CN1100757A - 产生交叉反应物质蛋白和白喉毒素的新型质粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及大量产生CRM197蛋白，白喉毒素 或其他与白喉毒素有关的CRM蛋白的新型质粒系 统和方法，以及用新质粒转化的微生物。描述了一种 特别优选的DNA质粒pPX3511。新质粒系统能将 白喉杆菌转化为能高表达CRM197蛋白而不必使 用多重溶源菌株。本发明提供了一种增加蛋白质产 量的精巧手段。

Description

CRM 197蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫上与白喉毒素难以区别。CRM 197是由不产生毒物的噬菌体β197tox-感染的白喉棒状杆菌（即白喉杆菌）产生的，而β197tox-是通过用亚硝基胍使产生毒物的β棒状噬菌体发生突变而产生的（Uchida，T.et al，1971，Nature New Biology 233：8-11）。CRM 197蛋白与白喉毒素的分子量相同但是在结构基因中的一个碱基的改变（鸟嘌呤变为腺嘌呤）造成了两者的差别。这个单一的碱基改变在成熟蛋白质中造成了氨基酸的替代（谷氨酸替代甘氨酸）并因此消除了白喉毒素的毒性。CRM 197蛋白是安全而有效的依赖T-细胞的糖类载体，目前用于B型流感嗜血杆菌寡糖CRM 197结合疫苗（Hib TiterTM;Lederle Praxis Biologilacl，Rochester，N.Y）。
大量生产用于疫苗的CRM 197蛋白因为蛋白来源不丰富而受到阻碍。人们已发展了使用双溶源非产毒棒状噬菌体β197的支持生产CRM蛋白的技术。（Rappuoli，R.，1983Applied Env.Microbio.46：560-564;U.S.Patent 4，925，792issued to R.Rappuoli;and Rappuoli，R.，1983，J.Bacteriol.153：1202-1210）。Rappuoli报导，用双溶源噬菌体得到的CRM 197的产量是使用单溶源的三倍。用单溶源噬菌体时CRM 197的生产水平是充足的，但是用于采用CRM 197蛋白生产疫苗在经济上是不能令人满意的。
将多重溶源的棒状噬菌体β引入白喉杆菌，鉴别出能过量产生CRM 197蛋白、白喉毒素或其他能与白喉毒素交叉反应的CRM蛋白的菌株，是一个费力的筛选过程。此外，这种方法在应用标准的重组技术进行蛋白表达操作的能力方面存在局限。因此，发展通过增加基因拷贝数目而不使用β棒状噬菌体，或者通过增加β棒状噬菌体溶源的菌株中的这些蛋白产量，从而产生大量的白喉毒素和CRM蛋白的方法是大有益处的。
本发明涉及用于操作和引入编码CRM 197、白喉毒素以及其他从白喉毒素基因衍变而来的CRM蛋白的基因的新方法和新的质粒系统，以及用这些手段转化的微生物。描述了一种特别优选的DNA质粒，名为pPX3511，它将来自非产毒的β噬菌体的CRM 197基因与质粒pNG2-22结合在一起。新的质粒系统能将白喉杆菌菌株转化为能高水平表达CRM 197蛋白而不需使用多重溶源的菌株。本发明提供了一种精巧手段，用于增加CRM 197，白喉毒素以及其他从白喉毒素基因衍生而来的CRM蛋白的表达。基因表达也可以通过增加启动子的强度或者解除启动子铁调节而加以操纵。在优选实施例中，质粒系统能用来表达与CRM 197，白喉毒素或其他从白喉毒素基因衍生而来的CRM蛋白在遗传上融合在一起的其他蛋白质。来自CRM 197，白喉毒素或其他从白喉毒素衍生而来的CRM蛋白质的调控和加工顺序能用于在棒状杆菌（Corynebacterium spp.）中表达外源蛋白。
图1是命名为pPX3511的重组DNA质粒，它含有CRM 197基因，从大肠杆菌克隆载体pUC18衍生而来的多克隆位点，其中含有氯霉素抗性（CmR）标记基因以及从质量pNG2-22衍生而来的复制起点（Serwold Davis，T.M.et al.，1990，FEM Microbiol.Lett..66：119-124）。
图2是12%的SDS-PAGE凝胶电脉图。它显示了白喉杆菌C7不同菌株所产生的CRM 197（61.8千道尔顿）。A道：高分子量标准（BRL，200-14.3千道尔顿）;B道：单溶源C7（β197）tox-;C道：双溶源C7（β197）tox-;D道：非溶源性C7（β197）tox-和pPX3511，在不存在氯毒素（Cm2）（2μg/ml）下生长;E道：非溶源性C7（-）tox-和pPX3511，在氯霉素（2μg/ml）下生长;F道：单溶源C7（β197）tox-和pPX3511，在不存在氯毒素下生长（2μg/ml）;道G：单溶源C7（β197）tox-，在氯毒素下生长（2μg/ml）。
图3显示质粒pPX3511在白喉杆菌C7（β197）tox-中的稳定性。用氯霉素抗性显示不加抗菌素选择时质粒的保留情况。
本发明涉及用于产生白喉毒素，CRM 197和其他从白喉毒素基因衍变而来的CRM蛋白的新方法和新的质粒系统，其产量足以用于疫苗制备或其他需要足够量可用的这些蛋白的用途中。质粒系统提供了在棒状杆菌中引入和增加白喉毒素基因或CRM基因的拷贝数的有效手段。该质粒具有其自身独立的能自我复制的附加体，从而使质粒能将额外的白喉毒素或CRM基因的拷贝引入那些不具备这种整合或者以前不曾被β197tox-噬菌体感染的宿主菌株中。例如，含有本发明的质粒的棒状杆菌产生CRM 197蛋白的水平，如果不优于用β197tox-棒状噬菌体感染的多重溶源白喉杆菌所表达的CRM 197产量的话，也是与之相当的。
本发明的高产质粒包含：编码白喉毒素或CRM蛋白的基因（包括自身启动子和调控信号顺序）;棒状杆菌的复制起点，从而使得到的质粒能被引入棒状杆菌;和任意连于某一克隆位点的供选择的标记基因。在足以协助白喉毒素或CRM基因表达的条件下，用该质粒转化棒状杆菌属的微生物品种，尤其是白喉杆菌。合适的生长条件对于本领域的技术人员而言是十分明显的，取决于宿主微生物。例如，为了最理想地用棒状杆菌属物种生产CRM 197，白喉毒素或其他CRM蛋白，有必要在贫铁或无缺（deterated）的培养基中培养微生物。
该质粒含有编码白喉毒素或者从白喉毒素基因的衍变而来的CRM蛋白的基因。能用于在本发明构建质粒的CRM蛋白[即能与白喉毒素在免疫上交叉反应的交叉反应物质（Cross-Reacting Material，CRM）]的例子包括，但不局限于：CRM 197，CRM45，CRM30，CRM228和CRM176。编码CRM 197蛋白的基因是从白喉毒素（diphtheria toxin，DT）衍生而得的，其顺序由Greenfield等人报导（Greenfield，L.et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：6853-6857）。DT基因与CRM 197基因的差别在于结构基因上的一个碱基的变化。某些CRM基因的核苷酸顺序已由Uchida等人报导（J.Biol.Chem.，248：3838-3844，1975）。包括其调控信号顺序在内的完整的CRM基因可以通过聚合酶链反应（PCR）而得到。也可以使用其他的扩增技术或合成技术产生CRM 197基因或其他CRM基因。
编码白喉毒素和CRM蛋白的基因上的调控信号顺序使蛋白质能被分泌在介质中。因此分泌的蛋白能从介质中回收并用已知的技术，如盐析或柱色谱法，加以纯化。
多克隆位点最好来自pUC18，但是其它来源的多克隆位点也可以使用，例如pBluescript或其他合成的多克隆位点。或者，可以去除所有的多克隆位点而不影响质粒的可操作性。在任何一种情况下，都将供选择的标记基因整合入质粒。任何抗菌素的抗性标记基因都能用作供选择的标记基因，例如（但并不局限于），氨苄青霉素，红霉素，氯霉素，卡那霉素。棒状杆菌对于所述的抗菌素的敏感性应先进行测试。如果表达的蛋白质是用于人类的话，氯霉素是优选的，因为FDA已经批准氯霉素用于这样的目的。可以使用其他筛选质粒的方法，例如重金属抗性或营养缺陷型，作为抗生素抗性标记基因的替代。
能用于构建本发明的高产质粒的复制起点是那些来自棒状杆菌属的。选择用于pPX3511的复制起点来自白喉杆菌。请参见实施例部分。可以使用其他棒状杆菌的复制起点。
在一个最佳实施例中，CRM 197蛋白质的高表达是通过使用一种新的重组DNA质粒，即pPX3511而达到的，该质粒能将白喉杆菌C7菌株转化成能高产CRM 197蛋白的菌标。图1所示的质粒pPX3511，含有以白喉毒素衍变而来的CRM 197基因（Greenfiled，L.et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：6853-6857）。质粒的其他部分来自亲本质粒pNG2-22，在pNG2-22中插入了CRM 197基因。
pPX3511质粒是通过先用聚合酶链反应（PCR）扩增来自白喉杆菌的CRM 197基因而得到的。接着，CRM 197基因被克隆入某个含有供选择标记基因的白喉杆菌质粒，例如pNG2（Schiller，J.et al.，1980，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 18：814-821）和pNG2-22（Serwold-Davis，T.M.et al.，1990，FEM Microbiol.Lett.66：119-124）。这两种质粒具有广泛的宿主范围而且在目前所有测试的棒状杆菌中能以低拷贝数目（5-10拷贝/细胞）复制。
亲本质粒pNG2是天然存在的白喉杆菌质粒，最早是从红霉素抗性的临床菌株中分离到的。pNG2的复制起点位于2.6kb的EcoRI-ClaI酶切片段上。该复制起点已被用来制造氯霉素抗性载体，即pNG2-22（Serwold-Davis et al.Ibid）.）和pCM2.6（Schmit，1991，Infect.Immun.59：1899-1904）。
接着，采用电穿孔的方法用得到的pPX3511质粒转化白喉杆菌C7菌株，从而使细菌能在不存在β197tox-噬菌体情况下产生CRM 197。可以使用其他转化技术，如已知的物理和化学方法（Serwold-Davis，et al.，Ibid.）。采用pPX3511的电穿孔转化技术也用于单溶源的白喉杆菌C7（β197）tox-，以增加CRM 197蛋白的产量。转化子表达CRM 197蛋白的水平与不具有pPX3511质粒的单溶源白喉杆菌C7（β197）tox-，ATCC No.5328以及双溶源白喉杆菌C7（β197）tox-M1，ATCC No.39255的表达水平进行了比较。结果发现，当将pPX3511转染至白喉杆菌C7菌株时，转化子能与双溶源白喉杆菌同等水平地表达CRM 197。
在本发明的另一些实施例中，将新的质粒载体加以修饰，从而产生一系列的具有不同能力的质粒载体。例如，能用定点突变修复CRM 197中的单一碱基变化，从而使新的质粒表达白喉毒素。对于克隆的CRM 197基因也可以进行其他改变，从而表达其他已知的白喉毒素CRM蛋白，例如CRM45，CRM30，CRM228和CRM176（Uchida，T.et al.1973，J.Biol.Chem.248：3838-3844）。
使用重组DNA技术，对CRM 197或者其他类似的克隆的白喉毒素或CRM基因的白喉毒素的调控和加工顺序加以改变还能用于进一步提高这些蛋白的产量。例如，能将毒素（tox）启动子区域加以修饰从而使启动子不受铁（离子）的调节。
在另一实施例中，有将质粒载体系统进行修饰，将限制酶克隆位点引入至CRM 197基因或者类似的克隆的白喉毒素或CRM基因的氨基末端。将其他蛋白质的DNA顺序克隆入克隆位点使得质粒载体能以CRM 197或者类似克隆的白喉毒素或CRM蛋白的氨基末端的融合蛋白的形式共表达其他的重组蛋白质或抗原，所有这些表达都在毒素启动子和信号顺序的介导下进行。此外，克隆位点也可以插入CRM 197，白喉毒素或类似克隆的CRM的羧基端，从而以羧基端融合蛋白的形式表达其他蛋白。因为存在CRM 197调控信号顺序，所以，得到的融合蛋白的能被分泌入培养基。或者，只需将CRM 197的调控信号顺序用作表达其他蛋白质的分泌形式进入培养基的手段。
能用于本发明的质粒生产的合适的蛋白质和抗原包括：颗粒性抗原，例如来自细菌、病毒、寄生虫或真菌和细胞微量组分及可溶性抗原，例如蛋白质，多肽，激素和糖蛋白。特别感兴趣的抗原是病毒的、真菌的、寄生虫的或细菌的抗原，变应原，自体免疫相关的抗原，或者与肿瘤有关的抗原。这些抗原可以从天然来源得到，或者通过重组DNA技术或其他的人工方法产生。
感兴趣的细菌抗原是那些与人类细菌病原体有关的抗原，这类病原体包括（但并不局限于）例如，可分型的和不可分型的流感嗜血杆菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，肺炎链球菌，化脓链球菌，卡它布兰汉氏球菌，霍乱弧菌，淋病奈瑟氏菌，百日咳博德氏菌，绿脓假单胞菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯氏杆菌和破伤风梭菌。某些特殊的细菌抗原包括细菌表面和外膜蛋白、（例如，来自于流感嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌或卡它布兰汉氏菌）以及表面蛋白（如来自化脓链球菌的M蛋白或者来自肺炎链球菌的37千道尔顿的表面蛋白）。
来自病原体病毒的病毒抗原包括（但并不局限于）来自于：人免疫缺陷病毒（Ⅰ型和Ⅱ型），人T-细胞白血病病毒（Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型），呼吸道合胞病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，非甲非乙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒（Ⅰ型和Ⅱ型），巨细胞病毒，流感病毒，副流感病毒，背髓灰质炎病毒，轮状病毒，冠状病毒，风疹病毒，麻疹病毒，水痘病毒，EB病毒，腺病毒，乳头瘤病毒和黄热病病毒。
这些病原体病毒的几种特殊的病毒抗原包括：F蛋白（尤其是含有F肽283-315的抗原，描述于WO 89/02935中，题为“Respiratory Syncytial Virus：Vaccines and Diagnostic Assays”，作者为Paradio，P.等人），呼吸道合胞病毒（RSV）的N和G蛋白，轮状病毒的VP4（以前所知的VP3），VP6和VP7多肽，人免疫缺陷病毒的外被糖蛋白，乙肝的表面和前表面（presurface）抗原以及疱疹糖蛋白B和D。
真菌抗原可以是那些来自下列真菌的，这些真菌包括（但并不限局于）：念珠菌属（尤其白色念珠菌），隐球菌属（尤其新型隐球菌），芽生菌属（尤其皮炎芽生菌），组织胞浆菌属（尤其荚膜组织胞浆菌），球孢子菌属（尤其粗球孢子菌），副球孢子菌属（尤其巴西副球孢子菌）和曲霉属。寄生性抗原的例子包括（但并不局限于）：疟虫（Plasmodium spp），艾美球虫（Eimeria spp），裂体吸虫（Schistosoma spp），锥虫（Trypanosoma spp），巴贝虫（Babesia spp），利什曼虫（Leishmania spp），Cryptosproidia spp，弓形虫（Toxoplasma spp）和Pneumocystis spp。
本发明通过下面的不起限定作用的实施例加以进一步阐述。
实施例1构建
细菌菌株
E.coli DH5 α（BRL，Gaithersburg，MD）用于所有的克隆程序。不产毒的、非溶源性的白喉杆菌C7（-）tox-和不产毒的、单溶源的白喉杆菌C7（β197）tox-ATCC No.5328都用作质粒宿主以及CRM 197蛋白表达研究中的对照。不产毒的、双溶源的白喉杆菌C7（β197）tox-ATCC No.39255用作CRM 197蛋白表达实验中的对照。
培养基及培养条件
E.coli DH5α常规上是在“超适肉汤”（super optimal broth，SOB）琼脂培养基上及SOB培养液中于37℃生长的（Sambrook，L.et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）。白喉杆菌C7菌株常规上是SOC琼脂（Sambrook，J.et al.，Ibid）和液体中培养的。当平板培养经电穿孔的细胞时，使用ET渗透琼脂培养基（Best，G.R.and M.L.Britz，1986，Appl.Microbiol.Biotech.，23：288-293）。涉及CRM 197的表达的实验中使用去除铁（离子）的CY培养基（Rappuoli，R.et al.，1983，J.Bacteriol.，153：1202）。氯霉素的加入量，对于E.coli DH5α为34μg/ml，对于含质粒pPX3511的白喉杆菌C7菌株为2μg/ml。
克隆CRM 197基因
根据已出版的白喉杆菌毒素的顺序（Greenfield，L，et al.，1983，Proc，Natl.Acad.Sci.USA.80：6853-6857）设计寡核苷酸引物，通过PCR（聚合酶链反应）扩增来自白喉杆菌C7（β197）tox-单溶源DNA的基因顺序，从而克隆CRM 197基因。引物是这样设计的：一个引物能在功能基因的起始处产生一个SalⅠ/Hinc Ⅱ限制性酶切位点，而另一引物在结构基因的基因终止密码子之后产生一个XbaⅠ位点。能用这些引物或类似的引物来扩增和克隆CRM 197基因，白喉毒素基因或任何由β棒状噬菌体编码的与白喉毒素相似的CRM基因。
CRM 197的PCR产物用Hinc Ⅱ和Xba Ⅰ消化并连入经SmaⅠ/Xba Ⅰ消化的pNG2-22。pNG2-22是宿主广泛的具有氯霉素抗性的载体，它能在大肠杆菌和棒状杆菌属中复制。连接物用来转化E.coli DH5α，并通过限制酶切分析CRM 197基因的存在与否来筛选重组子克隆。一种分离物，即pPX3511，用重迭引物进行测序以检查CRM 197基因中的任何变化。用于PCR和测序中的寡核苷引物在Applied Biosystem 380BDNA合成仪上合成。PCR在Perkin-Elmer Cetus DNA热循环仪上进行。测序用Applied Biosystems Sequencer 373A进行。得到的质粒（pPX3511）用电穿孔法转移入不产毒的，非溶源的白喉杆菌C7（-）tox-菌株和不产毒的白喉杆菌C7（β197）tox-菌株，ATCC No.5328。
白喉杆菌C7的电穿孔转化
通过电穿孔法，用质粒pPX3511DNA转化白喉杆菌C7，采用发展起来的用于转化谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌的程序（Hayes，J.A.and M.L.Britz，1989，FEMS Microbiol.Lett.61：329-334），除了使用添加0.2%Tween-80的SOC培养基。使用带Power plus和Optimizor Groaphic Pulse Analyzer的BTX Transfector 100以及1mm空隙样品池进行电穿孔转化。通过回收质粒和限制性酶切分析检查质粒pPX3511是否存在于转化的白喉杆菌C7菌株中。
实施例2：表达
定量表达CRM 197的研究
CRM 197产生情况的比较是通过在相似的条件下生长白喉杆菌C7菌株，然后比较培养上清液中的CRM 197蛋白的量而得出的。在菌株的定量比较中，4ml过夜的培养物在去铁（离子）的CY培养基中稀释至O.D.＝0.1（在250ml锥形烧瓶中终体积为30ml），并在37℃摇瓶生长20小时。含有pPX3511的菌株在抗生素选择或不选择下（2μg/ml氯霉素）进行生长。在保温之后，培养物经离心去除细胞，用20μl的上清液在12%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。凝胶经考马斯染色并用Bio-Rad Model 1650Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer和Hoefer Scientific GS370Analysis Package进行定量比较。重组CRM 197蛋白和溶源的β197tox-CRM 197蛋白的抗原性的比较是通过使用针对CRM 197的单克隆抗体对凝胶进行免疫印渍检测而得出的。由pPX3511产生的CRM 197与溶源性菌株产生的CRM 197在抗原方面是相同的。
质粒pPX3511稳定性实验
质粒pPX3511的稳定性是通过将氯霉素抗性的维持作为不采用抗生素选择时质粒保留的指示物进行研究的。白喉杆菌C7（β197）tox-pPX3511培养物在SOC培养基中于37℃生长18小时（14-17世代），其中添加了0.1%Tween-80以防细胞凝成块。培养物接着在SOC琼脂上涂布以便计数，并稀释10倍以为下一世代生长。SOC琼脂平板再影印于含2μg/ml氯霉素的SOC琼脂平板上并计算维持氯霉素抗性的菌落的百分比。该过程重复60世代。
实施例3：生物学结果
通过考马斯染色的凝胶的光密度分析法进行的不同白喉杆菌C7菌株所产生的CRM 197蛋白的定量比较显示（图2），带有pPX3511的菌株能产生约两倍于单溶源，或和双溶源相当的CRM 197（表1）。60个世代内的pPX3511质粒的稳定性见图3。
表1
以超过单溶源（β197）tox-的倍数所表示的白喉杆菌C7菌株的CRM 197产量
超过单溶源
(β197)tox-的倍数
双溶源(β197)tox-2.2
pPX3511β(-)tox-不加Cm2 2.8
pPX3511β(-)tox-,Cm2 1.9
pPX3511(β197)tox-,不加Cm2 2.0
pPX3511(β197)tox-,Cm2 2.4
生物保藏
根据布达佩斯条约，质粒pPX3511于1993年2月12日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852），其ATCC编号为75415。对于公众得到保藏材料的所有限制，一旦该申请被授予专利，将不可逆地去除，保藏物将在公共的保藏场处保藏从保藏之日起计算至少30件，或者专利的有效期，或者在最近一次要求提供生物材料样品之后五年，取其中时间较长者。保藏物将更换如果失活或不再复制。
那些本领域的熟练技术人员意识到，或者能够确定，通过使用常规实验手段，存在此处具体阐述的本发明的具体实施例的许多等价物。这些等价物是在本发明的权利要求的范围之中的。

Claims (10)

1、一种产生白喉毒素或能与白喉毒素交叉反应的CRM蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：用含有(a)编码白喉毒素或CRM蛋白的基因；(b)棒状杆菌的复制起点；和(c)供选择的标记基因的质粒转化棒状杆菌属的微生物，和在足以使微生物表达基因的条件下表达所述的毒素或蛋白。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化方法是电穿孔。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，微生物是白喉杆菌。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，白喉杆菌菌株是C7菌株。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，CRM基因选自CRM 197，CRM45，CRM30，CRM228和CRM176。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，复制起点来自棒状杆菌质粒pNG2。
7、一种在宿主中表达白喉毒素或能与白喉毒素交叉反应的CRM蛋白的质粒，其特征在于，包括：
（a）编码白喉毒素或CRM蛋白的基因;
（b）棒状杆菌属的复制起点;和
（c）任意连于某一多克隆位点的供选择的标记基因。
8、如权利要求7所述的质粒，其特征在于，编码蛋白质的基因通过操作连接于编码一个或多个蛋白质、多肽或其抗原决定基的核苷酸顺序。
9、质粒pPX3511，ATTC保藏号No.75415。
10、一种棒状杆菌属的微生物，其特征在于，用如权利要求7所述的质粒转化。
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PT (1) PT616034E (zh)
SK (1) SK24094A3 (zh)
ZA (1) ZA941548B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1086945C (zh) * 1997-06-03 2002-07-03 胡章英 白喉口服液
CN101265288B (zh) * 2007-03-13 2012-03-21 齐鲁制药有限公司 Crm197突变体的纯化方法
CN101460180B (zh) * 2006-05-31 2012-06-27 西尔维奥·布齐 与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子的药物应用
CN109100517A (zh) * 2018-10-08 2018-12-28 武汉生命科技股份有限公司 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69638145D1 (de) * 1995-04-14 2010-04-22 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur herbeiführung einer immuntoleranz mit hilfe von immuntoxinen
US7696338B2 (en) 1995-10-30 2010-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof
US7288254B2 (en) 1995-10-30 2007-10-30 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation
US7517527B2 (en) 1995-10-30 2009-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use
US7125553B1 (en) 1996-04-15 2006-10-24 The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins
DE69840913D1 (de) 1997-03-05 2009-07-30 Us Health Divalent anti-t-zellen immuntoxinen und deren verwendung
EP0968282A2 (en) * 1997-03-05 2000-01-05 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vectors and methods for expression of mutant proteins
US6676943B1 (en) 1997-04-24 2004-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae
GB9923060D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Chiron Spa Vaccine
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0211118D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Polonelli Luciano Vaccines
WO2004011027A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Baxter International Inc. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
EA012984B1 (ru) 2003-12-17 2010-02-26 Вайет Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
MY144231A (en) 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
IL308456A (en) 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
BRPI1014494A2 (pt) 2009-04-30 2016-08-02 Coley Pharm Group Inc vacina pneumocócica e usos da mesma
SG10201406432RA (en) 2009-06-22 2014-11-27 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
SI2445522T1 (sl) 2009-06-22 2017-10-30 Wyeth Llc Imunogeni sestavki antigenov Staphylococcusa aureusa
IT1398927B1 (it) 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
AU2010201410B2 (en) * 2010-03-30 2015-04-30 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant CRM197
AU2011238711B2 (en) 2010-03-30 2015-06-18 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
AU2011262346B2 (en) 2010-06-04 2014-12-11 Wyeth Llc Streptococcus pneumoniae vaccine formulations
EP2575868A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
KR101594228B1 (ko) 2010-08-23 2016-02-15 와이어쓰 엘엘씨 네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제
AU2011300409B2 (en) 2010-09-10 2015-03-26 Wyeth Llc Non-lipidated variants of Neisseria meningitidis ORF2086 antigens
KR101839496B1 (ko) * 2011-06-01 2018-03-19 시아먼 유니버시티 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질
KR101763625B1 (ko) 2012-03-09 2017-08-01 화이자 인코포레이티드 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2014013375A1 (en) 2012-07-16 2014-01-23 Pfizer Inc. Saccharides and uses thereof
CN102766647A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 天津康希诺生物技术有限公司 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌
IN2015DN00694A (zh) 2012-08-16 2015-06-26 Pfizer
CN104582718B (zh) 2012-10-03 2017-10-24 诺华股份有限公司 免疫原性组合物
KR20140075201A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
IL274500B2 (en) 2012-12-20 2024-01-01 Pfizer glycoconjugation process
TWI572356B (zh) 2013-01-04 2017-03-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 具有較高碳水化合物抗原密度之疫苗及新穎皂素佐劑
US9802987B2 (en) 2013-03-08 2017-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
US9707153B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
CN104140972B (zh) * 2013-05-07 2018-01-23 上海惠盾生物技术有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法
US9908805B2 (en) 2013-08-26 2018-03-06 Corning Incorporated Method for localized annealing of chemically strengthened glass
US9822150B2 (en) 2013-09-08 2017-11-21 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
CN105934251A (zh) 2014-01-21 2016-09-07 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PT3096786T (pt) 2014-01-21 2021-08-24 Pfizer Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos
WO2015110941A2 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2015117093A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Fina Biosolutions, Llc Expression and purification of crm197 and related proteins
JP2017505792A (ja) 2014-02-14 2017-02-23 ファイザー・インク 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN107109416A (zh) 2014-11-20 2017-08-29 生物E有限公司 用于crm197的高水平表达的密码子优化多核苷酸
PT3244917T (pt) 2015-01-15 2023-05-31 Pfizer Composições imunogénicas para utilização em vacinas pneumocócicas
KR20170103009A (ko) 2015-02-19 2017-09-12 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
EP3292146A1 (en) 2015-05-04 2018-03-14 Pfizer Inc Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
DK3313436T3 (da) 2015-06-23 2021-03-08 Biological E Ltd Multivalent pneumokok-konjugatvaccine
SG10202005253TA (en) 2015-07-21 2020-07-29 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
EP3377098A1 (en) 2015-11-20 2018-09-26 Pfizer Inc Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN109790545A (zh) 2016-03-10 2019-05-21 约翰·霍普金斯大学 产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途
US11965009B2 (en) 2016-03-10 2024-04-23 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
US11203626B2 (en) 2016-03-10 2021-12-21 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
EP3269385A1 (en) 2016-07-12 2018-01-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3474890A1 (en) 2016-06-22 2019-05-01 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN109862908B (zh) 2016-08-05 2023-05-02 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
CN109890415B (zh) 2016-08-05 2023-04-04 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
CA3037056A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Biological E Limited Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
KR102459629B1 (ko) 2017-01-20 2022-10-28 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물
WO2018144438A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f
PE20191107A1 (es) 2017-01-31 2019-08-26 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos
KR101908590B1 (ko) 2017-02-01 2018-10-16 (주)포바이오코리아 Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법
WO2018144799A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 SCHADECK, Eva, Barbara Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
RS63551B1 (sr) 2017-04-22 2022-09-30 Biological E Ltd Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou
CN111093650B (zh) 2017-09-07 2024-03-01 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
CN117982633A (zh) 2017-12-06 2024-05-07 默沙东有限责任公司 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
KR102475419B1 (ko) * 2018-07-16 2022-12-07 주식회사 유바이오로직스 Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3120922A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
SG11202106541WA (en) 2018-12-19 2021-07-29 Merck Sharp & Dohme Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
CA3136278A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
AU2020323498A1 (en) 2019-07-31 2022-03-03 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
CN115362177A (zh) 2020-02-21 2022-11-18 辉瑞公司 糖类的纯化
JP2023514697A (ja) 2020-02-23 2023-04-07 ファイザー・インク 大腸菌組成物およびその方法
EP3900739A1 (en) 2020-04-21 2021-10-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein
EP3919076A1 (en) 2020-06-02 2021-12-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations
EP4203995A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
KR20230043157A (ko) 2020-09-17 2023-03-30 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 다가 백신 조성물 및 이의 용도
CA3199094A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
AU2021368151A1 (en) 2020-10-27 2023-06-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20240000912A1 (en) 2020-11-04 2024-01-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
EP4243863A2 (en) 2020-11-10 2023-09-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
KR20220102871A (ko) 2021-01-14 2022-07-21 (주)셀트리온 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
CA3218544A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220387613A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024089001A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Idorsia Pharmaceuticals Ltd Vaccine against klebsiella pneumoniae

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH660375A5 (it) * 1983-02-08 1987-04-15 Sclavo Spa Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica.
FR2549855B1 (fr) * 1983-07-29 1987-03-27 Grp Genie Genetique Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1086945C (zh) * 1997-06-03 2002-07-03 胡章英 白喉口服液
CN101460180B (zh) * 2006-05-31 2012-06-27 西尔维奥·布齐 与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子的药物应用
CN101265288B (zh) * 2007-03-13 2012-03-21 齐鲁制药有限公司 Crm197突变体的纯化方法
CN109100517A (zh) * 2018-10-08 2018-12-28 武汉生命科技股份有限公司 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2116914A1 (en) 1994-09-06
ES2231770T3 (es) 2005-05-16
NO313758B1 (no) 2002-11-25
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HUT71320A (en) 1995-11-28
DK0616034T3 (da) 2005-02-21
CZ39394A3 (en) 1995-02-15
AU686126B2 (en) 1998-02-05
FI941050A (fi) 1994-09-06
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KR940021731A (ko) 1994-10-19
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PT616034E (pt) 2005-02-28
FI941050A0 (fi) 1994-03-04
NO940774D0 (no) 1994-03-04
US5614382A (en) 1997-03-25
EP0616034B1 (en) 2004-10-20
DE69434079D1 (de) 2004-11-25
IL108822A (en) 2004-09-27
NZ260027A (en) 1996-03-26
DE69434079T2 (de) 2005-02-24
AU5759594A (en) 1994-09-08

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