataaaagac aagaaaactg taggcataat 1440
aaaagaagaa cctgaaaggg cacttgttta tgttgctaag ccaaagggag ttgtggcagc 1500
tactacgcct ataactaatc cagtggtaac tcctatgtgt aatgcaatgg ctgctataaa 1560
gggcagaaat acaataatag tagcaccaca tcctaaagca aagaaagttt cagctcatac 1620
tgtagaactt atgaatgctg agcttaaaaa attgggagca ccagaaaata tcatacagat 1680
agtagaagca ccatcaagag aagctgctaa ggaacttatg gaaagtgctg atgtagttat 1740
tgctacaggc ggtgctggaa gagttaaagc tgcttactcc agtggaagac cagcttatgg 1800
cgttggacct ggaaattcac aggtaatagt tgataaggga tacgattata acaaagctgc 1860
acaggatata ataacaggaa gaaaatatga caatggaatt atatgttctt cagagcaatc 1920
agttatagct cctgctgaag attatgataa ggtaatagca gcttttgtag aaaatggggc 1980
attctatgta gaagatgagg aaacagtaga aaagtttaga tcaactttat ttaaagatgg 2040
aaaaataaac agcaagatta taggtaaatc cgtccaaatt attgcggatc ttgcaggagt 2100
aaaagtacca gaaggtacta aggttatagt acttaagggt aaaggtgcag gagaaaaaga 2160
tgtactttgt aaagaaaaaa tgtgtccagt tttagtagca ttgaaatatg atacttttga 2220
agaagcagtt gaaatagcta tggctaatta tatgtatgaa ggagctggtc atacagcagg 2280
catacattct gacaatgacg agaacataag atatgcagga actgtattac ctataagcag 2340
attagttgta aatcagcctg caactactgc tggaggaagt ttcaataatg gatttaaccc 2400
tactactaca ctaggctgcg gatcatgggg cagaaacagt atttcagaaa atcttactta 2460
cgagcatctt ataaatgttt caagaatagg gtatttcaat aaagaagcaa aagttcctag 2520
ctatgaggaa atatggggat aatactagag aaagaggaga aatactagta tgaatactgc 2580
agaattattg atccgatgtc tagaaaatga aggggtggag tatatttttg ggctgccggg 2640
ggaagaaaat ctccatatcc tcgaagccct taaggagtct cccatccgct ttatcaccgt 2700
ccgccatgaa cagggtgccg cttttatggc cgatgtgtat ggtcgtttaa ccgggaaagc 2760
aggggtttgt ctgtctaccc tggggcctgg ggctaccaat ctaatgactg gggttgccga 2820
tgcgaacctc gatggggcgc ccctgattgc gattacaggg caggtgggta ccgaccgcat 2880
gcacattgaa tcccaccaat atcttgatct ggtggcgatg tttgcccccg tcaccaagtg 2940
gaataaacaa attgtccgac cgaacacgac cccggaggtg gtacgtcgtg cctttaaaat 3000
tgcccagcag gaaaaaccag gggcagtaca catcgatctc cctgaaaata ttgcggcgat 3060
gcccgtagaa ggtcagcccc tccagcggga tggtcgtgaa aaaatctatg cttcaagccg 3120
gagtttaaac cgggctgccg aggcgatcgc ccatgccaag agtcctttaa ttctggtggg 3180
taatggcatt attcgcgccg atgccgccga agccctcacc gattttgcca cccagttgaa 3240
tattcccgta gtcaacacct ttatgggcaa aggggcaatt ccctacaccc atcccctgtc 3300
cctgtggacg gtaggactcc aacagcggga ttttgtcacc tgtgcctttg aacagagcga 3360
tttggtgatt gcagtgggct acgatctgat cgaatattcc cccaaacgct ggaacccaga 3420
gggaacgacc ccaattatcc acattggtga agtggccgcc gaaattgata gtagttatat 3480
tcccctcaca gaagttgtcg gcgacattgg cgatgcctta aatgaaattc gtaaacgcac 3540
agaccgtgag ggcaaaaccg cgccaaaatt tctcaatgtc cgggctgaga ttcgggagga 3600
ctatgaacgc cacggcaccg acgctagttt tccggtcaaa ccccaaaaaa tcatctacga 3660
tctccgccaa gtgatggccc cagaggacat cgtcatttct gatgtggggg cccacaaaat 3720
gtggatggcc cgccattacc attgcgatcg ccccaatact tgcctgattt ccaatggatt 3780
tgcggcgatg ggcattgcga ttcccggtgc tgtagcagcc aaattagtct acccagaaaa 3840
aaatgtcgtg gctgtcacag gggacggggg atttatgatg aactgccagg agctcgaaac 3900
ggccctgcgc attggggcga actttgtcac cctaattttc aatgatggtg gctatggttt 3960
gatcggttgg aaacagatta accagttcgg tgcaccagcc tttgtggagt ttggcaatcc 4020
cgattttgtg cagtttgccg aaagtatggg cctcaagggt tatcggatta ccgccgccgc 4080
cgaccttgtg ccgaccttaa aagaagccct agcccaggat gtaccagcgg tgatcgattg 4140
ccccgtggac tacagtgaga atgtgaaatt ctcccaaaaa tcaggggatt taatctgccg 4200
tatgtaa 4207
<210> 23
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccann ntagagtttg 60
acctgcgagc a 71

Claims (20)

1.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌中包含表达载体，所述的表达载体包含启动子和编码响应油酸的蛋白质的核苷酸序列；所述的启动子包括改造的porin启动子，所述改造的porin启动子为在porin启动子上加入响应油酸的蛋白质的结合位点，所述的结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的启动子受油酸的调控；所述的响应油酸的蛋白质为FadR；所述的重组菌为嗜盐单胞菌；所述的嗜盐单胞菌为Halomonas bluephagenesis。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，其中，加入结合位点的位置为启动子的-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，调节启动子中SEQ ID NO：1的个数包括一个、两个、三个或四个以上。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列包括SEQ IDNO：3-9或15-18中的任一项。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的嗜盐单胞菌为Halomonasbluephagenesis TD01。
6.一种权利要求1-5任一所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将表达载体导入重组菌中。
7.一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括将表达载体导入微生物中，培养微生物，并在培养过程中加入油酸；所述的表达载体包含启动子和编码响应油酸的蛋白质的核苷酸序列；所述的启动子包括改造的porin启动子，所述改造的porin启动子为在porin启动子上加入响应油酸的蛋白质的结合位点，所述的结合位点包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的启动子受油酸的调控；所述的响应油酸的蛋白质为FadR；所述的微生物为嗜盐单胞菌；所述的嗜盐单胞菌为Halomonas bluephagenesis。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中，加入结合位点的位置为启动子的-35区之前、-35区到-10区之间和/或-10区之后。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，调节启动子中SEQ ID NO：1的个数包括一个、两个、三个或四个以上。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列包括SEQ IDNO：3-9或15-18中的任一项。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的嗜盐单胞菌为Halomonasbluephagenesis TD01。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述油酸的加入浓度为0.5-20mM。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述油酸的加入浓度为1-5mM。
14.根据权利要求7或12所述的方法，其特征在于，所述油酸的加入时间为与初始培养基同时加入、与补料一同加入、在微生物生长阶段加入或者在产物合成阶段加入。
15.一种发酵方法，其特征在于，所述的发酵方法包括发酵培养权利要求1-5任一所述的重组菌。
16.根据权利要求15所述的发酵方法，其特征在于，所述的发酵过程中还包括加入油酸。
17.根据权利要求16所述的发酵方法，其特征在于，所述油酸的加入浓度为0.5-20mM。
18.根据权利要求17所述的发酵方法，其特征在于，所述油酸的加入浓度为1-5mM。
19.根据权利要求16-18任一所述的发酵方法，其特征在于，所述油酸的加入时间为与初始培养基同时加入、与补料一同加入、在微生物生长阶段加入或者在产物合成阶段加入。
20.权利要求1-5任一所述的重组菌在发酵生产代谢产物或基因编辑中的应用。
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