SK24094A3

SK24094A3 - New plasmid for crm and difteric toxin production

Info

Publication number: SK24094A3
Application number: SK240-94A
Authority: SK
Inventors: Benjamin J Metcalf
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1995-03-08
Also published as: EP0616034B1; FI112090B; AU5759594A; CZ39394A3; ES2231770T3; JPH06292593A; NO940774L; NZ260027A; KR940021731A; FI941050A; ATE280235T1; EP0616034A2; CN1100757A; US5614382A; DE69434079T2; KR100316004B1; DE69434079D1; PT616034E; BR1100634A; NO940774D0

Description

Nový plazmid na produkciu CRL proteínu ε difterického toxínu *

Cblasť techniky

Predložený vynález sa týka nového plazmidu na produkciu C R M proteínu a difterického toxínu s mikroorganizmov, transformovaných týmto novým olazmidom.

Doterajší stav techniky

CBLI197 proteín je netoxická forma difterického toxínu, ale je imunologický nerozlíšitel'ný od difterického toxínu. CHÍ1197 je produkovaný C. diphtheriae infikovaným netoxigénnym fágom /ol97^^ox” vytvoreným nitrózoguanidínovou mutagenézcu toxigénneho korynefágu p /Uchida T. a spol. 1971, Náture New Biclogy 233:8-11/. CH2Ú197 proteín má rovnakú molekulovú hmôt-

ε v súčasnosti ^e používaný v Haemophilus influenzae

88:ύ19 7 kcnjugátovej vakcíne /dibTiter¹*“, typ t oligcsacharid Lederle rraxis'BioPoches ter,

tých lyzogénov až trikrát vyššie akc s jednoduchými lyzogénmi. Hladiny produkcie CRkl97 jednoduchými lyzcgénmi sú adekvátne, ale ekonomicky neuspokojivé pre produkciu vakcín, ktoré využívajú CRL·!!?? proteín. '·

Zavedenie mnohonásobných lyzogénov z kcrynefágu β> 'do Corynebacterium diphtheriae je laboratórny screeningový proces na identifikáciu kmeňov, ktoré môžu nadmerne produkovať CRM197 proteín, difterický toxín alebo iné CúiR proteíny, ktoré sú skríženéreaktívne s difterickým toxínom. Ďalej je tento proces limitovaný vo svojej schopnosti ovplyvňovať expresiu proteínu za použitia štandardných rekombinačných techník. Bolo by preto výhodné vyvinúť proces, ktorý môže generovať významné množstvá difterického toxínu a CFM proteínov zvýšením počtu génových kópií bez použitia korynefágu 6 , alebo zvýšením produkčných hladín týchto proteínov z kmeňov lyzogénnych pre korynefág /5.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka nového spôsobu a plazmidového systému na manipuláciu a zavedenie génu, kódujúceho CRM197, difterický toxín a iné CRii proteíny odvodené od génu difte.rického toxínu, ako ej mikroorganizmov, transformovaných týmito spôsobmi. Obzvlášť preferovaný DNA plazmid, osnačený pPX 3511, ktorý kombinuje gén pre CRM197 z netoxigénneho betafágu a .plazmid pNG2-22 je tu popísaný'. Nový plazmidcvý systém je schopný transformácie kmeňov Corynebacterium diphthe.riae' na· kmene,' ktoré sú schopné exprimovať vysoké hladiny CRL.197 proteínu bez použitia mnohonásobných lyzcgénov. Vynález poskytuje elegantné spôsoby zvýšenia proteínovej expresie CRSÚ197, difterického toxínu a iných CRm proteíncv, odvodených od difterického toxír.ového génu. Rxpresia génu môže ’c-yť tiež ovplyvnená zvýšením sily promótora alebo odstránením promótora z regulácie železom. Vo výhodných prevedeniach môže byť plazmiďový systém použitý na expresiu iných proteínov ako genetických fúzií s CR1I197, difterickým toxínom alebo inými CRM proteínmi odvodenými z difterického toxínového génu. Regulátorová a spr.acovávacia sekvencia CRw;i97, difterického toxínu alebo iných CRY. proteínov, odvodené z difterického génu, môžu byť použité na expresiu cudzích proteínov v Corynebacterium spp.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obr. 1 - je rekombinačný DNA plazmid, označený pPX35H, ktorý obsahuje gén CRLĹ197, násobné klonovacie miesto,odvodené z E. coli kloncvacieho vektora pUC 18, ktorý obsahuje znak chloramfenikolovej rezistencie ,/CmR/ ε pcč-iatok replikácie odvodený od plszsidu .pNG2-22 /Sewold-Davis T. Li. e spoí. , 1990, FEM Microbiol. Lett. 66:119-124/.

Obr. 2 - je 12* SDS-PAGE gél, ktorý ukazuje produkciu CRLÍ197 /61,3 kilodalton/ z rôznych kmeňov C-diphtheriae C7. Dráha A: štandardy s vysokou molekulovou hmotnosťou /BRL, 200-14,3 kilodalton/, dráha B: jediný lyzogén C7/^>197/^tOX·, dráha C: dvojitý lyzogén C7/pi?7/^t0X”, dráha D: nelyzogénny C7/-/^t0X s pPX 3511, rast bez chloramfenikolu /Cm2/ /2/ig/ml/, dráha E: nelyzogénny 07/-/ s pPX 3óll, rast s chloramfenikolom /2 <ug/ml/, dráha F: jediný lyzogén C7//3197/^t0X- s pPX 3511 rast bez chloramfenikolu /2 ^ig/ml/, dráha G: jediný lyzogén 07/β197/^ΐοχ_ rast s chloramfenikolom /2 pjg/ml/.

Cer. 3 - ukazuje stabilitu plazmidu pPX 3511 v C. diphtheriae C7 /^197/^tOX” za použitia chloramfenikolovej rezistencie ako indikátora plazmidovej retencie bez antibiotickej selekcie.

Fredložený vynález poskytuje nový spôsob a plazmidový systém na produkciu difterického toxínu, CRM197 ε iných CRM proteínov odvodených z difterického toxínového génu v množstvách, ktoré sú postačujúce na použitie vo vakciná.ch alebo iné použitia, vyžadujúce adekvátne spracovateľné množstvá týchto proteínov. Plazmidový systém poskytuje účinné spesoby na zavedenie a zvýšenie počtu kópií génu difterického toxínu alebo CHM génu v Corynebacterium spp. Plazmid má svoj vlastný nezávislý episos so svojimi- vlastnými replikačnými funkciami, čc umožňuje plazmidu zavedenie extra kópií génu difterického toxínu alebo C Ká do hostiteľských kmeňov, ktoré nie sú schopné takej integrácie, alebo ktoré predtým neboli infikované fágom ^197^tox~. Napríklad hladiny CRiv.197 proteínu produkované Corynebacterium spp, majúcim plazmid podľa predloženého vynálezu, sú porovnateľné, ak nie lepšie než výťažky CRL1197 proteínu exprimované viacnásobnými lyzogénmi C. diphtheriae, ktoré boli infikované keryfágom />197^b0X_.

Flazmidy, produkujúce vysoké Hladiny podľa predloženého vynálezu, obsahujú gén, kódujúci difterický toxín alebo CPM proteín, obsahujúci jeho promótor ε regulačnú signálnu sekvenciu; počiatok Corynebacterium replikácie taký, že výsledný plazmid môže byť zavedený do Corynebacterium spp., a selektovaný.marker , ktorý.je poprípade pripojený k násobnému klonovaciemu miestu. Tento plazmid sa používa na transformáciu mikroorganizmov rodu Corynebacter.ium a najme Corynebacterium diphtheriae, za podmienok dostačujúcich na uľahčenie expresie difterického toxínu alebo CF.ľ génu. Vhodné kultivsč né podmienky budú odborníkom v obore zrejmé v závislosti od hostiteľského organizmu. Napríklad pre optimálnu produkciu CRM197, difterického toxínu alebo inéhc CRM pre ternu z Corynebacterium spp. , je nevyhnutne udržiavať mikroorganizmus v médiu s nízkym obsahom železa alebo v médiu zbavenom železe.

Flazmid obsahuje gén, kódujúci difterický toxín alebo CRit proteín, ktorý je odvedený od génu difterického toxínu. Príklady CR:>. proteínov., napr. Príklady CRM proteínov, t. j. skrížené reaktívne materiály /Cross-P.eacting iiaterials, kto ré sú skrížené reaktívne s difterickým toxínom, ktoré môžu byť použité v plazmidových konštruktoch podľa vynálezu, zahŕňajú, ale nie sú tak obmedzené, CRM197, CRľ.45, CR&3O, CRM228 a CRÍÍ176. .Gén, kódujúci CPX197 proteín je odvodený od difterického toxínu /DT/, ktorého sekvencie bola popísaná Greenfieldom a spol. /C-reenfield L. & spol., 1983, Proc. Natl. Acas. Sci. USA, 80:6353-6357/. Rczdiel medzi DT génom a CR1197 génom je v jedinej zmene bázy v štrukturálnom géne. Mukleotidové sekvencie pre niektoré CR1 gény beli popísané.

T. s spol. /J. Biol. Chem., 248:3838-3844, 1975/. gén, obsahujúci svoju regulačnú signálnu sekvenciu, produkovaný pclymerázovou reťazovou, reakciou /PCR/.

Na generáciu génu CRM197 alebo iných CRľľ génov môžu byť použité inc· amplifikačné techniky alebo syntézne techniky.

násobné klonovacie mieste odvodené od iných zdrojov, napríklad.peluesseript alebo iné synro vnako

tetické násobné kloncvecie miesto. Alternatívne násobné klonovacie miesto môže byť eliminované celé bez interferencie s operebilitou plezmidu. V inom prípade je selektovsteľný marker inkorpor.ovaný do plezmidu. Môže byť použitý akýkoľvek marker antibiotickej rezistencie ako selektujúci marker, ako napríklad je bez toho, aby došlo k obmedzeniu, ampic.ilín, erytromycín, chloramfenikol, kanamycín. Vnímavosť kcrynebektérií k antibiotiku voľby je testovaná ako prvá. Preferovaný je chloremfenikol, ak sú exprimcvané proteíny zamýšľané na humánne použitie, pretože chloramfenikol bol na tieto účely schválený od Food and Drug Administretion. Ako alternatívy k markerom antibiotickej rezistencie mcžu byť použité iné metódy plazmidcvej selekcie,ako je rezistencia voči ťažkým kovom alebo nutrične požiadavky.

Zdroje replikácie vhodné ne konštrukciu vysckc produkčných plazmidov podľa vynálezu sú tie, ktoré sú odvodené od Corynebacteriua spp. Zdroj replikácie zvolený pre pFX 2511 je odvodený od Corynebacterium ôiphtheriae. Vio príkladová časť. Môžu byť použité iné-.zdroje corynebacter.

7c výhodnom predvedení sa vysoká hladina expresie

C 7 oo xm e n o v, ktoré

Plesmi·· pPXôbll, uvedený ne obr obsahu je od cifterického toxínu. _/ ^/C-resn ield L po-· ,

1982., Proc ;C l·

Λ O r. U cas

P1 a z m z o u p * í u* cí — 2 , do ktorého bol

CR·' 1^7

cicu do C ako ts and

11. a spol

Microbicl pájajú k širokému rozsahu hostiteľov a sú v malom počte kópií /5 až 10 kópií/bunka / raz testovaných ccryneformoch.

vo sa vyskytujúci C erytrcmycín reR’odičovský plazmid pNG2 je prirodzene diphtheriae plazmid, ktoýr bol izolovaný z zistentných klinických kmeňov. Pečiatok replikácie pNG2 je obsiahnutý na 2,6 kb EcoRI-Clal fragmentu. Tento počiatok replikácie bol použitý na vytvorenie vektora chloramfenikolovej rezistencie označeného pHG2-22 /Serwcld-Davis a spol. ibid./ a pCk 1904/.

označeného pHG

2,6 /Schmit_r 1991, Infect immun

59:1899.men u ným p? X 3511 produkovať C P.

, CC /S 19

UmO -γίΟΧ í rii , ibid./. Táto tech:skutočnená za ocužitia zvýšenie sú oorcvn ave.ne hladinami jediné?.

ATCO č. 5328 /fol97/^tCX .n

-.c lyzog a dvojitého , ATCC č. 29ťo_?, enu

X 2511 plszmio. rxcio ožarované, vany oo o. exeresie CR.

t r. e rias ú / '4

KV

V iných predvedeniach vynálezu je nový plazmidcvý vektor modifikovaný na vytvorenie série plazmidových vektorov s . . rôznymi schopnosťami. Napríklad miestne riadené mutagenézy môžu byť použité na uskutočnenie zmeny jednej bázy v CBM197, takže nový plezmid by mal exprimovať difterický toxín. Iné zmeny môžu byť vykonané na klonovanej Cľľ.197 génovej sekvencii na expresiu iných známych difterických tcxínových CRi»l proteínov, ako je CRM45, CRmjO, CRM228 a CRM176 /Uchida T. a spol. , 1973, J. Biol. Chem. 248:3838-3844/⁷.

Za použitia rekombinačných DNA techník môžu byť uskutočnené zmeny na regulačných alebo spracovávacích sekvenciách CRM1--7 alebo na inom podobne klonovanom difterickom toxíne alebo CRivi génoch pre äalšie zvýšenie produkcie týchto proteínov. Napríklad tcx promótorova oblasť môže byť modifikovaná na zbavenú promótora z regulácie železom.

V čalšom predvedení môže byť plazmidový vektorový systém modifikovaný k zavedeniu klonovacích miest pre reštrikčné enzýmy do sminokonce CPÁ197 génu alebo podobne klonovanéhc difterického toxínu alebo CRM génu. Klonovanie DNA sekvencií z iných proteínov dc klonovacích miest by potom malo umožniť plazmidovému vektoru kc-exprimovať iné rekombinsčné proteíny alebo antigény ako aminoterminálne fúzie s CRM197 proteínom alebo podobne klcnovaným difterickým toxínom alebo CRM proteínom, všetko za riadenia tox promótorom a signálnej sekvencie. Ďalej alebo alternatívne môžu byť klonujúce mies ta inzertované do karboxyterminálnej časti CRľ..l97, difterického toxínu alebo .podobne klcnovar.éhc CHA pre iných proteínov .ako . karboxyterminálnych fúzií.

expresiu

VÓaka prítomnosti CRM1/7 regulačnej sekvencie by mal teín sekretovaný dc kultivačného média.

výsledný fúzny preIternatívne je nevyhnú tné použiť len regulátorevú signálnu s e uvenc i u CRM197 . antigény pcuž u zahŕňajú čas od baktérií, vírusov, buniek a rozpustných hormóny a pglykcproteíny teľné pri produkcii antigénov, ako sú parazitov alebo antigénov, . Antigény, vírusové, fungálne, parazialergény, tumormi.

ako j >

vlášť zaujímavé, sú tárne alebo bakteriálne antigény, tcimunity alebo antigény spojené s môžu byť získané z prírodných zdrojov alebo kované rekombinačnou DNA technológiou alebo inými antigény byť produprostried kami i'.edzi su spojene ~ ή p T e. c - » - — ohilus ; treoto cc o cus detel aures, _cec if κ dôležité bakteriálne antigény patria s ľudskými bakteriálnymi cstogénmi, ktoré zahŕňanie sú tak obmedzené, typické alebo netypické Heemoúeisseria meningitidis, occus pycgenes, Branhameleisseria goncrrhoeae, Boruginosa, Ôtaphylococcus Clostridium tetani. N f ' o --- >

ktoré

-j- » pneur.cr.iae, Streptccc , Vibrio cholerae, certussis

Klebsiella oneumen iektoré

Δ.“ ntigény <

c ·ob.ilus

T* T o ' c x _-j « iní luer.zae orcteíny vonks.^e r' .l T -.r / ; r>

, .iCb

z.. naemc·Γδ

Otí lod i

heisserxa menín;

eisseria i? ο n o r r— '/r r' r< z t, p r dovrchová o Streo toccccus o r* 'Λ* O v, g ť zsnľiyc n ' ·, . ,4 . ? . A

O. ľ e x ·.

s alebo r, ť_ c. ς / — c r · -^ jx i ·

..C _{c ?} θ /*,? 3. s / - ?

III/

O S ’' ° ” ·* «j — - u x e s vr.

yci

Iny vírus > vi neoat

A, hepatitídy epe titídy a non vi ru s

O ixli — lex c;

cyio vírus, influenzae, *r u? CÍ J.

zae pcLioviru

VI virus c sypek k, ružienky, vírus _pstein-Earrcve <J r adenovírus, vírus papiloma vírus nych

Niektoré vírusov

Q.

Syncytial socl

VP4 povrchové špecifické obsahujú koorc te ír.y j u, cú;.

CO C,l.

to no* žene d ’ p ~

- - -ť ·' J ¹ doch vírusové antigény týchto patogénproteín popísaný v

Vaocine s e Οpredtý o osiove proteíny pre témy oreževrchové ílne anti •J· Ä r* O ~ ‘ ^xv to jU i nb ·*-<-·· ,

1A S / r- * • i 'U obsehujúce

WC8S/C293? nazvanej hespirato:· and .Diegnostic Asssys , Ťradiso ne syr.cialnehc vírusu

C.. X h. x

7X7, tie

717 polypeptidy í t. 1 ?!

ktoré ale ne o t euzújuci n <w i 1 ci , Cryptococcus spp. /

-m dermetitidis/ uccciarcideš + n r-k · · /

- — ·^χ0 esmc-diuz .u d '7

J'w U ·

S T/ í klady predvede

CO1 .d e.

0Γ8 sme so·:

oližžie n o n t; υ r u x cy liensi

T“ • A'w’ V odvodené

Od íi n

c.

4; σ· i. ; O /

Z8 n r>.

t· r ·* * ncx_u <j úib. 1 uil. V i C í

- pne ) « G» * coc

-C 4.

oergillus so ale- nie sú tak obchiscstcsoma soo a ŕneumccystis vysvetlený v ⁷7u-^:-^£ /úRL, Gaimersburg,

r.os:

' · n / 1». v/.

ich orikla ss ooužívs vo všet11 kých klcnovacích postupoch. Kmene netoxigénne, nelyzogénne C. diphtheriae 07 /-/ , netoxigénne, rez lyzogánne C.

diphtheriae C7/(ol97/^tox- ATCC č. 5223 sa používajú ako plazmidoví hostitelia, aj akc kontroly v štúdiách expresie CRK197 proteínu. Netoxigénny, dvojito lyzcgénny C. diphtheriae C7//?>197/^tox_ ATCC č. 29255 sa použije ako kontrola v pokusoch s expresiou CRM197 proteínu.

Kultivačné médiá a podmienky

E. coli DH5<£ sa rutinne kultivuje na super optimálnom pôdnom /SOB/ agarovom médiu a v SOB kvapalnom pri 37 °C ZSambrook J. a spol., 1959, MpleculareCloning: A Labcratory Kanual, Cold Spring Harbor Laboratory Fress, Cold Spring Harbor, NY./. Kmene C. diphtheriae 07 sa rutinne kultivujú na SCC agare /Sambroek J. a spol., ibid./ a kvapaline. ET osmctické agarové médium /Best G. R. s K. L., Britz, 19S6, Appl. llicrobiol. Biotech., 22:288-293/ sa použije pri platňovaní elektťoporóvaných buniek. CY médium zbavená železa /Rappuoli R. a spel., 1983, J. Becteriol., 153:1202/ sa použije na experimenty, zahŕňajúce expresiu CRM197. Chlcramfenikol sa pridáva v množstve 34 Aig/al pre E. coli DH5<X a 2 /ig/ml pre C. diphtheriae C? Kmer.e, obsahujúce plazmid pPX 3511.

Klonovanie CRK197 génu

CR1'197 gén sa klonuje

FCR /pelymerázovi reťazová reakcia/ amplifikáciou génovej sekvencie /£197/^tcX” jednoducho lyzogénnou DNA z C. diphtheriae 07 za použitia oligcnukleotidových primerev na báze publikovanej sekvencie difteric<éhc· tcxí

1933, Prec nu /Greenfield L. a spol.

Sci. USA 30:6852-6357/. Priméry sú priraer by mal vytvoriť Sall/nincľl čiatku funkčného génu a druhý by mal vytvoriť

Kati. Acad.

r*.

tvarované reštrikčné tak, že jeden miesto na poXbal miesto po génovom stop kodóne štruktúrneho génu, -ieto alebo podobné primery sa používajú na amplfikáciu a klonovanie CHM’97 gé•r nu, difterického toxínového génu a akéhokoľvek CRM génu podobného difterickému toxínovému génu kódovanému korynefágom ý.

CF.M19? PCR produkty sa štiepia pomocou HincII a Xbal a ligujú do Smal/Xbal štepeného pNG-22, vektora chloramfenikolovej rezistencie v širokom rozsahu hostiteľov so schopnosťou replikácie ako v Ssc’nerichia coli, tak Corynebacterium spo. Na transformáciu S. coli DH5ísa použije ligácia a rekombinačné kolónie sú screenované reštrikčnou analýzou na prítomnosť CRM197 génu. Jeden izolát, pPX 3511, je sekvenovaný za použitia presahujúcich primerov pre overenie akýchkolek zmien v CRM197 géne. Oligonukleotidové primery použité v PCR a sekvenovaní sú syntetizované na Applied Piosystems 330E DNA syntetizátore. PCR sa uskutočňuje s cyklovačom Perkin-Slmer Cetus DNA Thermal Cycler. Sekvenovanie sa vykonáva na Applied 3iosystems Sequencer 373A. Výsledný plazmid /pPX 3511/ je trar.sf erovaný elektroporáciou do netoxigénneho, nelyzogénneho kmeňa C. diphtheriae C7/-/^tox~ a netoxigénneho kmeňa C. diphtheriae 77 /;E 97/^tox”, ATCC č. 5328.

Clektroporácia C.

diphthriae C7

C. diphtheriae C7 sa transformuje plazmidcvá pPX 5511 použitia protokolu vyvinutého pre transformáciu Corynebacterium glutamicum a Rrevibacterium lactofermentum /Hayes J. A. a Jí. L. Britz, '989, PEMS Micro biol. Lett. 01:329-334/, s tým rozdileom, že sa použije SCC médium doplnené C,2 .ť Tweenu-80. Na elektroporáciu sa použije 3TX Transfector i CC s Power Plus a Cptimizor Graphic Pluse Analýzer 'mm kyvety. Prítomnosť plazmidu pPX 35'’ v trans- 13 formovaných C. diphtheriae C7 kmeňoch je overená plazmidovou záchranou a reštrikčnou analýzou.

Príklad 2· Expresia

Kvantitatívna CRmi 97 štúdia

Porovnanie produkcie CRM197 sa vykoná kultiváciou kmeňov C. diphtheriae za podobných podmienok a porovnaním množstva CRái197 v supernatante kultivácie. Pri. kvantitatívnom porovnávaní kmeňov sa 4 ml kultúry narastenej cez noc zriedia na °^5qq⁼ O,¹ v CY médiu zbavenom železa /30 ml konečný objem v 250 ml Erlenmeyerovej banke/ a za pretrepávania sa kultivuje 20 hodín pri 37°C. Kmene, obsahujúce pPX 3511 sa kultivujú bez i s antibiotickou selekciou /2 jig/ml chloramfenikolu/. Po inkubácii sú kultúry odstredené pre odstránenie buniek a 20 ,ul supernatantov kultúr sa podrobí spracovaniu na 12# SEDS-Pá'j- géle. Gél sa vyfarbí comassie farbivom a vykoná sa kvantitatívne porovnanie za použitia zariadenia Bio-Rad ^odel 1650 Transmittance/Reflectance Snannig Densitometer s Hoefer Scientific GS 37C Analysis Package. Porovnanie antigénnych vlastností rakombinačného CRM197 proteínu a lyzogénneho píl 97 CRM197 proteínu sa vykoná imunoblottingom gélu a sondovaním monoklonálnymi protilátkami k CRM197, CRM197 produkovaný pPX 3511 je antigenicky identický s CRM197 produkovaným l.yzogénhymi kmeňmi.

Experimenty stability plazmidu pPX 3511

Stabilita plazmidu pPX 3511 je študovaná za použitia udržania chloramfenikolovej rezistencie ako indikátora plazmidovej retencie bez antibiotickej selekcie. Kultúry C. diphtheriae C7 /,M97/^ÍOX- pPX 3511 sa kultivujú i SOC pôde doplnenej 0,1 # lweenu-80 pre zabránenie zhlukovania buniek

- 14 13 hodín /14-¹7 generácií/ pri 37°C. Kultúry sa potom umiestnia na SOC agar pre spočítanie kolónií a zriedia 1/10 pre áalšiu generáciu. SOC agarové platne sú opakovane umiestnené na SOC agar 2 ,ug/ml chloramfenikolu a spočítajú sa percentá kolónií, udržujúcich rezistenciu k chloramfenikolu. Proces sa opakuje 60krát.

Príklad 3: Biologické výsledky

Kvantitatívne porovnanie CRM197 produkcie z rôznych C. diphtheriae C7 kmeňov densitometriou coomassie vyfarbených gélov /obr. 2/ ukazuje, že kmene s pPX 3511 produkujú asi dvakrát viac CRM197 než jednoduchý lyzogén a rovnako ako dvojitý lyzogén /tabuíak 1/. Stabilita plazmidu pPX 3511 v

počas šesťdesiatich generácií je uvedená na obr. 3«

Tabuíka 1

Produkcia CPM197 kmeňmi C. diphtheriae, vyjadrená ako násobky produkcie s jedným lyzogénnym /£197/^ίοχ” násobky produkcie s jedným₊lyzogénnym

dvojitý lyzogén /ô197/^tox

p?X	351	. - ,t ox ' ne, CJÍ2	2,^s
p?X	351'		i <5

pPX	351i	(/ľ-;₉₇₎-o:íí- _{πβ) Ja2}	2,0
p?X	35i ;	Z' . _Λ . T y <_ ’ < ¹ ' J	·

Biologické uloženie

Plazmid pPX 3511 bol uložený podía pravidiel Budapeštianskej zmluvy v Američan Type Culture Collection /ATTC/, 12301 Parklawn Drive, Pockville, Maryland 20852 12. februára

1993 a bol označený ATCC prírastkovým číslom ' 75415. Všetky obmedzenia dostupnosti publikovania uloženého materiálu budú odstránené po udelení patentu pre túto prihlášku. Uloženie bude udržiavané v prístupnom depozitári počas najmenej 30 rokov od dátumu uloženia alebo počas životnosti patentu alebo počae piatich rokov po dátume najpočetnejších požiadavok na vydanie vzorky biologického materiálu. Uloženie bude obnovev né, ak nebude životaschopný alebo replikovatelný.

Odborníci v obore bubú schopní za použitia iba rútin. ných pokusov .stanovít mnoho ekvivalentov k tu popísaným špecifickým predvedeniam. Také ekvivalenty spadajú do rofcsahu nasledujúcich nárokov.

Claims

1. Spôsob produkcie difterického toxínu alebo CR1I proteínu, ktorý je skrížené reaktívny s difterickým toxínom, v yznačujúci sa tým, že zahŕňa transformáciu mikroorganizmu druhu Ccrynebacterium plszmidom, obsahujúcim a/ gén, kódujúci difterický toxín alebo CRií proteín, b/ Corynebacterium počiatok replikácie a c/ selektujúci marker a expresiu uvedeného toxínu alebo proteínu za podmienok umožňujúcich expresiu génu mikroorganizmom.

2.

m,

Spôsob podľa nároku 1, v y z n že transformácia sa uskutočňuje a č u j ú c i s elektroporáciou.

m,

Spôsob podľa nároku 1, v y z n že mikroorganizmom je Ccrynebacteriur j ú c i s diphtheriae m,

Spôsob podľa nároku 3, v že kmeňom Corynecacterium

C7.

t 7 m,

CR&45, nároku 1, v vybratý zc a CFÓÍ176.

y z n e skupiny, j ú c i zahŕňajúcej

Spôsob podľa že počiatok nároku 1 reolikácie expresiu di skr fterického tcxí ene reaktívny s dift

J-Λ ericxym toxíne m

I v hostiteľovi, obsahujúci a/ gén, kódujúci difterický toxín alebo CHLi proteín, b/ Corynebscterium počiatok replikácie s c/ selektujúci marker poprípade pripojený k násobnému klonovaciemu miestu.

8. Flazmid podľa nároku 7, kde gén, kódujúci proteín je operatívne pripojený k nukleotidovej sekvencii, kódujúcej jeden alebo viac proteínov, peptidov alebo ich epitopcv.

9. Flazmid pFX 3511, ATCC prírastkové číslo č.75415.

1C. Mikroorganizmus rodu Corynebacterium, ktorý je transformovaný plazmidom podľa nároku 7.

/X -99