JPH06292593A

JPH06292593A - Ｃｒｍ蛋白質およびジフテリアトキシンを産生させるための新規なプラスミド

Info

Publication number: JPH06292593A
Application number: JP6054428A
Authority: JP
Inventors: Benjamin J Metcalf; ベンジヤミン・ジエイ・メトカルフ
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-03-01
Publication date: 1994-10-21
Anticipated expiration: 2023-09-03
Also published as: CA2116914A1; ES2231770T3; NO313758B1; EP0616034A3; KR100316004B1; CA2116914C; FI112090B; BR1100634A; HU9400657D0; SK24094A3; HUT71320A; DK0616034T3; CZ39394A3; AU686126B2; FI941050A; NO940774L; CN1100757A; ZA941548B; EP0616034A2; KR940021731A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、ＣＲＭ１９７蛋白質、ジフテリア
トキシン、またはジフテリアトキシンに関連した他のＣ
ＲＭ蛋白質を多量に産生させる新規な方法およびプラス
ミド系、並びにこの新規なプラスミドを用いて形質転換
させた微生物に関する。【構成】毒素産生性を示さないベータファージ由来Ｃ
ＲＭ１９７のための遺伝子とプラスミドｐＮＧ２−２２
を結合させる、ｐＰＸ３５１１と表示する特に好適なＤ
ＮＡプラスミドを記述する。この新規なプラスミド系
は、多重溶原菌を用いることなくＣＲＭ１９７蛋白質を
高レベルで発現し得る株に、ジフテリア菌株を形質転換
させ得る。本発明は、例えばプロモーターの力を増大さ
せるか、或は鉄調節由来プロモーターを除去することな
どにより、この発現ベクターを操作する必要なく、蛋白
質産生を増大させる精密な手段を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【背景】ＣＲＭ１９７蛋白質は無毒な形態のジフテリア
トキシンであるが、これをジフテリアトキシンから免疫
学的に区別することは不可能である。毒素産生性を示す
コリネファージβのニトロソグアニジン変異誘発で作り
出される毒素産生性を示さないファージβ１９７^tox-に
感染させたジフテリア菌（Corynebacterium diphteria
e）が、ＣＲＭ１９７を産生する（Uchida, T.他、 1971、
Nature New Biology 233:8-11）。このＣＲＭ１９７蛋
白質の分子量は該ジフテリアトキシンと同じであるが、
構造遺伝子内の１つの塩基が変化していることで（グア
ニンからアデニンへ）それとは異なっている。このよう
に１つの塩基が変化していることが、成熟蛋白質内のア
ミノ酸置換（グリシンがグルタミン酸に置き換わってい
る）の原因になっており、それによってジフテリアトキ
シンの毒性がなくなっている。このＣＲＭ１９７蛋白質
は、糖類のための安全で有効なＴ細胞依存担体であり、
現在これは、インフルエンザ菌型ｂオリゴ糖ＣＲＭ１９
７接合体ワクチン内で用いられている（HibTiter商標；
Lederle Praxis Biologicals、 Rochester、 N.Y.）。

【０００２】ワクチンで用いるに適した有意量でＣＲＭ
１９７蛋白質を製造することは、蛋白質量が低いことが
原因で妨げられてきた。毒素産生性を示さないコリネフ
ァージβ１９７の二重溶原菌（Rappuoli, R.、 1983、 Ap
plied Env. Microbio. 46:560-564；R. Rappuoliに発行
された米国特許第4,925,792号、およびRappuoli, R.、1
983、 J. Bacteriol. 153:1202-1210）を用いてＣＲＭ蛋
白質の産生を助長する技術が開発された。Rappuoliは、
二重溶原菌（double lysogen）を用いることによって、
単溶原菌（single lysogen）よりも３倍高い収率に及ぶ
ＣＲＭ１９７収率を報告している。単溶原菌によるＣＲ
Ｍ１９７の産生レベルは適当であるが、ＣＲＭ１９７蛋
白質が用いらているワクチン類の製造にとっては経済的
に満足されるものではない。

【０００３】コリネファージβの多重溶原菌（multiple
lysogen）をジフテリア菌に導入するのは、ＣＲＭ１９
７蛋白質、ジフテリアトキシン、またはジフテリアトキ
シンと交差反応性を示す他のＣＲＭ蛋白質を過剰生産し
得る株を同定するにとって労力を必要とするスクリーニ
ング方法である。加うるに、この方法の能力は、標準的
組換え技術が用いられている蛋白質発現操作に限定され
ている。従って、コリネファージβを用いることなく遺
伝子のコピー数を増大させるか、或はコリネファージβ
に溶原性を示す株からの上記蛋白質産生レベルを増大さ
せることにより、ジフテリアトキシンおよびＣＲＭ蛋白
質を有意量で生じさせ得る方法を開発することは有益で
ある。

【０００４】

【発明の要約】本発明は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアト
キシン、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘導され
る他のＣＲＭ蛋白質、をコード化する遺伝子を操作して
導入するための新規な方法およびプラスミド系、並びに
これらの手段で形質転換された微生物に関する。毒素産
生性を示さないベータファージ由来ＣＲＭ１９７のため
の遺伝子とプラスミドｐＮＧ２−２２を結合させる、ｐ
ＰＸ３５１１と表示する特に好適なＤＮＡプラスミドを
記述する。この新規なプラスミド系は、多重溶原菌を用
いることなくＣＲＭ１９７蛋白質を高レベルで発現し得
る株に、ジフテリア菌株を形質転換させ得る。本発明
は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシン、およびこのジ
フテリアトキシン遺伝子から誘導される他のＣＲＭ蛋白
質の、蛋白質発現を増大させる精密な手段を提供するも
のである。プロモーターの力を増大させるか、或は鉄調
節由来プロモーターを除去することにより、遺伝子発現
を操作することも可能である。好適な態様において、こ
のプラスミド系を用いることで、ＣＲＭ１９７、ジフテ
リアトキシン、またはこのジフテリアトキシン遺伝子か
ら誘導される他のＣＲＭ蛋白質、との遺伝的融合とし
て、他の蛋白質を発現させることができる。ＣＲＭ１９
７、ジフテリアトキシン、またはこのジフテリア遺伝子
から誘導される他のＣＲＭ蛋白質由来の、調節およびプ
ロセシング配列を用いて、コリネバクテリウム種内で外
来蛋白質を発現させることができる。

【０００５】

【発明の詳細な記述】本発明は、ジフテリアトキシン、
ＣＲＭ１９７、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘
導される他のＣＲＭ蛋白質を、ワクチン類内で用いるか
或は運用できるに適当な量でこれらの蛋白質を必要とし
ている他の用途で用いるに充分な量で産生させる新規な
方法およびプラスミド系に関する。このプラスミド系
は、ジフテリアトキシン遺伝子もしくはＣＲＭ遺伝子を
コリネバクテリウム種の中に導入してそれらのコピー数
を増大させるに有効性を示す手段を提供する。このプラ
スミドは、それ自身の複製機能と共にそれ自身の独立し
たエピソームを有しており、従って、このプラスミド
は、ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ遺伝子の余分な
コピーを宿主菌株（これらは、このような組み込みの能
力を有していないか、或は以前にはファージβ１９７
^tox-に感染しなかった）の中に導入することができる。
例えば、本発明のプラスミドを有するコリネバクテリウ
ム種が産生するＣＲＭ１９７蛋白質レベルは、コリネフ
ァージβ１９７^tox-に感染させたジフテリア菌の多重溶
原菌が発現するＣＲＭ１９７蛋白質収率より良好でない
にしても匹敵している。

【０００６】本発明の高レベル産生プラスミドは、ジフ
テリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質をコード化する遺
伝子（それのプロモーターおよび調節シグナル配列を含
む）；コリネバクテリウム属の複製開始点（その結果と
して得られるプラスミドがコリネバクテリウム種の中に
導入され得るように）；並びに任意に多重クローニング
部位に連結していてもよい、選択性マーカー；を含んで
いる。このプラスミドを用い、ジフテリアトキシンもし
くはＣＲＭ遺伝子の発現を容易にするに充分な条件下
で、コリネバクテリウム種の微生物、特にジフテリア菌
の形質転換を行う。適切な増殖条件は、その宿主有機体
に応じて本分野の技術者に容易に明らかであろう。例え
ば、コリネバクテリウム種を用いてＣＲＭ１９７、ジフ
テリアトキシンまたは他のＣＲＭ蛋白質を最適に産生さ
せるには、この微生物を、低鉄もしくは脱鉄（deferate
d）媒体の中に維持する必要がある。

【０００７】このプラスミドは、ジフテリアトキシンか
或はこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導されるＣＲ
Ｍ蛋白質、をコード化する遺伝子を含んでいる。ＣＲＭ
蛋白質、即ち本発明のプラスミド構築物内で用いられ得
る、ジフテリアトキシンと免疫学的交差反応を示す交差
反応材料（Cross-Reacting Materials）の例には、これ
に限定されるものではないが、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ４
５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲＭ１７６が含
まれる。このＣＲＭ１９７蛋白質をコード化する遺伝子
はジフテリアトキシン（ＤＴ）から誘導され、この後者
の配列は、Greenfield他によって報告された（Greenfie
ld, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:685
3-6857）。このＤＴ遺伝子とＣＲＭ１９７遺伝子との間
の違いは、構造遺伝子内の塩基の１つが変化している点
である。これらのＣＲＭ遺伝子のいくつかに関するヌク
レオチド配列が、Uchida, T.他（J. Biol. Chem.、 248:
3838-3844、 1975）によって報告されている。このＣＲ
Ｍ遺伝子全体（それの調節シグナル配列を含む）は、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で製造され得る。他の増
幅技術もしくは合成技術を用いても、このＣＲＭ１９７
遺伝子もしくは他のＣＲＭ遺伝子を生じさせ得る。

【０００８】ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質
をコード化する遺伝子上の調節シグナル遺伝子は、この
蛋白質がその培地内に分泌されることを可能にしてい
る。従って、この分泌された蛋白質は、その培地から回
収された後、通常技術、例えば塩沈澱およびカラムクロ
マトグラフィーなどで精製され得る。

【０００９】該多重クローニング部位は、好適にはｐＵ
Ｃ１８から誘導されるが、他の給源から誘導される多重
クローニング部位、例えばpBluescriptもしくは他の合
成多重クローニング部位も用いられ得る。また、この多
重クローニング部位は、このプラスミドの作用性を干渉
しないで全て除去され得る。どちらの場合も、このプラ
スミドの中に選択性マーカーを組み込む。この選択性マ
ーカーとしては如何なる抗生物質耐性マーカーも用いら
れ、例えばこれに限定されるものではないが、アンピシ
リン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、カナ
マイシン耐性マーカーなどが用いられ得る。このコリネ
バクター（corynebacter）がその選択抗生物質に対して
示す感受性を最初に試験する。これらの発現させた蛋白
質をヒト用途で用いることを意図している場合クロラム
フェニコールが好適である、と言うのは、クロラムフェ
ニコールは上記目的に関してＦＤＡ（the Food and Dru
gAdministration）に認可されているからである。プラ
スミド選択に関する他の方法、例えば重金属耐性もしく
は栄養要求なども、抗生物質耐性マーカーに対する代替
として用いられ得る。

【００１０】本発明の高産生プラスミド類の構築で有効
な複製開始点は、コリネバクテリウム種から誘導される
ものである。ｐＰＸ３５１１に関して選択した複製開始
点はジフテリア菌から誘導される。実施例セクションを
参照のこと。他のコリネバクター複製開始点も用いられ
得る。

【００１１】好適な態様において、ジフテリア菌株Ｃ７
を形質転換してＣＲＭ１９７蛋白質を高レベルで産生す
る菌株を生じさせ得る、ｐＰＸ３５１１と表示する新規
な組換え型ＤＮＡプラスミドを用いることで、ＣＲＭ１
９７蛋白質の高レベル発現を達成する。図１に示すプラ
スミドｐＰＸ３５１１には、ジフテリアトキシンから誘
導されるＣＲＭ１９７遺伝子が含まれている。（Greenf
ield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:6
853-6857）。このプラスミドの残りの部分は親プラスミ
ドｐＮＧ２−２２から誘導され、この中に該ＣＲＭ１９
７遺伝子を挿入する。

【００１２】プラスミドｐＰＸ３５１１は、最初にポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてジフテリア菌由来
ＣＲＭ１９７遺伝子を増幅させることを経由して作り出
される。次に、このＣＲＭ１９７遺伝子を、選択性マー
カーを含んでいるジフテリア菌プラスミド、例えばｐＮ
Ｇ２（Schiller, J.他、 1980、 Antimicrobial Agentsan
d Chemotherapy 18:814-821）およびｐＮＧ２−２２（S
erwold-Davis, T.M.他、 1990、 FEM Microbiol. Lett. 6
6:119-124）にクローン化する。これらのプラスミドの
両方共、幅広い宿主域を有しており、今まで試験した全
てのコリネフォーム（coryneforms）において低コピー
数（５−１０コピー／細胞）で複製し得る。

【００１３】親プラスミドｐＮＧ２は天然に存在してい
るジフテリア菌プラスミドであり、これは最初エリスロ
マイシン耐性臨床菌株から単離されたものであった。ｐ
ＮＧ２に関する複製開始点は、２．６ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＣｌａＩフラグメント上に含まれている。この複製開
始点を用いて、ｐＮＧ２−２２（Serwold-Davis, T.M.
他、上記）およびｐＣＭ２．６（Schmit、 1991、 Infec
t. Immun. 59:1899-1904）と表示するクロラムフェニコ
ール耐性ベクターを作り出した。

【００１４】次に、エレクトロポレーションにより、そ
の得られるｐＰＸ３５１１プラスミドを用いてジフテリ
ア菌株Ｃ７の形質転換を行うことで、この細菌は、ファ
ージβ１９７^tox-存在なしでもＣＲＭ１９７を産生し得
るようになる。他の形質転換技術、例えば公知の物理的
および化学的手段も用いられ得る（Serwold-Davis他、
上記）。このｐＰＸ３５１１を用いたエレクトロ形質転
換技術を、また、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）^tox-単
溶原菌を用いて実施することによって、このＣＲＭ１９
７蛋白質の産生レベルを上昇させる。この形質転換体が
発現するＣＲＭ１９７蛋白質レベルは、単溶原菌である
ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）^tox-（ATCC番号5328）お
よび二重溶原菌であるジフテリア菌Ｃ７（β１９７）
^tox-Ｍ１（ATCC番号39255）［これはｐＰＸ３５１１プ
ラスミドを有していない］による発現レベルに匹敵して
いる。プラスミドｐＰＸ３５１１をジフテリア菌株Ｃ７
に移入すると、その形質転換体は、ジフテリア菌の二重
溶原菌株に匹敵するレベルでＣＲＭ１９７を発現し得る
ことが観察される。

【００１５】本発明の他の態様において、この新規なプ
ラスミドベクターを修飾して、種々の能力を有する１組
のプラスミドベクターを作り出す。例えば部位特異的変
異誘発を用いて、ＣＲＭ１９７内の単一塩基変化を修復
することができ、その結果として、この新規なプラスミ
ドはジフテリアトキシンを発現するようになる。このク
ローン化したＣＲＭ１９７遺伝子配列に他の変化を生じ
させて、他の公知ジフテリアトキシンＣＲＭ蛋白質、例
えばＣＲＭ４５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲ
Ｍ１７６などを発現させるようにすることができる（Uc
hida, T.他、1973、J. Biol. Chem.、 248:3838-384
4）。

【００１６】組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＲＭ１９７ま
たは他の同様にクローン化したジフテリアトキシンもし
くはＣＲＭの遺伝子が有するジフテリアトキシン調節配
列もしくはプロセシング配列に変化を生じさせることに
より、更にこれらの蛋白質の産生量を上昇させ得る。例
えば、ｔｏｘプロモーター領域を修飾して、そのプロモ
ーターから鉄調節を取り除くことができる。

【００１７】別の態様において、このプラスミドベクタ
ー系を修飾して、該ＣＲＭ１９７遺伝子または同様にク
ローン化したジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ遺伝子
が有するアミノ末端に制限酵素クローニング部位を導入
することができる。次に、これらのクローニング部位に
他の蛋白質由来ＤＮＡ配列をクローン化することによ
り、該ＣＲＭ１９７蛋白質または同様にクローン化した
ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質とのアミノ末
端融合物として他の組換え型蛋白質もしくは抗原を、こ
のプラスミドベクターが共発現するようにすることがで
き、ここで、これらの全てはそのｔｏｘプロモーターお
よびシグナル配列の支配下にある。加うるにか或は別法
として、該ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキシンまたは同
様にクローン化されたＣＲＭ、が有するカルボキシ末端
部分にクローニング部位を挿入することによって、カル
ボキシ末端融合物として他の蛋白質を発現させることも
可能である。このＣＲＭ１９７調節シグナル配列が存在
していることにより、その得られる融合蛋白質はその培
養培地内に分泌される。また、他の蛋白質を分泌形態と
して培養培地内に発現させる手段として用いるに必要と
されているのは、そのＣＲＭ１９７の調節シグナル配列
のみである。

【００１８】本発明の産生プラスミドで有効性を示す適
切な蛋白質および抗原には、粒子状抗原、例えば細菌、
ウイルス、寄生虫または菌・カビから誘導されるもの、
並びに細胞および可溶抗原の微細成分、例えば蛋白質、
ペプチド類、ホルモン類および糖蛋白質などが含まれ
る。特に興味の持たれる抗原はウイルス、菌・カビ、寄
生虫もしくは細菌の抗原、アレルゲン、自己免疫関連抗
原もしくは腫瘍関連抗原である。これらの抗原は天然源
から入手可能であるか、或はこれらは組換えＤＮＡ技術
または他の人工手段で製造され得る。

【００１９】興味の持たれる細菌抗原の中には、ヒトの
細菌病原体に関連している抗原があり、これらには、こ
れに限定されるものではないが、例えば分類分け可能
（typable）および分類分け不可能な（nontypable）イ
ンフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、大腸菌
（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningit
idis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、カタル球菌
（Branhamella catarrhalis）、コレラ菌（Vibrio chol
erae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、百日咳菌（B
ordetella pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aerugin
osa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺
炎かん菌（Klebsiella pneumoniae）および破傷風菌（C
lostridium tetani）が含まれる。いくつかの特定的細
菌抗原には、細菌の表面および外側膜蛋白質（例えば、
インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌由
来）および細菌の表面蛋白質（例えば、化膿連鎖球菌由
来Ｍ蛋白質または肺炎連鎖球菌由来の３７キロダルトン
表面蛋白質）が含まれる。

【００２０】病原性ウイルス由来のウイルス抗原には、
これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイル
ス（Ｉ型およびＩＩ型）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス
（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）、ＲＳウイルス、Ａ型
肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａおよび非Ｂ肝炎ウイル
ス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、シト
メガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフ
ルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コ
ロナウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス、水痘ウ
イルス、エプスタイン・バールウイルス、アデノウイル
ス、パピローマウイルスおよび黄熱病ウイルスが含まれ
る。

【００２１】これらの病原性ウイルスのいくつかの特定
ウイルス抗原には、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＦ蛋白質
（特に、表題が「ＲＳウイルス：ワクチンおよび診断ア
ッセイ」であるParadiso, P.他の国際公開第89/02935号
明細書の中に記述されているＦペプチド283-315を含ん
でいる抗原）およびＮおよびＧ蛋白質、ロタウイルスの
ＶＰ４（以前はＶＰ３として知られていた）、ＶＰ６お
よびＶＰ７、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋
白質、Ｂ型肝炎の表面およびプレサーフェス（presurfa
ce）抗原、並びにヘルペス糖蛋白質ＢおよびＤが含まれ
る。

【００２２】菌・カビの抗原は、これに限定されるもの
ではないが、カンジダ（Candida）種[特にアルビカンス
（albicans）］、クリプトコックス（Cryptococcus）種
［特にネオフォルマンス（neoformans）］、ブラストミ
セス（Blastomyces）種［例えばデルマティティディス
（dermatitidis）］、ヒストプラスマ（Histoplasma）
種［特にカプスラーツム（capsulatum）］、コクシジオ
イデス（Coccidioides）種［特にイミティス（immiti
s）］、パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）種
［特にブラジルパラコクシジオイデス（brasiliensi
s）］およびアスペルギルス（Aspergillus）種を含む菌
・カビから誘導される抗原であってもよい。寄生虫抗原
の例には、これに限定されるものではないが、プラスモ
ディム（Plasmodium）種、アイメリア（Eimeria）種、
住血吸虫（Schistosoma）種、トリパノソーマ（Trypano
soma）種、バベシア（Babesia）種、リーシュマニア（L
eishmania）種、クリプトスポリジア（Cryptosporidi
a）種、トキソプラスマ（Toxoplasma）種およびニュー
モシスティス（Pneumocystis）種から誘導されるものが
含まれる。

【００２３】以下に示す非制限的実施例を用いて本発明
のさらなる説明を行う。

【００２４】

【実施例】実施例１：構築物細菌株全てのクローニング操作において大腸菌ＤＨ５α（ＢＲ
Ｌ、Gaithersburg、 MD）を用いる。ＣＲＭ１９７蛋白質
発現研究におけるプラスミドの宿主および対照の両方と
して、毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテリア
菌Ｃ７（−）^tox-株、毒素産生性を示さない単溶原ジフ
テリア菌Ｃ７（β１９７）^tox-株（ATCC番号5328）を用
いる。ＣＲＭ１９７蛋白質発現実験における対照とし
て、毒素産生性を示さない二重溶原ジフテリア菌Ｃ７
（β１９７）^tox-株（ATCC番号39255）を用いる。

【００２５】培養培地および条件大腸菌株ＤＨ５αを３７℃の超最適ブロス（ＳＯＢ）寒
天培地上およびＳＯＢ液内で常規通り増殖させる（Samb
rook, J.他著「分子クローニング：実験室マニュアル」
（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、 1989、
Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring H
arbor、 NY）。ジフテリア菌Ｃ７株をＳＯＣ寒天培地（S
ambrook, J.上記）および液内で常規通り培養する。エ
レクトロポレーションを行った細胞を平面培養する場
合、ＥＴ浸透寒天培地（Best, G.R.およびM.L. Britz、
1986、 Appl. Microbiol. Biotech.、 23:288-293）を用
いる。ＣＲＭ１９７の発現を伴う実験では、脱鉄ＣＹ培
地（Rappuoli, R.他、 1983、J. Bacteriol.、 153:1202）
を用いる。クロラムフェニコールを、大腸菌ＤＨ５αで
は３４μｇ／ｍＬ添加しそしてプラスミドｐＰＸ３５１
１を含んでいるジフテリア菌Ｃ７株では２μｇ／ｍＬ添
加する。

【００２６】ＣＲＭ１９７遺伝子のクローニング公開されているジフテリアトキシン配列（Greenfield,
L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6853-685
7）を基準にしたオリゴヌクレオチドプライマーを用い
た、ジフテリア菌Ｃ７（β１９７）^tox-単溶原菌ＤＮＡ
由来の遺伝子配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増
幅させることによって、ＣＲＭ１９７遺伝子のクローニ
ングを行う。１つのプライマーがその機能遺伝子の開始
点にＳａｌＩ／ＨｉｎｃＩＩ制限部位を作り出しそして
もう１つのプライマーがその構造遺伝子の遺伝子終止コ
ドンの後ろにＸｂａＩ部位を作り出すように、上記プラ
イマーの設計を行う。これらのもしくは同様なプライマ
ーを用いて、このＣＲＭ１９７遺伝子か、ジフテリアト
キシン遺伝子か、或はコリネファージβがコード化する
ジフテリアトキシン遺伝子に類似した何らかのＣＲＭ遺
伝子の、増幅およびクローニングを行う。

【００２７】このＣＲＭ１９７のＰＣＲ産物をＨｉｎｃ
ＩＩおよびＸｂａＩで消化させた後、ＳｍａＩ／Ｘｂａ
Ｉで消化させたｐＮＧ２−２２（大腸菌およびコリネバ
クテリウム種の両方の中で複製する能力を有する幅広い
宿主域のクロラムフェニコール耐性ベクター）に結合さ
せる。この連結反応を用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換
を行い、そしてこのＣＲＭ１９７遺伝子の存在に関する
制限分析により、組換え型コロニーのスクリーニングを
行う。このＣＲＭ１９７遺伝子に対する何らかの変化を
検査するための重なりプライマーを用いて、１つの単離
物であるｐＰＸ３５１１の配列決定を行う。Applied Bi
osystems 380BＤＮＡシンセサイザーを用いて、ＰＣＲ
および配列決定で用いるオリゴヌクレオチドプライマー
類の合成を行う。Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cyc
lerを用いてＰＣＲを行う。Applied Biosystems Sequen
cer 373Aを用いて配列決定を行う。その得られるプラス
ミド（ｐＰＸ３５１１）を、エレクトロポレーションに
より、その毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテ
リア菌Ｃ７（−）^tox-株および毒素産生性を示さないジ
フテリア菌Ｃ７（β¹⁹⁷）^tox-株（ATCC番号5328）に転
移させる。

【００２８】ジフテリア菌Ｃ７のエレクトロポレーショ
ン Tween-80を０．２％補ったＳＯＣ培地を用いる以外は、
コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）およびブレビバクテリウ・ラクトフェルメ
ンツム（Brevibacterium lactofermentum）の形質転換
を行う目的で開発されたプロトコル（Hayes, J.A.およ
びM.L. Britz、 1989、 FEMS Microbiol. Lett. 61:329-3
34）を用いたエレクトロポレーションにより、プラスミ
ドｐＰＸ３５１１のＤＮＡを用いてジフテリア菌Ｃ７の
形質転換を行う。エレクトロポレーションでは、Power
PlusおよびOptimizor Graphic Pulse Analyzerが備わっ
ているBTX Transfector 100、および間隙が１ｍｍのキ
ュベットを用いる。プラスミドレスキューおよび制限分
析により、その形質転換したジフテリア菌Ｃ７株内にプ
ラスミドｐＰＸ３５１１が存在していることを確かめ
る。

【００２９】実施例２：発現定量的ＣＲＭ¹⁹⁷発現研究同様な条件下でジフテリア菌Ｃ７株を増殖させた後、そ
の培養上澄み液内のＣＲＭ１９７量を比較することによ
り、ＣＲＭ１９７産生の比較を行う。これらの菌株の定
量的比較では、４ｍＬの一晩培養物を脱鉄ＣＹ培地で希
釈してＯＤ₆₀₀＝０．１になるようにし（２５０ｍＬの
三角フラスコ内の最終体積３０ｍＬ）、そして３７℃で
２０時間振とうして増殖させる。ｐＰＸ３５１１を含ん
でいる菌株を、抗生物質選択の有り無し両方で増殖させ
る（２μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）。インキュ
ベートした後、これらの培養物を遠心分離にかけること
で細胞を除去し、そしてこの培養物の上澄み液２０μＬ
を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で泳動させる。この
ゲルをクーマシー染色した後、Hoefer ScientificGS 37
0 Analysis Packageが備わっているBio-Rad Model 1650
透過率／反射率走査濃度計（Transmittance/Reflectanc
e Scanning Densitometer）を用いて定量比較を行う。
このゲルのイムノブロッティングを行いそしてＣＲＭ１
９７に対するモノクローナルを用いて検査することによ
り、組換え型ＣＲＭ１９７蛋白質と溶原性β１９７^tox-
のＣＲＭ１９７蛋白質が示す抗原特性の比較を行う。ｐ
ＰＸ３５１１が産生するＣＲＭ１９７は、溶原性菌株が
産生するＣＲＭ１９７と抗原的に同じである。

【００３０】プラスミドｐＰＸ３５１１の安定性実験抗生物質選択無しプラスミド保持の指示としてクロラム
フェニコール耐性の持続を用いることにより、プラスミ
ドｐＰＸ３５１１が示す安定性を試験する。細胞凝集を
防止する目的でTween-80を０．１％補ったＳＯＣブロス
内で１８時間（１４−１７世代）、３７℃で、ジフテリ
ア菌Ｃ７（β１９７）^tox-ｐＰＸ３５１１の培養物を増
殖させる。次に、コロニーの数を数える目的で、これら
の培養物をＳＯＣ寒天上で平面培養した後、次世代のた
めに１／１０希釈する。これらのＳＯＣ寒天プレート
を、クロラムフェニコールが２μｇ／ｍＬ入っているＳ
ＯＣ寒天上でレプリカ平板培養した後、クロラムフェニ
コール耐性を維持しているコロニーのパーセントを計算
する。６０世代に及んでこの方法を繰り返す。

【００３１】実施例３：生物学的結果クーマシー染色したゲルの濃度測定を用いた、異なるジ
フテリア菌Ｃ７株によるＣＲＭ１９７産生の定量的比較
（図２）により、ｐＰＸ３５１１はその単溶原菌よりも
約２倍多い量でＣＲＭ１９７を産生し、そしてその二重
溶原菌と同様に多量産生することが示された（表１）。
このプラスミドｐＰＸ３５１１が６０世代に渡って安定
であることは、図３に示されている。

【００３２】表１単溶原菌（β１９７）^tox-が産生するＣＲＭ１９７量の倍数として表す、ジフテリア菌Ｃ７菌株が産生するＣＲＭ１９７量単溶原菌（β１９７）^tox-と比較したＣＲＭ１９７量の倍数二重溶原菌（β１９７）^tox- ２．２ｐＰＸ３５１１（−）^tox-、Ｃｍ２無し２．８ｐＰＸ３５１１（−）^tox-、Ｃｍ２１．９ｐＰＸ３５１１（β１９７）^tox-、Ｃｍ２無し２．０ｐＰＸ３５１１（β１９７）^tox-、Ｃｍ２２．４生物学的寄託ブタペスト条約の規定の下で、プラスミドｐＰＸ３５１
１を1993年2月12日付けでthe American Type Culture C
ollection（ＡＴＣＣ)、 12301 Parklawn Drive、 Rockvi
lle、 Maryland 20852に寄託し、ＡＴＣＣ取得番号75415
と指定された。この寄託材料の公共利用に対する全ての
制限は、本出願に対して特許が与えられた時点で最終的
に取り除かれる。この寄託は、この寄託日から少なくと
も３０年間か或はこの特許の有効期間か或はこの生物材
料のサンプル提供に関する最も新しい要求日から５年間
のいずれか長い方の期間に渡って、公共寄託所に維持さ
れる。この寄託物の活力がなくなるか或は複製能力がな
くなる場合それを交換するものとする。

【００３３】本分野の技術者は、常規実験を用いるのみ
で、本明細書で特定的に記述した本発明の特定態様に対
する数多くの相当物を認識するか或は確かめることがで
きるであろう。上記相当物を請求の範囲内に包含させる
ことを意図している。

【００３４】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。

【００３５】１．ジフテリアトキシンと交差反応性を示
すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質の製造方法
において、ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白
質をコード化する遺伝子、ｂ）コリネバクテリウム属の
複製開始点、およびｃ）選択性マーカー、を含んでいる
プラスミドを用いて、コリネバクテリウム種微生物の形
質転換を行い、そして該微生物による該遺伝子の発現に
充分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させ
る、ことを含む方法。

【００３６】２．該形質転換方法がエレクトロポレーシ
ョンによるものである第１項の方法。

【００３７】３．該微生物がジフテリア菌である第１項
の方法。

【００３８】４．該ジフテリア菌株が株Ｃ７である第３
項の方法。

【００３９】５．該ＣＲＭ遺伝子がＣＲＭ１９７、ＣＲ
Ｍ４５、ＣＲＭ３０、ＣＲＭ２２８およびＣＲＭ１７６
から成る群から選択される第１項の方法。

【００４０】６．該複製開始点がコリネバクテリウム属
プラスミドｐＮＧ２から誘導される第１項の方法。

【００４１】７．ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲ
Ｍ蛋白質をコード化する遺伝子、ｂ）コリネバクテリウム属の複製開始点、およびｃ）任意に多重クローニング部位に連結している、選択
性マーカー、を含んでいる、宿主内でジフテリアトキシンと交差反応
性を示すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質を発
現させるためのプラスミド。

【００４２】８．該蛋白質をコード化する遺伝子が、作
用を示す様式で、１種以上の蛋白質、ペプチド類または
それらのエピトープ類をコード化するヌクレオチド配列
に連結している第７項のプラスミド。

【００４３】９．プラスミドｐＰＸ３５１１、ＡＴＣＣ
取得番号７５４１５。

【００４４】１０．第７項のプラスミドで形質転換され
ているコリネバクテリウム種の微生物。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＲＭ１９７のための遺伝子、クロラムフェニ
コール耐性（ＣｍＲ）マーカーを含んでいる大腸菌クロ
ーニングベクターｐＵＣ１８から誘導される多重クロー
ニング部位、およびプラスミドｐＮＧ２−２２（Serwol
d-Davis, T.M.他、 1990、FEM Microbiol. Lett. 66:119-
124）から誘導される複製開始点、を含んでいる、ｐＰ
Ｘ３５１１と表示する組換え型ＤＮＡプラスミドの略図
である。

【図２】異なるジフテリア菌株Ｃ７からのＣＲＭ１９７
（６１．８キロダルトン）産生を示す１２％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を示
す図に代わる写真である。レーンＡ：高分子量の標準
（ＢＲＬ、２００−１４．３キロダルトン）；レーン
Ｂ：単溶原菌Ｃ７（β１９７）^tox-；レーンＣ：二重溶
原菌Ｃ７（β１９７）^tox-；レーンＤ：クロラムフェニ
コール（Ｃｍ２）（２μｇ／ｍＬ）なしで増殖させたｐ
ＰＸ３５１１を有する非溶原性Ｃ７（−）^tox-；レーン
Ｅ：クロラムフェニコール（２μｇ／ｍＬ）有りで増殖
させたｐＰＸ３５１１を有する非溶原性Ｃ７
（−）^tox-；レーンＦ：クロラムフェニコール（２μｇ
／ｍＬ）なしで増殖させたｐＰＸ３５１１を有する単溶
原菌Ｃ７（β１９７）^tox-；レーンＧ：クロラムフェニ
コール（２μｇ／ｍＬ）有りで増殖させた単溶原菌Ｃ７
（β１９７）^tox-。

【図３】抗生物質選択なしで、プラスミド保持の指示と
してクロラムフェニコール耐性を用いた、ジフテリア菌
Ｃ７（β１９７）^tox-内におけるプラスミドｐＰＸ３５
１１の安定性を示すグラフである。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジフテリアトキシンと交差反応性を示
すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質の製造方法
において、ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白
質をコード化する遺伝子、ｂ）コリネバクテリウム属の
複製開始点、およびｃ）選択性マーカー、を含んでいる
プラスミドを用いて、コリネバクテリウム種微生物の形
質転換を行い、そして該微生物による該遺伝子の発現に
充分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させ
る、ことを含む方法。
【請求項２】ａ）ジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ
蛋白質をコード化する遺伝子、ｂ）コリネバクテリウム属の複製開始点、およびｃ）任意に多重クローニング部位に連結している、選択
性マーカー、を含んでいる、宿主内でジフテリアトキシンと交差反応
性を示すジフテリアトキシンもしくはＣＲＭ蛋白質を発
現させるためのプラスミド。
【請求項３】請求項２のプラスミドで形質転換されて
いるコリネバクテリウム種の微生物。