EA012984B1 - Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения - Google Patents

Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения Download PDF

Info

Publication number
EA012984B1
EA012984B1 EA200800300A EA200800300A EA012984B1 EA 012984 B1 EA012984 B1 EA 012984B1 EA 200800300 A EA200800300 A EA 200800300A EA 200800300 A EA200800300 A EA 200800300A EA 012984 B1 EA012984 B1 EA 012984B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
peptide
group
carrier
peptide immunogen
Prior art date
Application number
EA200800300A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800300A1 (ru
Inventor
Расаппа Г. Арумугхам
А. Кришна Прасад
Original Assignee
Вайет
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34700142&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012984(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Вайет filed Critical Вайет
Publication of EA200800300A1 publication Critical patent/EA200800300A1/ru
Publication of EA012984B1 publication Critical patent/EA012984B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов пептидных иммуногенов с молекулами белковых/полипептидных носителей, применимых в качестве иммуногенов, причём пептидные иммуногены конъюгируются с белками-носителями за счёт активированных функциональных групп на аминокислотных остатках носителя или необязательно связанной линкерной молекулы, а любые неконъюгированные реактивные функциональные группы на аминокислотных остатках инактивируют "кэпированием", тем самым сохраняя иммунологическую функциональность молекулы носителя, но уменьшая предрасположенность к нежелательным реакциям, которые могут сделать конъюгат менее безопасным или менее эффективным. Кроме того, данное изобретение относится также к иммуногенным продуктам и иммуногенным композициям, содержащим такие иммуногенные продукты, полученные такими способами.

Description

Предпосылки создания изобретения
Сущностью приобретенного иммунитета является способность организма реагировать на присутствие чужеродных веществ и продуцировать компоненты (антитела и клетки), способные специфически взаимодействовать с ними и защищать хозяина от их инвазии. Антиген или иммуноген представляет собой вещество, способное вызывать этот тип иммунного ответа, а также способное взаимодействовать с сенсибилизированными клетками и антителами, которые вырабатываются против них.
Антигены или иммуногены обычно представляют собой макромолекулы, которые содержат определенные антигенные сайты или эпитопы, узнаваемые различными компонентами иммунной системы и взаимодействующие с ними. Они могут существовать в виде отдельных молекул, представляющих собой синтетические органические вещества, белки, липопротеины, гликопротеины, РНК, ДНК или полисахариды, или они могут представлять собой часть клеточных структур (бактерии или грибки) или вирусов (Наг1оте апб Байе 1988а, Ь, с; Ма1е е! а1., 1987).
Малые молекулы, такие как короткие пептиды, несмотря на то что обычно способны реагировать с продуктами иммунного ответа, часто не могут вызвать ответ на себя самих. Эти пептидные иммуногены или гаптены, как их также называют, на самом деле являются неполными антигенами и, хотя не способны сами по себе вызвать иммуногенность или продуцирование антител, их можно сделать иммуногенными, связывая их с подходящим носителем. Носителями обычно являются более высокомолекулярные белковые антигены, способные вызывать иммунологический ответ при введении ίη νίνο.
При иммунном ответе антитела продуцируются и секретируются В-лимфоцитами вместе с Тхелперными (ТН) клетками. В большинстве систем гаптен-носитель В-клетки продуцируют антитела, специфические как к гаптену, так и к носителю. В этих случаях Т лимфоциты имеют домены специфического связывания на носителе, но не распознают один гаптен. Проявляя своего рода синергизм, В- и Тклетки кооперируются, индуцируя гаптен-специфический антительный ответ. Если после того как возникает такой иммунный ответ, хозяина заражают только гаптеном, обычно он отвечает, продуцируя гаптен-специфические антитела с помощью клеток памяти, образовавшихся после начальной иммунизации.
Синтетические гаптены, имитирующие некоторые важные эпитопные структуры на макромолекулах с более высокой молекулярной массой, часто конъюгируются с носителями, обеспечивая иммунный ответ на более высокомолекулярную родительскую молекулу. Например, короткие пептидные сегменты можно синтезировать из известных последовательностей белка и связать с носителем, чтобы индуцировать иммуногенность к нативному белку. Этот тип синтетического подхода к получению иммуногена стал основой многих современных исследований по созданию вакцин. Однако во многих случаях создание только лишь В-клеточного ответа с применением синтетических конъюгатов пептид-носитель, как бы ни был хорош их дизайн, не всегда является гарантией абсолютного защитного иммунитета к интактному антигену. Иммунного ответа, выработанного коротким пептидным эпитопом из вирусной частицы большего размера или бактериальной клетки, может быть достаточно только для того, чтобы формировать память на В-клеточном уровне. В этих случаях общепринято в настоящее время, что ответ цитотоксических Т-клеток является более важным показателем защитного иммунитета. Создание пептидных иммуногенов с подходящими эпитопными сайтами связывания для узнавания как В-клеток, так и Тклеток является одним из наиболее перспективных областей современной иммунологии.
Десятилетиями успешно применялся способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул конъюгацией этих молекул с большими молекулами носителей (см., например, ОоеЬе1 е! а1. (1939) 1. Ехр. Меб. 69: 53). Например, описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсулированные полимеры конъюгируют с белковыми носителями, образуя более эффективные композиции с использованием этого эффекта носителя (Зсйпеегкоп е! а1. (1984) 1пГес!. 1ттип. 45: 582591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у детей, иммунизированных свободным полисахаридом (Апбегаоп е! а1. (1985) 1. Реб1а!г. 107: 346; 1п§е1 е! а1. (1986) 1. Ехр. Меб. 158:294).
Конъюгаты гаптен-носитель успешно получали, используя различные сшивающие/связывающие реагенты, такие как сшивающие гомобифункциональные, гетеробифункциональные линкеры или сшивающие линкеры нулевой длины. В настоящее время имеются многие такие методы связывания сахаридов, белков и пептидов с пептидными носителями. В большинстве таких методов создают аминную, амидную, уретановую, изотиомочевинную или дисульфидную связи, или, в некоторых случаях, тиоэфирную. Недостатком применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты (реакционные центры) в боковые цепи реактивных аминокислотных молекул в молекулах носителя и/или гаптена, является то, что реактивные сайты, если они не нейтрализованы, свободны для реакции с нежелательной молекулой либо ш νίΙΐΌ (тем самым вредно влияя на стабильность конъюгата(ов)), либо ш νί\Ό (тем самым вызывая повышенный риск побочных явлений у людей или животных, иммунизированных этими препаратами). Такие избыточные реактивные сайты могут реагировать, или их можно кэпировать, так, чтобы инактивировать эти сайты, используя различные известные химические реакции, но, с другой стороны, эти реакции могут быть деструктивными для функциональности конъюгатов. Могут возникнуть особые сложности, когда пытаются создать конъюгат введением реактивных сайтов в молекулу носителя, так как более значительный размер и более сложная структура (по сравнению с гаптеном) могут сде- 1 012984 лать конъюгат более восприимчивым к разрушительному действию химической реакции. В действительности, неизвестны примеры способов получения конъюгата, когда сначала активируют носитель, затем его конъюгируют с гаптеном и, наконец, копируют остальные реактивные сайты, при этом сохраняя способность полученного конъюгата функционировать как иммуногенная композиция, имеющая заданные свойства эффекта носителя.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения иммуногенного конъюгата пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, в котором пептидный иммуноген конъюгирован с носителем за счет дериватизированных функциональных групп аминокислотных остатков носителей, таких как остатки лизина, а любые неконъюгированные дериватизированные функциональные группы аминокислотных остатков инактивируют копированием, блокируя их реакции с другими молекулами, включая белки/полипептиды, тем самым защищая функциональность носителя, так что он сохраняет способность вызывать заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, что в отсутствие носителя было бы невозможно. Кроме того, данное изобретение также относится к конъюгатам, полученным вышеописанными методами, и к иммуногенным композициям, содержащим такие конъюгаты.
В одном варианте настоящее изобретение относится к первому способу конъюгации пептидного иммуногена за счет реакции реакционноспособной (реактивной) группы аминокислотного остатка пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, причем данный способ включает стадии выделенной заявки:
(а) введение реактивной группы в аминокислотный остаток пептидного иммуногена;
(б) дериватизацию одной или более функциональных групп белкового носителя с образованием активированной функциональной группы на белковом носителе;
(в) реакцию пептидного иммуногена со стадии (а) с белковым носителем со стадии (б) в таких условиях, при которых образуется конъюгат, при этом реактивная группа пептидного иммуногена ковалентно присоединена к активированной функциональной группе белкового носителя; и (г) последующую реакцию конъюгата со стадии (в) с копирующим реагентом для инактивации оставшихся активированных функциональных групп на белковом носителе, с получением иммуногенного конъюгата и защитой функциональности носителя, так что он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ на пептидный иммуноген.
В одном варианте изобретения белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки, молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, ΡΑΝ-ΌΒ связывающего пептида (РАЙКЕ полипептида), сйситзрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВзАд19-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, бациллы Кальметта-Герена (ВСС), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 81гер1ососсиз рюдеиез ОКТ1224, 81гер1ососсиз рюдеиез ОКТ1664, 81гер1ососсиз рюдеиез ОКТ2452, СЫашуб1а рпеишошае ОКТ Т367, СЫашуб1а рпеишошае ОКТ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, компонентов, узнающих адгезивные матричные молекулы поверхности микробных клеток (М8СКАММ8), фактора/гормона роста, цитокинов и хемокинов.
В предпочтительном варианте изобретения белковый носитель представляет собой СКМ197.
В одном варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразиторного белка и эукариотического белка.
В другом варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из бактериального белкового антигена из 81гер1ососсиз рпеишошае, 81арйу1ососсиз аигеиз, 81арйу1ососсиз ер1бегш1б1з, №1ззепа шешидШбез, №1ззепа доиоггйеае, НаешорЬбиз шПиепхае. ЕзНепсЫа сой, К1еЬз1е11а еи1егоЬас1ег, Ыз1епа шопосуЮдепез, У1Ьпо сйо1егае, С1оз!пбшш регйидеиз, С1оз1пбшш Ьо1и1шит, вида Рзеиботопаз, 8а1шопе11а 1ур1нтигшт, ВоггеНа ЬигдбогГеп, 8Ыде11а Пехпегг 8Ыде11а Ьоубп, 8Ыде11а бузеШпае, АПоюоссиз оббб1з и группы В стрептококков.
В другом варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из белкового антигена вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, Н1У), вируса герпеса (Н8У), человеческого вируса папилломы, вируса парагриппа (Р1У), вируса везикулярного стоматита (У8У), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, К8У), вируса Эпстайна-Барр, коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (НСУ) и вируса гепатита В (НВУ).
Еще в одном варианте изобретения пептидный иммуноген представляет собой белковый антиген грибов, выбранный из вида Сапб1ба, вида Сгур1ососсиз, вида Сосс1бю1без, вида Н1з1ор1азша, вида АзрегдШиз.
В другом варианте изобретения пептидный иммуноген является белковым антигеном паразита, выбранного из плазмодия, трипаносом, шистосом и лейшмании.
В другом варианте изобретения пептидный иммуноген берут из белкового антигена эукариот. В предпочтительном варианте эукариот - это человек.
Еще в одном предпочтительном варианте изобретения пептидный иммуноген человеческого проис- 2 012984 хождения берут из злокачественной опухоли. В еще более предпочтительном варианте изобретения пептидный иммуноген является опухолевым антигеном почечно-клеточного рака, рака молочной железы, меланомы и рака простаты. В другом предпочтительном варианте изобретения пептидный антиген является опухолевым антигеном, карциноэмбриональным антигеном (КЭА, РЭА, СЕА).
В одном варианте изобретения функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового носителя дериватизирована с применением сшивающего реагента. Еще в одном варианте изобретения дериватизирующий реагент представляет собой галогенацетилирующий агент.
В предпочтительном варианте изобретения кэпирующий реагент, который используют для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, выбирают из группы реагентов, состоящих из цистеамина, Ν-ацетилцистеамина и этаноламина, из гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
В одном варианте изобретения стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой добавление аминокислотного остатка, имеющего реактивную группу. При этом аминокислотный остаток представляет собой цистеин, а реактивная группа содержит -8Н. или аргинин, с реактивной группой, содержащей гуанидильную группу, или глютамат или аспартат с реактивной группой, содержащей -СООН, или лизин с реактивной группой, содержащей -ΝΗ2.
Аминокислотный остаток может быть введен в пептидный иммуноген добавлением во время синтеза пептида.
В другом варианте изобретения стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой генерирование боковой тиольной группы у аминокислотного остатка путем его модификации при помощи тиолирующего реагента. При этом тиолирующий реагент представляет собой Νацетилгомоцистеин тиолактон, реагент Траута (2-иминотиолан), 8АТА (№сукцинимидил-8ацетилтиоацетат), 8МРТ (4-сукцинимидилоксикарбонилметил-2-пиридилтиотолуол), 8и1& ЬС 8ΡΌΡ (сульфосукцинимидил пиридилдитио пропион-амидогексаноат) и 8ΡΌΡ (сукцинимидилпиридил дитиопропионат).
В другом варианте изобретения одна или более функциональных групп расположены на линкере, который, необязательно (возможно), связан с белковым носителем. В предпочтительном варианте изобретения линкер представляет собой пептидный линкер, наиболее предпочтительной полилизин.
В другом аспекте изобретение относится к иммуногенному конъюгату, содержащему пептидный иммуноген, ковалентно связанный с белковым носителем, имеющим структуру (Χλη где С обозначает белковый носитель, а
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя и т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85.
Иммуногенный конъюгат имеет формулу где С обозначает белковый носитель, а
X0 обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя и
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
Р обозначает кэпирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя, п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
В одном варианте данное изобретение относится к иммуногенным конъюгатам, полученным способом в соответствии с настоящим изобретением и имеющим формулу
ОС-г-Р), где С обозначает белковый носитель, а
X0 обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя и
- 3 012984
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
В обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;
η обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
В другом аспекте изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим конъюгат пептидного иммуногена с белковым носителем, полученный способом по изобретению, вместе с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей и адъювантов.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. На схеме показан химический процесс, применяемый для конъюгации фрагментов Αβ пептида с белковым/полипептидным носителем СВМ197 с образованием конъюгата Ав/СВМ197.
Фиг. 2. На схеме показан процесс кислотного гидролиза, применяемый для количественного определения 8-карбоксиметилцистеина и 8-карбоксиметилцистеамина для оценки степени конъюгации конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид, таких как конъюгат Ав/СВМ197.
Фиг. 3. На этой фигуре изображена зависимость реакции конъюгации Αβ пептид/СВМ от рН.
Фиг. 4. На этой фигуре изображена зависимость конъюгации Αβ пептид/СВМ от соотношения пептид:СВМ.
Фиг. 5. Верификация процесса копирования при конъюгации Αβ-7/СВМ. Значение рН реакционной смеси в ходе реакции 9,15. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, копирование с помощью Νацетилцистеамина длится 8 ч.
Фиг. 6. Конъюгация и копирование при различных отношениях СВМ:пептид. рН реакционной смеси во время реакции 9,0. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, копирование с помощью Νацетилцистеамина длится 8 ч.
Фиг. 7. Титры сыворотки приматов на 36 день после иммунизации приматов конъюгатами Αβ пептида с различными адъювантами.
Фиг. 8. Титры сыворотки приматов на 64 день после иммунизации приматов конъюгатами Αβ пептида с различными адъювантами.
Фиг. 9. Титры сыворотки приматов по дням и по группам обработки. Приматов иммунизируют с помощью конъюгатов Αβ1-7 или Αβ1-5 СВМ197 с соединением алюминия или ВС529 в качестве адъювантов и титры антител против Αβ определяют на день 29, 36, 57 и 64.
Фиг. 10. Конъюгаты пептид-белок характеризуют с помощью 8Ό8-ΡΑ6Ε Вестерн-блоттинга с применением готового геля с трис-трицином. Дорожки (полоски): маркер (дорожка 1); Ь-28375 24/01 (дорожка 2); Ь-28375 24/02 (дорожка 3); Ь-28375 24/03 (дорожка 4); Ь-28375 24/04 (дорожка 5); Ь-28375 24/05 (дорожка 6); Ь-28375 24/06 (дорожка 7); Ь-28375 24/07 (дорожка 8); Ь-28375 24/08 (дорожка 9); Ь28375 24/09 (проверочный, мнимый, имитация) (дорожка 10) и ВгАсСВМ197 (дорожка 11).
Краткое описание последовательностей
8ЕС ГО ΝΟ Последовательность Описание
1 ОАЕРК-С ΑβΙ-5-С
2 ПАЕРВНО-С ΑβΙ-7-С
3 ϋΑΕΡΚΗΏεθ-С ΑβΙ-9-С
4 ОАЕРШГО56УЕУ-С ΑβΙ-12-С
5 ϋΑΕΕΚ-ΟΑΟΑ-С ΑβΙ-5-Ь-С
6 ОАЕЕИНВ-ОАОА-С ΑβΙ-7-ЬС
7 ЦАЕРИНЦКО-ОАСА-С ΑβΙ-9-Ь-С
8 ОАЕРИЮБСУЕУ-САСА-С ΑβΙ-12-Ь-С
9 УЕУОЗОНКГЕАЦ-С АР12-1-С
10 □АСА Линкерный пептид
11 ΡΚΥνκΟΝΤΕΚΓΑΤ Гемагглютинин гриппа: НА 547.319
12 АКХУ’ААУ/ТЬКААА Пептид ΡΑΝ- ϋΚ (ΡΑϋΚΕ пептид)
13 ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑδδνΕΝν Белок малярии С8: ТЗ эпитоп
14 РЕШГИГТ1 Поверхностный антиген гепатита В: НВ8Ай19. 2«
15 ООМСОЫАЕАМОКУСХЕС Белок теплового шока 65: Ь5рб5|5з_ ρι
16 βνΗΡβΡί-ρρΑννια. Бацилла Кальметта- Герена (ВСС)
17 ΟΥΙΚΑΝΧΚΡΙΟΠΈί Столбнячный токсоид: ТТазо-йдл
- 4 012984
18 РХКРТУЗЕЛ\ЪК\ТКУ5А8НЬЕ Столбнячный токсоид: ТТ^.^
19 КЦПЯМЗУЦЕУОКАМУ Н1У №120 ΤΙ
20 ОАЕРКНП-ОУГКАКЗКРЮГГЕЕ-С- ГККБТУ8РХУЬКУРКУ5А8НЬЕ-САЕРКНО
21 ΟΑΕΡΚΗΟδαΥΕνΗΗδΚΕνΡΡΑΕΟνΟδΝ ΚΟΑΗΟΕΜνΟΟννίΑ Αβ]-42
22 ПАЕЕКЕЮ9У1КА\ЗКЕ1СзПЪЕ ΑΝ90549: Αβ1_7/’Π ^ύ-«и (использ. в конфигурации МАР4)
23 ΟΑΕΙ'Κίΐυ]·’ΝΝ1τν51·ΛνΐΚνΡΚν8Α81ΪΪ.Ε ΑΝ90550: Αβι.7/ΤΪΜ7-967 (использ. в конфигурации МАР4)
24 ϋΑΕΡΚΗΟ- ΟΥ1Κ.ΑΝ5Κ1'Κ3ΙΤΕΕΕΝΝΚΓν8ΓνΕΚνΡΚ УЗАЗНЬЕ ΑΝ90542: Αβμγ/ΊΤ^ί,. 344+ ТТ947-967 (в линейной конфигурации)
25 ΕΕΚΉΟ5Ο-ρΥΙΚΑ№ΚΡΐαΠΈΕ ΑΝ90576: Αβιμ,/ΤΤ^μ (использ. в конфигурации МАР4)
26 .ΑΚΧνΑΛΧν'ΤΤ.ΚΑΛΑ-η.ΑΕΕΚΜΙ ΑΝ90562: Αβ,.,ΖΡΑϋΚΕ
27 ОАЕРХНП-ВАЕГКШЖАЕИ(НОАКХУААтЪКААА ΑΝ90543: Αβ,. 7 х 3/РАОКБ
28 ΑΚΧνΑΑΧνίΈΚΑΑΑ-ΒΑΕΓΚΗϋΟΑΕΕΚΗΟ-ϋΑΕΕΚΙΓϋ ΡΑΟΚΕ/Αβ,.,χ 3
29 ΟΑΕΕΚΗΟ-ΑΚΧνΑΑ\νΤΙΧΑ\Α Αβ,.-χ 3/РАОКЕ
30 ΏΑΕΡΒΗΟ-ΙδρΑνΉΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ АР|.7/фрагмеит альбумина
31 РКНОЗОУЛЗЦАУНАΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ Αβ4_ к/фрагмент альбумина
32 ΕΡΚΗΟδΟ-ΚΟΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΒ. Αβ3_ о/фрагмент альбумина
33 РКУУКрМТЬКЬАТ-ОАЕРКНООАЕЕЙНО-ОАЕРКНО НАзо7.з19/А₽].7 х 3
34 ΟΑΕΕΚΗΟ-ΡΚΥνΚΟΝΤΕΚΙΑΤ-ΟΑΕΡΚΗΟ Αβμ7/ΗΑ307_3]9/Αβ] _7
35 ΟΑΕΡΚΗΟ-ΟΑΕΡΚΗΟ-ΟΑΕΡΚΗΟ- ΡΚΥνΚΟΝΙΈΚ±ΑΓ Αβΐ-7 X 3/ НАзо7_319
36 ϋΑΕΡΙΜΟ-ΟΑΕΙΠ<Ε®ΤΚΥνΚ0ΝΙΈΚΕΑΤ Αβΐ-7 X 2/ НАз07_3!9
37 ΏΑΕΡΕΗΡΧΡΚΥνκρΝΤΕΚΕΑΤΕΚΚ1ΑΚΜΕΚ А 5 8 V ΕΝΓνΡΥΙΚΑΝ3ΚΡΙ6ΠΕΕΡΝΝΡΤνδΡΨΕκνΡκνδΑΞΗΕΕ-ΏΑΕΡΒΗΠ АЗ]_7/НА307.з]9/Ма1апа СЗ/По-ид/ ТТ?47-9б7^ Αβ|.7
38 ΟΑΕΡΚΗΟ-ΟΑΕΡΚΗΟ-ΏΑΕΡΚΗϋ- ЦУ1КА№КР1О1ТЕЬ-С- ΕΝΝΕΤν8Εννΐ3ί.νΡΚν8Α3ΗΕΕ Αβί-γ X 3/ГТвзо,844/С/ГТ947_9б7
39 ϋΑΕΓίυΉ-ρΥΙΚΑΝδΚΕΙΟΠΈΕ-Ε- ΡΝΚΕΤν5Ε\¥ΕΚνΡΚν5Α3ΗΕΕ Αβμγ/ΤΤ^.^/Ο/ΤΤ^.^
40 ΟΑΟϋννΏ88Κ8ΡνΜΕΝΡ88ΥΗΟΤΚΡΟΥ νη^ίρΚΟΙΟΚΡΚΞΟΤΟΟΝΥΟΟΓΛνΚΕΡΥ 8ΤΟΝΚΥϋΑΑΟΥ8νΐ>ΝΕΝΡΕ3σΚΑθανν К\ТУТО1ТК\ЕА1ЖУиКАЕ11ККЕЬСЕ8 ЕТЕРЬМЕрУСТЕЕНККРООСАЗКУУЬЗ ЬРРАЕбЗЗЗУЕУЕЧРЛУЕдАКАЬЗУЕЬЕМ ΡΕΙΚΟΚΚΟΟΟΑΜΥΕΥΜΑΟΑΟΑΟΝΚνΚ скмр197
- 5 012984
Г{5У0581.8СТМВ\УОУТКВКТКТК1Е81.К ΕΗΟΡΙΚΝΚΜ8Ε8ΡΝΚΤν8ΕΕΚΑΚ<2ΥΕΕΕ РНрТЛТЕНРЕЕХЕТКТУТОТЕДУРАОЛК ΥΑΑΨΑνΝνΑ0νΐΟ8ΕΤΑΒΝΕΕΚ.ΤΤΑΑΕ 31ЬРСг1С8УМС1АОСАУННХТЕЕ1УАр81 ЛТ.ЗЗЕМУЛрАП'Г.УОЕЕ.УПКгЕЛЛЛ’ХРУ Ε8ΠΝΕΡΰννΗΝ8ΥΝΚΡΑΥ8ΡΟΗΚΤςΡΓΕ Ш>ОУАУ8™ТУЕО8ПК.ТОР0ОЕ8ОНО1 КГТЛЕМРТ.Р1АОУ1.РРПРСЖЕОУЖ8К ТШ8УНСКК1КМВ.СКА1ВСВУТГСКРК8Р νΥνθΝθνΗΑΝΕΗνΑΕΗΕ.885ΕΚΙΗ3ΝΕΙ 8Ж8ЮУШУфКТУГ>НТКУЖКЕ8ЕРЕ'Е1 КЗ
41 ΙίφΑνΠΑΑΗΑΕΙΝΕΑακ Фрагмент альбумина
42 ϋΑΕΓΟΗϋ8<3ΓΕνΚΗ(^Κ£νΡΓΑΕθνθ8Ν ΚΟΑΠΟΕΜνΟΟννίΑ МЫШИНЫЙ Αβΐ-42
43 УРРАЕВУО-С Αβΐ8-25-Ο
44 ЬУГРАЕВУ-С Αβ]7-24·-£
45 КЬУРТАЕВ-С А₽16-23С
46 С-УРРАЕВУО ΟΑβ1&-25
47 С-ЕУРРАЕВУ Ό-Αβΐ7„24
48 С-КЬУРРАЕО С-Αβ,;.,,
49 УЕРАЕВУ-С Αβ 18-24-С
50 ЬУЕГАЕВ-С Αβΐ7-23 -С
51 КТУРРАЕ-С Αβΐ6.22-Ο
52 С-УРРАЕВУ €-Αβΐ8-24
53 С-ЕУГРАЕВ С-Αβ 17-23
54 С-КЬУЕРАЕ С-Ар1б_22
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов пептидный иммуногенноситель, в которых непрореагировавшие активные функциональные группы на носителе, образующиеся при активации, инактивируют, используя копирующие реагенты, такие как Ν-ацетилцистеамин, для того, чтобы предотвратить их последующие реакции. Настоящее изобретение относится также к конъюгатам копированный носитель-пептидный иммуноген, полученным этими способами, и к иммуногенным композициям, содержащим указанные конъюгаты.
Способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул, таких как сахариды, с использованием конъюгации успешно применялся десятилетиями (см., например, СоеЬе1 с1 а1., (1939) 1. Ехр. Меб. 69: 53), и описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсулированные полимеры конъюгированы с белками-носителями с целью получения более эффективных иммуногенных композиций с использованием этого эффекта носителя. Например, 8сйпеег5оп е1 а1. (1. Ехр. Меб. 152: 361-376, 1980) описывают конъюгаты НаеторЫйб тПиепхае Ь полисахарида с белком, которые наделяютиммунитетом к инвазивным заболеваниям, вызванным этими микроорганизмами. Показано, что конъюгаты РКР (полирибозилрибитолфосфат, капсулированный полимер Н. шПиеп/ае Ь) являются более эффективными, чем иммуногенные композиции на основе одного полисахарида (С1ш е1 а1., (1983) 1пГес1. 1ттип. 40: 245; §сйпеег8оп е! а1. (1984) 1пГес1. 1ттип. 45: 582-591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у детей, иммунизированных свободным полисахаридом (Лпбетзоп е! а1. (1985) 1. Реб1а1т. 107: 346; 1пзе1 е! а1. (1986) 1. Ехр. Меб. 158: 294).
Другим преимуществом применения в качестве белкового носителя бактериального токсина или токсоида, против которого обычная иммунизация людей (например, столбнячного или дифтерийного) является стандартной практикой, заключается в том, что заданный иммунитет к токсину или токсоиду индуцируется наряду с иммунитетом против патогенов, ассоциированных с капсулированным полимером.
Конъюгаты антигенная детерминанта/гаптен-носитель также использовались для получения высокоспецифических моноклональных антител, которые могут узнавать дискретные химические эпитопы на связанном гаптене. Полученные моноклональные антитела часто используют для изучения эпитопной структуры и взаимодействий между нативными белками. Во многих случаях антигенные детерминанты/гаптены, используемые для получения этих моноклональных антител, являются малыми пептидными сегментами, представляющими ключевые антигенные сайты на поверхности белков большего размера. Критериями для хороших (удачных) носителей, используемых при получении конъюгата антигенная детерминанта/гаптен-носитель, являются потенциал для иммуногенности, наличие функциональных групп, подходящих для конъюгации с антигенной детерминантой/гаптеном, достаточная растворимость даже после дериватизации и отсутствие токсичности ш угуо.
- 6 012984
Этим критериям отвечают конъюгаты, полученные способами по данному изобретению. Конъюгаты могут представлять собой любые стабильные конъюгаты пептидный иммуноген-носитель, полученный способом конъюгации по настоящему описанию. Конъюгаты получают, используя способ по настоящему изобретению, в котором белковый/полипептидный носитель, имеющий следующую структуру:
где С обозначает белковый/полипептидный носитель, а
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на белковом/полипептидном носителе или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, ковалентно связан с пептидным иммуногеном и где конъюгат пептидный иммуногенбелковый/полипептидный носитель представлен следующей формулой:
где С обозначает белковый/полипептидный носитель, а
Xй обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем,
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидньм носителем,
Я обозначает копирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем, тем самым защищается функциональность носителя, так что он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, иначе, без носителя, это было бы невозможно;
η обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
Выбор носителей.
Некоторые пептидные иммуногены содержат подходящий эпитоп для индуцирования иммунного ответа, но слишком малый для того, чтобы быть иммуногенным. В таком случае пептидные иммуногены связывают с подходящим носителем, что способствует выявлению иммунного ответа. В вышеприведенном схематическом изображении конъюгата пептидный иммуноген-носитель, получаемого способом по настоящему изобретению, С обозначает белковый/полипептидный носитель, с которым пептидные иммуногены конъюгируются непосредственно, за счет дериватизированных функциональных групп аминокислотных остатков на самих носителях, либо опосредованно, за счет дериватизированных функциональных групп на пептидных линкерах, ковалентно связанных с носителями. Подходящие белковые/полипептидные носители включают, но без ограничения, альбумин (включая человеческий сывороточный альбумин), гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулинов, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный токсоид (анатоксин) или токсоид других патогенных бактерий с пониженной токсичностью, включая мутанты, такой как дифтерийный, Е.соН, холерный или Н. ру1оп, или ослабленное производное токсина. Одним из таких носителей является белок СКМ197 (8ЕО ΙΌ N0: 40), перекрестно реактивный с дифтерийным токсином.
Другие носители включают Т-клеточные эпитопы, которые связываются с множественными МНС аллелями, например по меньшей степени с 75% всех человеческих МНС аллелей. Такие носители в уровне техники иногда называют универсальные Т-клеточные эпитопы. Типичные носители с универсальными Т-клеточными эпитопами включают
- 7 012984
Гемагглютинин гриппа: НАзот.л»
Пептид ΡΑΝ- РЕ (пептид РАЛКЕ)
С8 малярии: ТЗ эпитоп
Поверхностный антиген гепатита В: НВЛ^.гз
Белок теплового шока 65: Ьзр65из. щ
Бацилла Кальметта- Герена (ВСО)
Столбнячный токсоид: 1Т719. зл
Столбнячный токсоид: ТТ^-эет
ВИЧ&р120 Т1:
СКМ197
Фрагмент альбумина
РКУУКфЕЛЬКЛАТ (8Еф. ΙΓ1ΝΟ. 11)
АКХУААУГГЕКААА (8ЕО. 1ΠΝΟ. 12)
ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑ88νΤΝν (8Ер. ΙΟΝΟ. 13)
ЕЕЬГТКД-ΤΙ (8Ер. ГО ΝΟ. 14) фЗЮПЫАЕАМОКУСМЕО (8Е0- ГО ΝΟ. 15) рУНРОРТ-РРАУУКЬ (8ЕО· ГО ΝΟ. 16) ΦΥΙΚΑΝ8ΚΓΙΟΓΓΕΕ (8Е0. ГО ΝΟ. 17)
ΝΝΓΤν8ΙΑ\ΤΓ<\ΤΚν8Α8ΙΙΓΕ (5Ер. ЮЖ). 18)
ΚρίΙΝΜν/ρΕνσΚΑΜΥ (8Εφ.Π5ΝΟ. 19)
См. краткое описание последовательностей (8Е0. ГОКО. 40) ΙδφΑΥΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑακ.
(ЗЕф.ГОМО. 41)
Другие носители для стимулирования или повышения иммунного ответа, с которыми может конъюгироваться пептидный иммуноген или гаптен, включают цитокины, такие как 1Ь-1, 1Ь-1а и β пептиды, Ш-2, γΙΝΕ, 1Б-10, СМ-С8Е, и хемокины, такие как ΜΙΡ 1α и β и ΡΛΝΤΕ8. Иммуногенные пептиды могут также быть связаны с белковыми/пептидными носителями, которые повышают транспорт через ткани, как описано в О'Майопу, Международные заявки \ΥΘ 97/17163 и \ΥΘ 97/17614, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки во всей полноте для любых целей.
Другие носители включают 81гер1ососеа1 С5а пептидазу, 81гер1ососси5 рюдепек ΘΡΕ1224. 1664 и 2452, СЫашуФа рпеишошае ΘΕΕ Τ367 и Т858, факторы и гормоны роста.
В одном предпочтительном варианте настоящего изобретения белок-носитель представляет собой СРМ197, нетоксический мутант дифтерийного токсина с одной аминокислотной заменой в первичной последовательности. Глицин в аминокислотном положении 52 молекулы заменяется на глутаминовую кислоту в результате единичной замены нуклеотидного кодона. Вследствие этой замены белок не содержит ΆΌΡ-рибозилтрансферазной активности и становится нетоксическим. Его молекулярная масса составляет 58408 Да. СВМ19- получают в больших количествах при использовании рекомбинантной экспрессии в соответствии с патентом США 5614382, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Конъюгация сахаридов, а также пептидов с СВМ19- осуществляется путем связывания за счет εаминогрупп лизиновых остатков. На примере некоторых промышленных продуктов четко установлено, что СВМ19- является прекрасным и безопасным носителем для В-клеточных эпитопов.
Иммуногенные пептиды.
Применяемый в данном описании термин пептидный иммуноген или гаптен представляет собой любой белок или образованные из него субъединичную структуру/фрагмент/аналог, которые, при введении млекопитающему, могут выявлять иммунный ответ, способствовать иммунному ответу или индуцироваться, вызывая иммунный ответ. В частности, термин применяется для обозначения полипептидной антигенной детерминанты из любого источника (бактерий, вируса или эукариот), которая может связываться с носителем способом по данному описанию. Такие полипептидный иммуноген/антигенные детерминанты могут происходить из вирусных, бактериальных клеток и клеток млекопитающих.
Пептидные иммуногены из бактериальных клеток включают пептидные иммуногены, образованные из белков бактериальной клеточной поверхности или секретированных белков, которые можно использовать в белковых иммуногенных композициях. Типичные бактериальные штаммы включают 81гер1ососси8 аигеик, №188епа тешпдйгбек, НаеторШш шПиепгае, вид К1еЬ81е11а, вид Ркеиботопак, вид 8а1топе11а, вид 8Ыде11а, А11оюосси8 оШбк и группы В стрептококки.
Типичные пептидные иммуногены вирусного происхождения включают пептидные иммуногены из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, Ηΐν), вируса герпеса (Н8У), человеческого вируса папилломы НРУ), вируса парагриппа (Ρΐν), вируса везикулярного стоматита (νδν), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, Βδν), вируса Эпстайна-Барр (ΕΒν), коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (НСУ) и вируса гепатита В (ΗΒν).
Типичные пептидные иммуногены вирусного происхождения включают пептидные иммуногены из грибов, выбранные из СапФба а1Ысап8, Сгур1ососси§ пеоЕогтапк, вида Сосс1бю1бе8, вида НЬЮрквта и вида АкрегдШик. Антигены паразитов включают антигены из вида Плазмодия, вида Трипаносом, вида
Шистосом, вида Лейшмании и т.д.
Типичные пептидные иммуногены эукариот, которые можно конъюгировать с носителем для применения в качестве иммунотерапевтических средств для предупреждения, лечения или уменьшения ин- 8 012984 тенсивности различных заболеваний человека, включают пептидные иммуногены, образованные из Αβ пептида из 39-43 аминокислот, предпочтительно из 42 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера (АО) (см. патент США 4666829; С1еплег & \Уоп§ (1984) Вюсйет. БюрЬуз. Век. Соттип. 120: 1131; Нагбу (1984) ΤΙΝ8 20: 1131; Нагбу (197(9)7 ΤΙΝ8 20: 154), которые образуются из амилоидных пептидов амилина, полипептидного материала, продуцируемого островковыми клетками поджелудочной железы, непосредственно связанными с диабетом типа II, пептидов, образованных из генных продуктов липопротеинов низкой плотности, связанных с атеросклерозом, и антигенных пептидов из воспалительных цитокинов и факторов роста, таких как интерлейкин-6 (1Ь-6), фактор некроза опухолей α (ΤΝΡα) и СОР-8. Такие эукариотические пептидные иммуногены могут включать либо Т-клеточный (СТЬ, ЦТЛ), либо В-клеточный эпитоп.
СТЬ эпитоп представляет собой эпитоп, образованный из выбранных эпитопных областей, таких как антигены, ассоциированные с опухолями, включая, но без ограничения, антигены почечноклеточного рака, рака молочной железы, карциноэмбриональные антигены, антигены меланомы (МАСЕ) и специфические антигены рака простаты, такие как простат-специфический мембранный антиген (Р8МА) и поверхностный антиген стволовой клетки простаты (Р8СА), антигены гепатита С.
Ав, также известный как β-амилоидный пептид, или А4 пептид (см. патент США 4666829; С1еппег & \Уоп§. Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 120: 1131 (1984)), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Ав образуется при процессировании белка большего размера АРР под действием двух ферментов, называемых β- и γ-секретазами (см. Нагбу ΤΙΝ8 20: 154 (1997)). Известные мутации в АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, происходят близ (проксимально) к сайту расщепления β- или γ-секретазами или внутри Αβ. Например, положение 717 находится проксимально к сайту расщепления АРР γ-секретазой при его процессировании в Αβ, а положения 670/671 находятся проксимально к сайту расщепления βсекретазой. Полагают, что мутации вызывают АО путем взаимодействия в реакциях расщепления, в результате которых образуется Αβ, так что повышается количество 42/43 аминокислотной формы образующегося Аβ.
Αβ обладает необычным свойством, он может фиксировать и активировать как классические, так и альтернативные каскады комплемента. В частности, он связывается с С.'1с| и, в конечном счете, с С3Ы. Эта ассоциация способствует связыванию с макрофагами, приводя к активации В-клеток. Кроме того, С3Ы далее разрушается, а затем связывается с СВ2 на В-клетках в зависимости от Т-клеток, приводя к 10000кратному увеличению активации этих клеток. Этот механизм заставляет Αβ вырабатывать иммунный ответ в избытке этого или других антигенов.
Αβ имеет несколько природных форм. Человеческие формы Αβ обозначаются Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 и Αβ43. Последовательности этих пептидов и их связь с белком-предшественником АРР иллюстрируется на фиг. 1 в Нагбу е1 а1., ΤΙΝ8 20: 155-158 (1997). Например, Αβ42 имеет последовательность
Н2Х-А5р-Ма-С1и-РЬе-Аг£-Ыз-А5р-8сг-С1у-Туг-(Э111-Уа1-Н15Шз-С11ьЬу5-1ли-Уа1-РЬ^РЬе-Ма-СИи-АБр-Уа1-С1у-8ег-А811Ьу8-С1у-А1а-Це-Пе-С1у-Ьви-Ме1-У а1-С1у-С1у-У а1-Уа1-ПеΑ1»-ΟΗ(8ΕφΙΟΝ0.21}.
Αβ41, Αβ40 и Αβ39 отличаются от Αβ42 тем, что в них отсутствуют А1а, А1а-11е и А1а-11е-Уа1, соответственно, на С-конце. Αβ43 отличается от Αβ42 присутствием треонинового остатка на С-конце.
Пептидные иммуногены, которые представляют собой фрагменты Αβ, имеют преимущества по сравнению с интактной молекулой для применения в способах по настоящему изобретению по нескольким причинам. Во-первых, так как только определенные эпитопы внутри Αβ индуцируют иммуногенный ответ, полезный для лечения болезни Альцгеймера, доза фрагмента, содержащего такие эпитопы, дает более высокую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем равная по массе доза интактного Αβ. Во-вторых, некоторые пептидные иммуногены Αβ вызывают иммуногенный ответ против амилоидных отложений, не вызывая заметного иммуногенного ответа против белка АРР, из которого образован Αβ. В-третьих, пептидные иммуногены Αβ проще получать, чем интактный Αβ из-за их более короткой длины. В-четвертых, пептидные иммуногены Αβ не агрегируются таким же образом, что и интактный Αβ, это упрощает получение конъюгатов с носителями.
Некоторые пептидные иммуногены Αβ имеют последовательность по меньшей мере из 2, 3, 5, 6, 10 или 20 непрерывных аминокислот природного пептида. Некоторые пептидные иммуногены содержат не более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непрерывных остатков Αβ. В предпочтительном варианте изобретения пептидные иммуногены Ν-концевой половины Αβ используют для приготовления конъюгатов. Предпочтительные пептидные иммуногены включают Аβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение Аβ1-5, например, указывает на Ν-концевой фрагмент, включающий 1-5 аминокислотные остатки Αβ. Особенно предпочтительны фрагменты Αβ, начиная с Ν-конца и кончая остатком, входящим в остатки 7-11 Αβ. Фрагмент Аβ1-12 также может применяться, но он менее предпочтителен. В некоторых способах фраг
- 9 012984 мент представляет собой Ν-концевой фрагмент, иной, нежели Αβ1-10. Другие предпочтительные фрагменты включают Ав 13-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 и другие внутренние фрагменты и фрагменты на С-конце.
Некоторые Ав пептиды по изобретению являются иммуногенными пептидами, которые при введении их пациенту - человеку или животному - генерируют антитела, специфически связывающиеся с одним или более эпитопов между остатками 16 и 25 Ав. Предпочтительные фрагменты включают Ав16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24 и 18-25. Антитела, специфически связывающиеся с эпитопами между остатками 16 и 25, специфически связываются с растворимым Ав, не связываясь с бляшками Ав. Эти типы антитела могут специфически связываться с растворимым Ав в кровотоке пациента или животной модели, не связываясь специфически с бляшками из Ав отложений в мозге пациента или модели. Специфическое связывание антител с растворимым Ав ингибирует включение Ав в бляшки, тем самым ингибируя прогрессирование бляшек у пациента или ингибируя дальнейшее увеличение размера или частоты встречаемости бляшек, если такие бляшки уже появились до начала лечения (до введения препарата).
Предпочтительно во вводимом фрагменте Ав отсутствует эпитоп, который вызывает Т-клеточный ответ на фрагмент. Обычно Т-клеточные эпитопы по размеру протяженнее, чем 10 непрерывных аминокислот. Поэтому размер предпочтительных фрагментов Ав составляет 5-10, или более предпочтительно 7-10 непрерывных аминокислот, или наиболее предпочтительно 7 непрерывных аминокислот; т.е. достаточная протяженность, чтобы вызвать антительный ответ, не вызывая Т-клеточный ответ. Отсутствие Тклеточных эпитопов является предпочтительным, так как эти эпитопы не нужны для иммуногенной активности фрагментов и могут вызвать нежелательный воспалительный ответ в субпопуляции пациентов (Апбегаоп е! а1., (2002) 1. 1ттипо1. 168, 3697-3701; 8ешог (2002) Ьапсе! №иго1. 1, 3).
Фрагмент Ав15-25 и его субфрагменты из 7-8 непрерывных аминокислот являются предпочтительными, так как эти пептиды постоянно генерируют (вырабатывают) высокий иммуногенный ответ на Ав пептид. Эти фрагменты включают Ав16-22, Ав16-23, Ав16-24, Ав17-23, Ав17-24, Ав18-24 и Ав18-25. Особенно предпочтительные субфрагменты Ав15-25 имеют протяженность 7 непрерывных аминокислот. Обозначение Ав 15-21, например, показывает, что фрагмент включает остатки 15-21 Ав и не содержит других остатков Ав и предпочтительно содержит 7-10 непрерывных аминокислот. Эти фрагменты могут вырабатывать антительный ответ, который включает антитела, специфические к концу.
Пептидные иммуногены Ав требуют скрининга на активность клиринга или предупреждения амилоидных отложений (см. Международную заявку XVО 00/72880). Введение Ν-концевых фрагментов Ав индуцирует продуцирование антител, которые узнают Ав отложения ίη νίνο и ίη νίΐτο. В некоторых способах применяются фрагменты, в которых отсутствует по меньшей мере один, а иногда по меньшей мере 5 или 10 С-концевых аминокислот, имеющихся в природных формах Ав. Например, фрагмент, в котором отсутствуют 5 С-концевых аминокислот Ав43, включает первые Ν-концевые 38 аминокислот Ав.
Если не указано иначе, ссылка на Ав включает природные человеческие аминокислотные последовательности, указанные выше, а также аналоги, включая аллельные, видовые и осуществляемые (индуцируемые) варианты. Аналоги обычно отличаются от природных пептидов в одном, двух или нескольких положениях, часто за счет консервативных замен. Обычно аналоги имеют последовательности, на 80 или 90% идентичные последовательностям природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Ν- или С-концевых аминокислот в одном, двух или нескольких положениях. Например, остаток природной аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 Ав может быть замещен изоаспарагиновой кислотой.
Примерами неприродных аминокислот являются Ό, альфа, альфа-дизамещенные аминокислоты, Νалкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ипсилон-Ν,Ν,Νтриметиллизин, ипсилон-Ы-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3метилгистидин, 5-гидроксилизин, омега-Н-метиларгинин, в-аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, гамма-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота. Иммуногенные пептиды также включают аналоги Ав и их фрагменты. Некоторые терапевтические агенты по изобретению представляют собой полностью-Ό пептиды, например полностью-Ό Ав, полностью-Ό Ав фрагмент, или аналоги полностью-Ό Ав или полностью-Ό Ав фрагмента. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на профилактическую или терапевтическую эффективность на трансгенных животных моделях по сравнению с непролеченными или плацебо-контрольными животными, как описано в Международной заявке νθ 00/72880.
Пептидные иммуногены охватывают также более длинные полипептиды, которые включают, например, иммуногенный участок Ав пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные иммуногенные пептиды включают составные (химерные, гибридные) белки, содержащие сегмент Ав, связанный с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Тхелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, тем самым, Вклеточный ответ против сегмента Ав. Такие полипептиды можно подвергать скринингу на профилактическую или терапевтическую эффективность на трансгенных животных моделях по сравнению с непро
- 10 012984 леченными или плацебо-контрольными животными, как описано в Международной заявке АО 00/72880.
Αβ пептид, аналог, иммуногенный фрагмент или другой полипептид можно вводить в дезагрегированной или агрегированной форме. Дезагрегированный Ав или его фрагменты означают мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный Ав или его фрагменты обычно являются растворимыми и способны к самоагрегации с образованием растворимых олигомеров, протофибрилл и ΑΌΌΕ. Олигомеры Ав и их фрагменты обычно являются растворимыми и существуют преимущественно в виде альфаспиралей или случайных спиралей. Агрегированный Ав или его фрагменты означают олигомеры Ав или их фрагменты, которые ассоциированы в нерастворимые ансамбли в виде бета-складок. Агрегированный Ав или его фрагменты также означают фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связывают либо растворимый Ав или его фрагменты, либо агрегированный Ав или его фрагменты. Некоторые антитела связывают как растворимый Ав или его фрагменты, так и агрегированный Ав или его фрагменты.
Иммуногенные пептиды также включают мультимеры мономерных иммуногенных пептидов. Иммуногенные пептиды, отличные от Ав пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов Ав (например, Ав1-3, 1-7, 1-10 и 37).
Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению связываются с носителем по способу по настоящему изобретению с образованием конъюгата. Иммуногенный пептид может связываться по своему аминоконцу, по своему карбоксильному концу или по обоим концам с носителем с образованием конъюгата. Необязательно, в конъюгате могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида.
Ν-концевой фрагмент Ав может связываться по своему С-концу с пептидом-носителем с образованием конъюгата. В таких конъюгатах Ν-концевой остаток фрагмента Ав является Ν-концевым остатком конъюгата. Соответственно, такие конъюгаты эффективно индуцируют антитела, связывающиеся с эпитопом, которому требуется свободный Ν-концевой остаток Ав. Некоторые иммуногенные пептиды по изобретению содержат множество повторов Ν-концевого сегмента Ав, связанного на С-конце с одной или более копий пептида-носителя с образованием конъюгата. Ν-концевой фрагмент Ав, включенный в такие конъюгаты, иногда начинается Ав1-3 и заканчивается Ав7-11, Ав1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 являются предпочтительными Ν-концевыми фрагментами Ав. Некоторые конъюгаты содержат отличающиеся Νконцевые Ав в тандеме (связанные последовательно). Например, конъюгат может содержать Ав 1-7 с последующим Ав1-3, связанным с носителем.
В некоторых конъюгатах Ν-концевой сегмент Ав связан по своему Ν-концу с носителем-пептидом. Можно использовать такое же множество Ν-концевых сегментов Ав, как и в случае С-концевого связывания. Некоторые конъюгаты содержат пептидный носитель, связанный с Ν-концом Ν-концевого сегмента Ав, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительных Ν-концевых сегментов Ав в тандем (связанные последовательно). Предпочтительно такие иммуногенные Ав фрагменты, будучи связаны с подходящим носителем, индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на определенный Ав фрагмент, не будучи направлен на другие фрагменты Ав.
Иммуногенные пептиды по изобретению включают иммуногенные гетерологичные пептиды. В некоторых иммуногенных пептидах Ав фрагмент связан с носителем с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Этот гетерологичный пептид связывается с носителем с применением способа по данному изобретению с образованием конъюгата. Некоторые из таких иммуногенных гетерологичных пептидов содержат фрагменты Ав, связанные с эпитопами столбнячного токсоида, такими как описанные в патенте США 5196512, Европейских патентах ЕР378881 и ЕР427347. Необязательно, иммуногенный пептид может быть связан с одной или множеством копий носителя, например, как по Ν-, так и по С-концу носителя, с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Другие такие иммуногенные гетерологичные пептиды содержат фрагменты Ав, связанные с носителями-пептидами, описанными в патенте США 5736142. Например, иммуногенный гетерологичный пептид может содержать Ав1-7, связанный с последующим Ав1-3, связанный с последующим носителем. Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают
- 11 012984
Αβ 1- 7/Столбнячный токсоид 830- 844 + 947- 967 в линейной конфигурации
ЛАЕРКНЛ- ОУ1КА№КГЮГГЕЬРЯМРТУ5Р^ЬВ.УРКУ5А5НЬЕ (8Е(2 ГО ΝΟ.:24)
Пептиды, описанные в патенте США 5736142 (все в линейной конфигурации):
РАЛКЕ/Αβΐ- 7:
АКХУААЗУТЬКААА- ЛАЕРКНЛ (ЗЕр ГО ΝΟ.:26)
Αβί- 7 х 3/РАЛКЕ:
ЛА ЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- АКХVААЗУТЬКААА (ЗЕГ) ПЭ N0. :27)
Р АЛЕЕ/Αβί- 7 х 3:
АКХУААЗУТЬКААА- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ (ЗЕр ГО ΝΟ.:28)
Αβί- 7/ РАЛ КЕ:
ЛАЕРКНЛ- АКХУААЗУТЬКААА (ЗЕр ГО ΝΟ.:29)
Αβί - 7/фрагмент альбумина:
ЛАЕРКНЛ- ΙδρΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕр ГО ΝΟ.:30)
Αβ4- 10/фрагмент альбумина:
ΡΚΗΠ8ΟΥ- 18ΡΑ\ΉΑΑΗ ΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕР ГО ΝΟ.:31)
Αβ3- 9/ фрагмент альбумина:
ЕРКНЛ86- 18рАУНААНАЕШЕАОК (ЗЕр ГО ΝΟ.:32)
ΗΑ307,3ΐ9/Αβι-7χ3:
РКУУКрНТЕКЕАТ- ОАЕРР.НЛ- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ (ЗЕр ГО ΝΟ.:33)
Αβι.7/ΗΑ3ο7_3ΐ9/ Αβι. 7:
ЛАЕРКНЛ- ΡΚΥνκρΝΊΈΚΕΑΤ- ЛАЕРКНЛ (ЗЕр ГО ΝΟ.:34)
Αβι.γΧ З/НА307.319:
ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- РКУУКрЕГГЕКЬАТ (ЗЕр ГО ΝΟ.:35)
Αβ1-7Χ 2/НА307.319:
ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ΡΚΥνΚρΝΤΕΚΕΛΤ (ЗЕр ГО ΝΟ.:36)
АР1.7/НАзо7.з|9/Малярии СЗ/ТТвзо-844/1 Г947-9б7/ Αβι-7
ЛАЕРКНЛ- РКУУКРШЪКЕАТ- ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑ55νΡΝνрУ1КА№КРЮ1ТЕЬ- РХПРТУЗРУ'Г.КУРКУЗАЗНЕЕ- ЛАВГКНЛ (ЗЕр ГО
ΝΟ.:37)
Αβμ 7хЗ/ ТТио. 844ΛΓΤ947. 767
ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ЛАЕРКНЛ- ΡΥΙΚΑΝ3ΚΡΙΟΠΈΕ- СΡΝΝΡΤν8Ρ3¥ΕΚλΠ>Κν8Α8ΗΕΕ (ЗЕр 1Л ΝΟ.:38)
Αβ|. 7/ТТ830. 844/С/ТТ947. 967
ЛАЕРКНЛ- рУ1КА№КРЮ1ТЕЬ- С- ΡΝΝΡΤν8Ρ3¥ΕΚνΡΚ.ν8Α5ΗΕΕ (ЗЕр ГО
ΝΟ.:39)
Αβί- ,/ТТио- 844/С/ТТ947. 967/Αβΐ- 7
ЛАЕРКНЛ- ΡΥΙΚΑΝ8ΚΡΚ3ΓΓΕΕ- С- ΡΝΝΡΤν8Ρν/ΕΚνΡΚ.ν3Α3ΗΕΕЛАЕРКНЛ (ЗЕр ГО ΝΟ. 20)
- 12 012984
Некоторые иммуногенные гетерологичные пептиды содержат мультимер иммуногенных пептидов, представленных формулой 2х, в которой х обозначает целое число от 1 до 5. Предпочтительно х обозначает 1, 2 или 3, причем 2 является предпочтительным. Когда х равно 2, такой мультимер содержит четыре иммуногенных пептида, связанных в предпочтительной конфигурации, называемой МАР4 (МАП4, см. патент США 5229490). Такие иммуногенные пептиды затем связываются с носителем способом по настоящему изобретению с образованием конъюгата.
Конфигурация МАР4 показана ниже, где разветвленные структуры получают, инициируя пептидный синтез как по Ν-концевой аминогруппе, так и по аминогруппе боковой цепи лизина. В зависимости от того, сколько раз лизиновые остатки включаются в последовательность и имеют возможность разветвляться, в конечной структуре присутствуют множественные Ν-концы. В данном примере четыре идентичных Ν-конца дают разветвленное лизинсодержащее ядро. Такая мультиплетность значительно повышает отвечаемость родственных В клеток
Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают
Αβ 1- 7/Столбнячный токсоид 830-844 в конфигурации МАР4:
ϋΑΕΡΚΗΟ- ф¥1КА№КРЮ1ТЕЬ (8ЕЦ ГО ΝΟ.:22)
Αβ 1- 7/Столбнячный токсоид 947- 967 в конфигурации МАР4:
ОАЕРКЕГО- ΓΝΚΤΤν8Γ\νΕΚνΡΚνί5Α8ΗΙΈ (8Εζ> ГО ΝΟ.:23)
Αβ 3- 9/Столбнячный токсоид 830- 844 в конфигурации МАР4:
ЕРКЕГО8С- ΡΥΙΚΑΝ8ΚΡΚΉΤΕΕ (8 ЕС) ГО ΝΟ.:25)
ОАЕРКНП- ςΥΙΚΑΝδΚΡίαΐΤΕΕ на 2х- разветвлённой смоле
Пептид
Пептид
Еуз-О1у-Суз
Ав пептид, аналог, активный фрагмент или другой полипептид можно вводить в ассоциированной или в мультимерной форме или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры или мономерные иммуногенные агенты. Агенты, отличные от Ав пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов Ав (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7) и могут также конъюгироваться с носителем способом по настоящему изобретению. Предпочтительно такие агенты, конъюгированные с подходящим носителем, индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на один из этих фрагментов, не будучи направлен на другие фрагменты Ав. Для того чтобы облегчить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, к концам антигенных детерминант могут быть добавлены дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или Ν-конце пептидного иммуногена. Кроме того, можно также ввести пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо этого антигенные детерминанты могут отличаться от природной последовательности, будучи модифицированы ацилированием концевой ПН2-группы, например, алканоил- или тиогликолилацилированием (ацилирование алкановыми (С1-С20) кислотами или тиогликолевой кислотой), амидированием по карбоксиконцу, например, аммиаком, метиламином и т. д. В некоторых примерах эти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой.
Пептидные иммуногены, используемые для получения конъюгатов по настоящему изобретению способом по данному описанию, можно объединять, связывая с образованием полимеров (мультимеров), или из них можно готовить композиции без связывания, в виде смеси. Если пептид связан с идентичным пептидом, тем самым образуя гомополимер, то присутствует множество повторяющихся эпитопных единиц. Например, метод множественных антигенных пептидов (МАП, МАР) применяют для конструирования полимеров, содержащих как СТЬ эпитоп, так и/или пептиды антител и пептиды. Когда пептиды различаются, например, смесь, представляющая различные вирусные субтипы, различные эпитопы внутри субтипа, различные специфичности рестрикции ГКГ (НЬА) или пептиды, которые содержат Тхелперные эпитопы, получают гетерополимеры с повторяющимися единицами. Помимо ковалентного связывания также рассматривается нековалентное связывание, с помощью которого могут образоваться межмолекулярные и внутриструктурные связи.
- 13 012984
Такие пептидные иммуногены и их аналоги синтезируют твердофазным пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией, или получают из природных источников. Автоматические пептидные синтезаторы можно получить от многих поставщиков, таких как АррБеб ВюкуЦетк. Еойег Сйу. СайГогша.
Рекомбинантная экспрессия может осуществляться в бактериальных клетках (таких как Е.еой). клетках дрожжей. насекомых или млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны в 8атЬгоок е! а1.. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк. ΝΥ. 2пб еб.. 1989). Некоторые иммуногенные пептиды также выпускаются промышленно (например. Атепсап Рерббе Сотрапу. 1пс.. 8иппууа1е. СА. и Са11Гогша Рерббе Векеагсй. 1пс.. №ра. СА).
Можно также провести скрининг библиотек случайный пептидов или других соединений на пригодность их в качестве пептидных иммуногенов. Комбинаторные библиотеки можно создать для многих типов соединений. которые можно синтезировать постадийно. Такие соединения включают полипептиды. миметики бета-поворотов. гормоны. олигомерные Ν-замещенные глицины и олигокарбаматы и т.п. Большие комбинаторные библиотеки соединений можно создавать методом кодированных синтетических библиотек (Е8Ь). описанным в Международных заявках ГСО 95/12608. ГСО 93/06121. ГСО 94/08051. ГСО 95/35503 и ГСО 95/30642. Пептидные библиотеки можно также получать методами фагового дисплея (см.. например. Эеу1т. ГСО 91/18980).
Дериватизация и конъюгация иммуногенного пептида с белком-носителем.
Сайт соединения пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем и природа сшивающего агента. который используется для связывания пептидного иммуногена с носителем - оба фактора являются важными для специфичности полученного в результате антитела против него. Для корректного узнавания пептидный иммуноген должен быть связан с носителем в соответствующей ориентации. Для того чтобы антитело узнало затем свободные пептидные иммуногены без носителя. конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель должен презентировать пептидные иммуногены в экспонированной и доступной форме. Оптимальная ориентация часто достигается при направлении реакции сшивания на специфические сайты на пептидных иммуногенах. Один способ для пептидного иммуногена достигнуть этого заключается в присоединении конечного цистеинового остатка в процессе пептидного синтеза. Это создает на одном конце пептида сульфгидрильную группу для конъюгации с носителем. Сшивание (перекрестное связывание) с использованием этой группы обеспечивает присоединение пептидного иммуногена только на одном конце. тем самым гарантируя постоянную ориентацию.
При конъюгации пептидный иммуноген-носитель целью является не сохранение исходного (нативного) состояния или устойчивости носителя. а презентация гаптена наилучшим возможным образом для иммунной системы. При достижении этой цели выбор химического метода конъюгации может регулировать полученный титр и специфичность антител. полученных против гаптена. В некоторых случаях может быть важно выбрать сшивающий агент. содержащий спейсерную ножку. достаточно длинную для презентации антигена в нерестриктированной форме. Также может быть важно контролировать плотность пептидного иммуногена на поверхности носителя. Слишком маленькая замена в пептидном иммуногене может привести к малому ответу или к отсутствию ответа. Слишком высокая плотность пептидного иммуногена в действительности может вызвать иммунологическую супрессию и снижение ответа. Кроме того. сам сшивающий агент может вызывать нежелательный иммунный ответ. Это необходимо принимать во внимание при выборе не только подходящих сшивающих реагентов. но также соответствующих соотношений белкового/полипептидного носителя и пептидного иммуногена.
Возможны различные способы связывания беловых/пептидных носителей с пептидными иммуногенами. Ионные взаимодействия возможны по концевым группам или по ε-аминогруппе лизина. Также возможно образование водородной связи между боковыми группами остатков и пептидным иммуногеном. Наконец. конформационные взаимодействия между белковыми/пептидными носителями и иммуногенным пептидом могут привести к стабильному связыванию.
Конъюгаты пептидные иммуногены-носитель успешно получают. используя различные сшивающие реагенты. такие как нулевой длины. гомобифункциональные или гетеробифункциональные кросслинкеры (сшивающие реагенты). Наименьшие доступные реагирующие системы для биоконъюгации представляют собой так называемые кросс-линкеры нулевой длины. Эти соединения опосредуют конъюгацию двух молекул. образующих связь. не содержащую дополнительных атомов. Таким образом. один атом молекулы является спейсером. Во многих схемах конъюгации конечный комплекс связывается вместе с помощью химических компонентов. которые при сшивании вносят чужеродные структуры в вещества. В некоторых применениях присутствие этих промежуточных линкеров может быть вредным для предполагаемого применения. Например. при приготовлении конъюгатов пептидный иммуногенноситель образуется комплекс. предполагаемый для генерации иммунного ответа на присоединенный гаптен. Иногда (случайно) участок антител. продуцированных этим ответом. может иметь специфичность к сшивающему агенту (кросс-линкеру). применяемому при конъюгации. Сшивающие агенты (кросс-линкеры) нулевой длины исключают возможность такого типа кросс-реактивности (перекрестной реактивности). опосредуя прямое связывание двух веществ.
Гомобифункциональные реагенты. которые были первыми сшивающими (перекрестно связывающими) реагентами. применяемыми для модификации и конъюгации макромолекул. состояли из биреак- 14 012984 тивных соединений, содержащих по обоим концам одну и ту же функциональную группу (Нат!тап апб ХУоН, 1966). Эти реагенты могут связывать один белок с другим, связываясь ковалентной связью с одинаковыми общими группами в обеих молекулах. Так, ε-аминогруппы лизина или Ν-концевые аминогруппы одного белка могут сшиваться (перекрестно связываться) с одинаковыми функциональными группами на втором белке просто при их смешении в присутствии гомобифункционального реагента.
Гетеробифункциональные реагенты для конъюгации содержат две различные реакционноспособные (реактивные) группы, которые могут связываться с двумя различными функциональными мишенями на белках и других макромолекулах. Например, один участок кросс-линкера может содержать аминореактивную группу, тогда как другой участок может состоять из сульфгидрил-реактивной группы. Результатом является способность направлять реакцию сшивания на выбранные участки целевых молекул, тем самым лучше осуществляется контроль над процессом конъюгации.
Гетеробифункциональные реагенты используют для сшивания (перекрестного связывания) белков и других молекул в двух- или трехстадийном процессе, который ограничивает степень полимеризации, часто достигаемую при использовании гомобифункциональных кросс-линкеров.
В настоящее время имеется множество методов связывания пептидных иммуногенов с белковыми/полипептидными носителями с помощью кросс-линкеров нулевой длины, гомобифункциональных или гетеробифункциональных кросс-линкеров. С помощью большинства методов создают аминные, амидные, уретановые, тиоизомочевино или дисульфидные связи, или, в некоторых случаях, тиоэфирные связи. В более общем методе связывания белков используются бифункциональные сшивающие реагенты. Они представляют собой малые спейсерные молекулы, содержащие на каждом конце активные группы. Спейсерные молекулы могут иметь идентичные или различные активные группы на каждом конце. Наиболее обычные активные функциональности, связывающие группы и образующиеся связи представлены ниже.
1. Альдегид - амино —> вторичный амин
2. Малеинимидо - сульфгидрил -> тиоэфир
3. Сукцинимидо — амино —>амин
4. Имидат (иминоэфир) — амино —>- амид
5. Фенилазиды - амино -»фениламин
6. Ацилгалогенид — сульфгидрил —>тиоэфир
7. Пиридилсульфиды - сульфгидрил дисульфид
8. Изотиоцианат - амино —>изотиомочевина
Реактивность данного белка-носителя, с точки зрения его способности модифицироваться сшивающим агентом таким образом, чтобы конъюгироваться с пептидным иммуногеном, определяется аминокислотным составом и локализацией в последовательности отдельных аминокислот в трехмерной структуре молекулы, а также аминокислотным составом пептидного иммуногена.
Для линкеров (Ь) между белковыми/пептидными носителями и другими пептидами (например, между белковыми/пептидными носителями и пептидным иммуногеном) спейсеры обычно выбирают из А1а, С1у или других нейтральных спейсеров из неполярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. В некоторых вариантах изобретения нейтральный спейсер представляет собой А1а. Следует понимать, что возможно присутствующий спейсер не обязательно состоит из одинаковых остатков и, следовательно, может быть гетеро- или гомоолигомером. Типичные спейсеры включают гомоолигомеры А1а. В случае присутствия спейсера он обычно состоит по меньшей мере из двух остатков, более обычно из трех-шести остатков. В других вариантах изобретения белковый/полипептидный носитель конъюгируется с пептидным иммуногеном, предпочтительно с белковым/пептидным носителем, позиционированным на аминоконце. Пептид может соединяться нейтральным линкером, таким как А1а-А1а-А1а или подобным ему, и предпочтительно содержит липидный остаток, такой как остаток пальмитиновой кислоты или т.п., который связан с альфа- или ипсилон-аминогруппами Ьу5 остатка ((РАМ)2Ьу5), связанного с аминоконцом пептидного конъюгата, как правило, 8ет-8ет связью или т.п.
В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Αβ фрагмент, выбранный из группы, состоящей из ΑβΙ-5-Ь, ΑβΙ-7-Ь, ΑβΙ-9-Ь и ΑβΙ-12-Ь. В некоторых аспектах изобретения линкер представляет собой 6А6А (8Е0 ΙΌ N0: 10).
Для того чтобы упростить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, можно по концам антигенных детерминант добавить дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или Ν-конце пептидного иммуногена. Кроме того, можно также вводить пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо этого, антигенные детерминанты могут отличаться от природной последовательности модификацией концевой NН2-группы ацилированием, на
- 15 012984 пример ацилированием с помощью (С1-С20)алкановой или тиогликолевой кислот, амидированием по карбоксиконцу, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых примерах эти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой.
В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Ав фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Ав1-5-С, Αβ1-7-Ο, Ав1-9-С и Ав1-12-С, где С представляет собой цистеиновый аминокислотный остаток. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой Ав фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Ав1-5-Ь-С, Ав1-7-Ь-С, Ав1-9-Ь-С и Ав112-Ь-С.
Пептидный иммуноген связан с белковым/пептидным носителем либо непосредственно, либо через линкер либо по амино- или по карбоксиконцу пептидного иммуногена. Аминоконец либо пептидного иммуногена, либо белкового/пептидного носителя может быть ацилированным. Кроме того, конъюгат пептидный иммуноген-белковый/пептидный носитель может быть связан с некоторыми алканоил (С1С20) липидами через один или более связывающих остатков, таких как С1у. С1у-С1у. 8ег, 8ег-8ег, как описано ниже. Другие применяемые липиды включают холестерин, жирные кислоты и т. п.
Пептидные иммуногены могут связываться с носителем химическим сшиванием. Методы связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с помощью Ν-сукцинимидил3-(2-пиридилтио)пропионата (8ΡΌΡ) (Сагккоп, 1. е! а1. (1978) Вюсйет 1., 173: 723) и сукцинимидил 4-(Νмалеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС) (если пептид не содержит сульфгидрильную группу, ее можно ввести добавлением цистеинового остатка к гаптену). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между ними и пептидным цистеином, расположенным на одном белке, и амидную связь за счет ε-аминогруппы лизина или другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Различные такие дисульфид/амид-образующие агенты описаны в 1ттипо. Вег. 62: 85 (1982). Другие бифункциональные связывающие агенты образуют скорее тиоэфирную, нежели дисульфидную связь. Агенты, образующие тиоэфир, включают реакционноспособный эфир 6-малеинимидкапроновой кислоты, 2бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-Щ-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активировать, объединяя их с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты.
Лизиновые остатки являются наиболее распространенными аминокислотными остатками на белкахносителях, и эти остатки модифицируют с помощью сшивающих реагентов для получения нуклеофильных сайтов, которые затем связывают с гаптеном. Это соединение проводят за счет любых химически активных гидрофильных боковых цепей на молекулах гаптена. Такие химические активные боковые группы включают гуанидильную группу аргинина, карбоксильные группы глутамата и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильную группу цистеина и ε-аминогруппу лизина, еще некоторые. Модификацию белка таким образом, чтобы они в конечном счете могли связываться с другими частицами, проводят, сшивая реагенты, которые реагируют с любой из боковых цепей молекул белка-носителя или гаптена.
В одном аспекте настоящего изобретения белок-носитель с молекулой линкера или без нее функционализируют (или дериватизируют) реагентом, который вводит реактивные сайты в молекулу белканосителя, способные к дальнейшей модификации с введением нуклеофильных групп. В одном варианте изобретения носитель реагирует с галогенацетилирующим реагентом, который предпочтительно реагирует с рядом функциональных групп на аминокислотных остатках белков, такими как сульфгидрильная группа цистеина, первичная ε-аминогруппа лизинового остатка, а конец α-аминов, тиоэфир метионина и оба азота имидазолильной боковой цепи гистидина (Сигб, 1967). В предпочтительном варианте изобретения первичные ε-аминогруппы лизиновых остатков белка-носителя дериватизируют с помощью Νгидроксисукцинимидил бромацетата с целью получения бромацетилированного носителя. Конъюгацию пептидного иммуногена и активированного белка-носителя проводят, медленно добавляя активированный носитель к раствору, содержащему пептидный иммуноген.
Применяя способ по данному изобретению можно конъюгировать пептидные иммуногены, обсуждавшиеся выше, с любыми носителями, обсуждавшимися выше. Конъюгаты, получающиеся по способу по данному изобретению, используются в качестве иммуногенов для получения антител против Ав с целью применения их в пассивной/активной иммунотерапии. Кроме того, Ав или Ав фрагмент, связанный с носителем, можно вводить лабораторным животным при получении моноклональных антител к Ав.
В одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из Ав1-7-СКМ197, (Ав1-7х3)-СКМ197 и (Ав1-7х5)-СВМ197. В одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из СКМ197-Ав1-5, СВМ197-Ав1-7, СК.М|9,--Ав 1-9 и СВМ197-Ав1-12. В другом аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из Ав1-5-С-СКМ197, Ав1-7-С-СВМ197, Ав1-9-С-СК.М19,- и Ав1-12-ССВМ197, Ав16-23-С-СВМ197, Ав17-24-С-СВМ197, Ав18-25-С-СВМ197, СВМ197-С-Ар16-23, СВМ197-С-Ар1724, СВМ197-С-АР18-25, Ав16-22-С-СВМ197, Ав17-23-С-СВМ197, Ав18-24-С-СВМ197, СВМ197-С-Ар16-22, СВМ197-С-Ар17-23 и СВМ19--С-Ар18-24. Еще в одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из Ав1-5-Ь-С-СКМ197, Ав1-7-Ь-С-СКМ197, Ав1-9-Ь-С
- 16 012984
СИМ и Ав1-12-Ь-С-СРМ197.
Кэпирование.
Недостаток применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты в боковые цепи реактивных молекул аминокислот на молекулах носителя и/или молекулах гаптенов, заключается в том, что эти реактивные сайты, если они не нейтрализованы, могут реагировать с любой нежелательной молекулой либо ίη νίίΓΟ, либо ίη νίνο. В способе по настоящему изобретению кэпирование непрореагировавших функциональных групп осуществляют реакцией конъюгатов с боковыми реактивными группами с реагентами, которые инактивируют/кэпируют реактивные группы. Типичные инактивирующие/ кэпирующие реагенты для применения со способом конъюгации по настоящему изобретению включают цистеамин, Ν-ацетилцистеамин и этаноламин. Или же кэширование осуществляют реакцией с аммиаком или бикарбонатом аммония, каждый из которых переводит галогенацетильные группы в аминоацетильные группы. Кэпирование также выполняют в щелочной среде (рН 9,0-9,8) с применением гидроксида натрия или карбоната натрия, в результате чего галогенацетильные группы гидролизуются до гидроксиацетильных групп. Одним потенциальным преимуществом превращения галогенацетильных групп в аминоацетильные или гидроксиацетильные группы, в отличие от реакции с производными цистеамина, этаноламином и т.д., является введение по реакции с аммиаком или гидроксидом/карбонатом химических функциональностей (функциональных групп) сравнительно меньшего размера. Полученные в результате кэпированные функциональные группы, например, аминоацетильная или гидроксиацетильная, вызывают значительно меньшие нарушения на участке белка-носителя конъюгата. Кэпированный конъюгат пептидный иммуноген-белок-носитель при необходимости очищают известными методами, такими как хроматография (гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобное взаимодействие или аффинная), диализ, ультрафильтрация-диафильтрация, селективная преципитация с применением сульфата аммония или спирта, и т.п.
Иммуногенные конъюгаты и композиции.
Кэпированные конъюгаты пептидный иммуноген-белок-носитель вводят в виде иммуногенных композиций млекопитающим, в частности людям, в профилактических и/или терапевтических целях. Конъюгаты по настоящему изобретению применяются для выявления и/или повышения иммунного ответа против иммуногенов. Например, конъюгаты СТЬ-носитель применяют для лечения и/или предупреждения вирусной инфекции, амилоидогенных заболеваний, рака и т.д. Или используют также конъюгаты полипептидный иммуноген-носитель, которые индуцируют антительный ответ. Примеры заболеваний, которые можно лечить, используя конъюгаты по настоящему изобретению, включают различные бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, паразитарные инфекции и рак.
При терапевтическом применении конъюгат по настоящему изобретению вводят индивидууму, уже страдающему амилоидогенным заболеванием, таким как болезнь Альцгеймера, или инфицированному патогенным микроорганизмом. Больным в инкубационном периоде или в острой фазе заболевания можно вводить конъюгат по настоящему изобретению отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, в зависимости от ситуации.
При терапевтическом применении иммуногенную композицию по настоящему изобретению вводят пациенту в количестве, достаточном для выявления (выработки) эффективного СТЬ (Т-клеточного) ответа или гуморального ответа на микроорганизм, амилоидную бляшку или на опухолевый антиген, экспрессированный на раковой клетке, и для лечения, или, по меньшей мере, частичного прекращения прогрессирования заболевания, симптомов и/или осложнений. Количество, достаточное для достижения такого результата, определяется как терапевтически эффективная доза. Эффективное для этого количество частично зависит от пептидной композиции, способа введения, стадии и тяжести подвергаемого лечению заболевания, веса и общего состояния здоровья пациента и мнения лечащего врача.
Терапевтически эффективные количества иммуногенных композиций по настоящему изобретению для начальной иммунизации с целью терапии или профилактики обычно находятся в пределах примерно, от 0,1 мкг, примерно до 10000 мкг пептида для пациента весом 70 кг, обычно около 0,1-8000 мкг, предпочтительно около 0,1-5000 мкг и наиболее предпочтительно около 0,1-1000 мкг. После этих доз следуют бустерные дозы около 0,1-1000 мкг пептида по схеме повторной иммунизации в течение от недель до месяцев в зависимости от реакции пациента и состояния, определяемых специфическим иммунным ответом.
Помимо этого, настоящее изобретение применяется в целях профилактики для предупреждения и/или уменьшения интенсивности бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций, паразитарных инфекций, амилоидогенного заболевания и рака. Эффективные количества описаны выше. Кроме того, специалист в данной области техники также знает, как корректировать или модифицировать профилактическое лечение в зависимости от ситуации, например, повторной иммунизацией и корректируя дозы и схемы лечения.
Терапевтическое лечение можно начинать при первых признаках заболевания или после обнаружения или хирургического удаления опухолей, или сразу после диагностирования острой инфекции. После этого следуют бустерные дозы до прекращения прогрессирования или до реверсирования заболевания, или до заметного ослабления симптомов и в последующий период. При хронической инфекции после
- 17 012984 начальных высоких доз могут потребоваться бустерные дозы.
Лечение инфицированных индивидуумов композициями по изобретению может ускорить прекращение инфекции у индивидуумов с острой инфекцией. У индивидуумов, чувствительных (или предрасположенных) к развитию хронической инфекции, композиции особенно пригодны в способах предупреждения перехода (развития) от острой к хронической инфекции. Если чувствительных индивидуумов идентифицируют до инфекции или в процессе инфекции, например, по данному описанию, композицию можно нацелить на них, что сведет к минимуму необходимость во введении композиции большей популяции.
Конъюгаты по настоящему изобретению также используют для лечения хронической инфекции и для стимуляции иммунной системы с целью элиминации инфицированных вирусом клеток у индивидуумов с латентными инфекциями. Важно обеспечить количество иммуногенной композиции по настоящему изобретению в такой рецептуре и используя такой способ введения, которые достаточны для того, чтобы эффективно выявить (выработать) и/или повысить иммунный ответ. Так, типичная доза для лечения хронической инфекции находится в интервале примерно от 0,1 мкг примерно до 10000 мкг пептида, обычно около 0,1-8000 мкг, предпочтительно около 0,1-5000 мкг и наиболее предпочтительно около 0,1-1000 мкг для пациента весом 70 кг. После этих доз иммунизации для эффективной иммунизации индивидуума может потребоваться введение бустерных доз через определенные интервалы, например, от одной до четырех недель, возможно, в течение продолжительного времени. При хронической инфекции введение следует продолжать, по меньшей мере, до тех пор, пока клинические симптомы или лабораторные тесты не укажут, что вирусная инфекция прекращена или практически отступила, и в течение некоторого последующего периода.
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению для терапевтического или профилактического лечения можно вводить парентеральным, топическим, внутривенным, оральным, подкожным, внутриартериальным, интракраниальным, интраперитонеальным, интраназальным или внутримышечным способом. Типичным способом введения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы одинаково эффективны. Другим обычным способом является внутримышечная инъекция. Этот вид инъекции, как правило, осуществляют в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулированы отложения, например, интракраниальная (внутричерепная) инъекция. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия (вливание) предпочтительны для введения антитела. В некоторых способах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в череп. Из-за простоты введения иммуногенные композиции по изобретению особенно пригодны для орального применения. Кроме того, изобретение включает иммуногенные композиции для парентерального применения, которые содержат раствор пептидов или конъюгатов, растворенных или суспендированных в приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе.
Можно применять различные разбавители, эксципиенты и буферы, например воду, забуференную воду, фосфатный буфер, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции можно стерилизовать обычными общеизвестными методами стерилизации или можно стерильно фильтровать. Полученные водные растворы можно упаковывать для применения как есть или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат перед применением объединяют со стерильным раствором. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требующиеся для приближения к физиологическим условиям, такие как буферизующие агенты, агенты, корректирующие тонус, увлажнители и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитан монолаурат, триэтаноламина олеат и т.д.
Для твердых композиций можно использовать обычные нетоксические твердые носители. Эти носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрий, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.д. - все фармацевтической степени чистоты. Для орального применения фармацевтически приемлемую нетоксическую композицию готовят, включая любые обычные эксципиенты, такие как выше перечисленные носители, и обычно 10-95% активного ингредиента, т.е. одного или более конъюгатов по изобретению, и более предпочтительно в концентрации 2575%.
Концентрация иммуногенных композиций по настоящему изобретению в фармацевтических препаратах может варьироваться в широких пределах, т.е. обычно от менее чем 0,1 вес.% или, по меньшей мере, около 2 вес.% до 20-50 или более вес.%, и выбирается прежде всего по объему, вязкости жидкостей и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Конъюгаты по настоящему изобретению можно также вводить в липосомах, которые служат для нацеливания конъюгатов на конкретную ткань, такую как лимфоидная ткань, или нацеливать селективно на инфицированные клетки, они также служат для повышения периода полужизни пептидной композиции. Липосомы включают эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, дисперсии фосфолипидов, ламеллярные слои и т. п. В этих препаратах доставляемую композицию включают как часть липосомы, самостоятельно или в сочетании с молекулой, которая связывается, например, с рецептором, преобладающим среди лимфоидных клеток. Эти молекулы включают моноклональные антитела, которые связываются с ΟΌ45 антигеном или с другими терапевтическими или иммуногенными
- 18 012984 композициями. Так, липосомы, заполненные заданной композицией по настоящему изобретению, можно направить на сайт лимфоидных клеток, куда липосомы затем доставляют выбранные терапевтические/иммуногенные пептидные композиции. Липосомы для применения по изобретению готовят из липидов, образующих стандартные везикулы, эти липиды обычно включают нейтральные или отрицательно заряженные фосфолипиды и стерин(ол), такой как холестерин. При отборе липидов обычно руководствуются соображениями размера частиц, лабильности или устойчивости липосом к кислоте в кровотоке. Известны различные способы получения липосом, описанные, например, в 8хока. с1 а1., Апп. Кеу. Вюрйуз. Вюепд. 9: 467 (1980), патенты США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
Для нацеливания на иммунные клетки лиганд, который включен в липосому, может включать антитела или их фрагменты, специфические к детерминантам клеточной поверхности заданных клеток иммунной системы. Липосомную суспензию, содержащую композицию по настоящему изобретению, можно вводить локально, топически и т. д. в дозе, которая варьируется, среди прочего, в соответствии со способом введения, доставляемой композицией и стадией заболевания, подлежащего лечению.
Для введения в виде аэрозолей композиции по настоящему изобретению применяют предпочтительно в тонко измельченном виде вместе с поверхностно-активным веществом и газом-вытеснителем. Обычно процентное содержание композиции составляет 0,01-20 вес.%, предпочтительно 1-10%. Естественно, поверхностно-активное вещество должно быть нетоксическим и предпочтительно растворимым в газе-вытеснителе. Типичными такими агентами являются эфиры или частичные эфиры жирных кислот, содержащих 6-22 углеродных атома, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая и олеиновая кислоты, и алифатического многоатомного спирта, или их циклического дегидратированного производного (циклического ангидрида). Можно применять смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-20 вес.% от веса композиции, предпочтительно 0,25-5%. Остальное содержимое композиции обычно составляет газ-вытеснитель. При необходимости можно также включать носитель, такой как лецитин для интраназальной доставки.
Композиции по настоящему изобретению можно также применять для получения моноклональных антител. Такие антитела могут применяться в качестве потенциальных диагностических или терапевтических агентов.
Композиции по настоящему изобретению также могут находить применение в качестве диагностических реагентов. Например, композиция по изобретению может использоваться для определения чувствительности конкретного индивидуума к схеме лечения, в которой применяются полипептидные иммуногены, и тем самым может быть полезна при модификации существующего протокола лечения или при установлении прогноза для пораженного индивидуума. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно также применять для того, чтобы прогнозировать, какие индивидуумы имеют повышенный риск развития хронической инфекции.
Конъюгаты по настоящему изобретению можно, необязательно, применять в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны для лечения и/или облегчения заболевания и/или его симптомов. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых амилоидные отложения наблюдаются в мозге, конъюгаты по изобретению можно применять в сочетании с другими агентами, которые повышают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер.
Иммуногенная композиция обычно содержит адъювант. Адъювант представляет собой вещество, которое повышает иммунный ответ при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Показано, что ряд цитокинов или лимфокинов обладают иммуномодулирующей активностью и, следовательно, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, но без ограничения, интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, патент США 5723127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы), интерфероны-α, β и γ, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (см., например, патент США 5078996), макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, С8Е и фактор некроза опухолей α и β. Другие адъюванты, применимые по данному изобретению, включают хемокин, в том числе, без ограничения МСР-1, ΜΙΡ-α, ΜΙΡ-β и ΡΑΝΤΕ8. Адгезивные молекулы, такие как селектин, например Ь-селектин, Р-селектин и Е-селектин, также могут применяться в качестве адъювантов. Другие применяемые адъюванты включают, без ограничения, муциноподобную молекулу, например, СО34, С1уСАМ-1 и МабСАМ-1, члена семейства интегринов, такого как ЬЕА-1, УЪА-1, Мас-1 и р150.95, члена суперсемейства иммуноглобулинов, такой как РЕСАМ, 1САМ, например, 1САМ-1, 1САМ-2 и 1САМ-3, СИ2 и ЬЕА-3, молекулы костимуляторов, таких как СИ40 и СО40Ь, факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервной ткани, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, В7.2, ΡΌΟΕ, ВЬ-1 и эндотелиальный фактор роста сосудов, рецепторные молекулы, включая Раз, ΤΝΕ рецептор, Е11, Аро-1, р55, ^8Ь-1, ΌΡ.3, ТКАМР, Аро-3, ΛΙΡ, ЕАКЭ, ΝΟΡΕ, ΌΡ.4, ΌΡ.5, КШЬЕК, ТКА1Е-К2, ТК1СК2 и ΌΡ.6. Другая молекула адъюванта включает каспазу (1СЕ). См. также Международные патентные заявки ХУО98/17799 и ХУО99/43839.
Подходящие адъюванты, применяемые для повышения иммунного ответа, включают, без ограничения, МРЬ™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид А; Сопха, НашШоп, МТ), который описан в
- 19 012984 патенте США 4120914. Также пригодны для применения в качестве адъювантов аналоги синтетического липида А или аминоалкил глюкозамин фосфаты (АСР) или их производные или аналоги, поставляемые Сопха (НатШоп, МТ) и описанные в патенте США 6113918, вводимом в данное описание в качестве ссылки. Один такой АСР представляет собой 2-[(К)-3-тетрадеканоилокси-тетрадеканоиламино]этил 2дезокси-4-О-фосфоно-3-О-[(8)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(В)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-Ь-О-глюкопиранозид, который известен как 529 (также известный как КС529; Сопха). Этот адъювант 529 готовят в виде водного раствора (529 АР) или в виде стабильной эмульсии (529 8Е).
Другие адъюванты включают эмульсии в минеральном масле и в воде, соли кальция, такие как фосфат кальция, соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и т.д., амфиген, авридин, Ь121/сквален, Ό-лактид-полилактид/гликозид, поверхностно-активные кислоты, полиолы, мурамил-дипептид, убитая бацилла Вогбе1е11а, сапонины, такие как стимулон (8бти1оп™ 08-21. Апйдешс8, Егаттдйат, МА), описанный в патенте США 5057540, и полученные из него частицы, такие как искомы (18СОМ8, иммуностимулирующие комплексы), МусоЬасЮпиш 1иЬегси1о818, бактериальные липополисахариды, синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив СрС (патент США 6207646), коклюшный токсин (РТ) или Е.соН термолабильный токсин (ЬТ), в частности ЬТ-К63, ЬТ-К.72, РТ-К9/С129; см., например, Международные заявки νθ 93/13302 и νθ 92/19265.
Также применимы в качестве адъювантов токсины холеры и их мутанты, включая описанные в Международной заявке νθ 00/18434 (в которых глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена другой аминокислотой (отличной от аспарагиновой кислоты, предпочтительно гистидином). Аналогичные СТ токсины или мутанты описаны в Международной заявке νθ 02/098368 (в них изолейцин в аминокислотном положении 16 заменен на другую аминокислоту, либо индивидуально, либо в сочетании с заменой серина в аминокислотном положении 68 на другую аминокислоту; и/или в них валин в аминокислотном положении 72 заменен на другую аминокислоту). Другие СТ токсины описаны в Международной заявке νθ 02/098369 (в них аргинин в аминокислотном положении 25 заменен другой аминокислотой; и/или аминокислота встроена (инсерция) в аминокислотное положение 49; и/или вводятся (инсерция) две аминокислоты в аминокислотные положения 35 и 36).
Следует понять, что ссылка в данном описании на любую теорию для объяснения описанных результатов не ограничивает объем изобретения. Независимо от способа по изобретению результатов и преимуществ по данному описанию можно достичь со ссылкой на нижеприведенные примеры изобретения.
Для рядового специалиста в данной области техники очевидно, что можно сделать многие модификации, не отходя от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, вводятся ссылкой во всей полноте для любых целей в той степени, как если бы в отношении каждой отдельной публикации, каждого отдельного патента или каждой отдельной патентной заявки конкретно и отдельно указано, что она (он) вводится ссылкой.
Пример 1.
Конъюгация СКМ197 с Ав пептидом.
Конъюгацию гаптенов/антигенных пептидов проводят реакцией активированного носителя СКМ197, содержащего тридцать девять остатков лизина, с гаптеном/антигенным пептидом, содержащим тиольную группу в боковой цепи, описанными ниже методами (фиг. 1). Все Ав пептиды содержат цистеиновый остаток на карбоксиконце для того, чтобы упростить конъюгацию этих пептидов за счет сульфгидрильной группы цистеина с белком-носителем. Эти пептиды получают твердофазным синтезом.
I. Активация.
Свободные аминогруппы СКМ197 бромацетилируют избытком эфира Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (81дта С.’11ет1са1 Со., 8!. Ьошк, МО) (Вегпа1о\\'1сх апб Майиеба, 1986). К охлаждаемому льдом раствору СРМ19,- (~15 мг) прибавляют 10% (об./об.) 1,0 М NаНССз (рН 8,4). Эфир Νгидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты в количестве, равном по весу количеству СКМ197, растворяют в 200 мл диметилформамида (ДМФА), медленно прибавляют к СРМ19- и осторожно перемешивают при комнатной температуре в темноте в течение 1ч. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, пропуская через обессоливающую колонку (Р6-ЭС), используя в качестве элюента РВ8/1 мМ ЕОТА (рН 7,0). После очистки фракции, соответствующие активированному СВМ197, собирают и концентрацию белка определяют анализом белка с реактивом ВСА. Как до, так и после обработки эфиром Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты, проводят реакцию аминогрупп белка с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (ТПВ8А), которая служат индикатором бромацетилирования (Меапк е! а1., 1972).
II. Конъюгация.
Перед конъюгацией пептиды реагируют с 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) [реагент Эльмана] для проверки содержания свободных -8Н-групп (около 62-88% восстановленных). Для первых четырех Ав пептидов (аминокислоты 1-7 без линкера, аминокислоты 1-12 с САСАС линкером, аминокислоты 1-9 с САСАС линкером и аминокислоты 1-7 с САСАС линкером) около 8,0-10,0 мг пептида
- 20 012984 растворяют в стерильной дистиллированной воде до примерной концентрации 20 мг/мл. Пептид медленно добавляют к холодному активированному СРМ19- в отношении 1:1 (вес./вес.) и рН доводят. примерно. до 7.0-7.2. добавляя 20-36 мкл 1Ν №1ОН. Полученный материал осторожно перемешивают в течение ночи при 4°С в темноте с последующим диализом в темноте против двух 1 л смен РВ8. рН 7.2. Для следующих четырех Ав пептидов (аминокислоты 1-5 без линкера. аминокислоты 1-9 без линкера. аминокислоты 1-12 без линкера и аминокислоты 1-5 с линкером) используют реакцию с реагентом Эльмана для проверки свободных - 8Н групп. СРМ19- бромацетилируют. очищают и проводят реакцию с ΤΝΒ8Λ. как описано ранее. рН каждого пептида доводят до 7.0. добавляя 0.1 М NаРО4 (рН 8.5) в 2.2х объеме растворенного пептида. Пептид медленно добавляют к холодному активированному СРМ19- в отношении 1:1 и реакцию оставляют на ночь при 4°С в темноте. Полученный материал подвергают диализу. Конечный контрольный пептид (1-12-мер в обратной ориентации) конъюгируют с СКМ19-. как описано выше с последующей модификацией. Предпочтительнее довести рН активированного СРМ19- примерно до 7.5. добавляя 20% (об./об.) 0.5 М NаРО4 (рН 8.0). чем корректировать рН пептида до 7.0. Каждый конъюгат после диализа переносят в стерильную пробирку на 15 мл из полипропилена. закрывают (обертывают) алюминиевой фольгой и хранят при 4°С. Затем методом масс-спектрометрии последовательно проверяют активацию реактивных аминокислотных остатков на носителе.
Конъюгат
Иммуногенный пептид
АД1-5-С-СКМ;97
ОАНЖ-С (ЗЕф. ГО. Ж>.:1)
АД1-7-С-СКМ197
ВАЕЕИГО-С (ЗЕф. »ΝΟ.:2)
АД1-9-С-СВМ1ЭТ
ПАЕГИГОЗО-С (ЗЕф ГО N0:3)
ΑβΙ-12-С-СВМш
ΟΑΕΕΒΗΟ5(3ΥΈν-0 (ЗЕф Ш N0:4)
АД1-5-Ь-С-СКМ1эт ϋΑΕΕΚ,-ΟΑΟΑ-Ο (ЗЕф ГО ΝΟ.:5)
Αβ 1-7-Е-С-СШЛ1Р7
ЮАВЕЮЮ-ОАОА-С (ЗЕф ГО ΝΟ.:6)
М1-9-Ь-С-СКМ1ЭТ
ОАЕРВНП8СНЗАОА-С (ЗЕф ГО ΝΟ.:7)
А31-12-Ь-С-СКМ1ет
ЮАЕЕКНОЗОУЕУ-ОАОА-С (8Еф ГО ΝΟ.:8)
АД12-1-С-СВМ1И (-ΥΕ СОЫТКОЪ)
УЕУОЗОНЙЕЕАО-С (ЗЕф ГО ΝΟ.: 9)
Ь= линкер (САСА) (8Еф ГО: 10)
Пример 2.
Получение конъюгата Ав пептид-СКМ197 и очистка ультрафильтрацией.
Бромацетилирование СКМ19-.
СРМ19- (100 мг) в 0.01 М натрий-фосфатном буфере. 0.9% №С1. рН 7.0. в атмосфере аргона реагирует с эфиром Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (растворенным в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл) в весовом отношении 1:1. Реакционную смесь титруют. так как необходимо поддерживать рН 7.0. Смесь перемешивают в темноте в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1.2 мкм в сосуд для концентрации системы ИР/ФР (М1Шроге ЬаЬ8са1е ΤΡΡ. ВШепса. МА). Очистку проводят на мембране 10К или 30К диафильтрацией (30-кратной) против 0.01 М натрий-фосфатного буфера/0.9% №С1. рН 7.0. Бромацетилированный СРМ19- фильтруют через фильтр 0.2 мкм. Степень бромацетилирования определяют реакцией активированного СКМ197 с цистеином с последующим аминокислотным анализом и количественным определением полученного карбоксиметилцистеина (СМС).
Конъюгация Ав пептида и бромацетилированного СРМ19- и кэпирование Ν-ацетилцистеамином.
Бромацетилированный СРМ19- (50 мг) переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8°С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения рН 9.0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида Ав и растворяют в воде для инъекций (ГСИ. ВДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до рН 9.0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного СРМ19и смесь перемешивают при 2-8°С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы кэпируют 20кратным молярным избытком Ν-ацетилцистеамина в течение 3-6 ч при 2-8°С.
Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1.2 мкм в сосуд для концентрации системы ИР/ФР (М11йроге ХЬ) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10К или 30К МГССО (М1Шроге) против 0.01 М натрий-фосфатного буфера/0.9% №С1. рН 7.0. Ретентат собирают. фильтруют через фильтр 0.2 мкм и анализируют на содержание белка (колориметрический анализ Ьо^гу или Мюго-ВСА). методом 8Ф8-РАСЕ. аминокислотным анализом. и на иммуногенность на мышах.
- 21 012984
Пример 3.
Превращение непрореагировавших бромацетильных групп в аминоацетильные группы с помощью кэпирования.
Бромацетилированный С.’РМ19- (50 мг), полученный, как описано выше, в примере 2, переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8°С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения рН 9,0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида Ав и растворяют в АБ1 (ВДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до рН 9,0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного СК.М19- и смесь перемешивают при 2-8°С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы кэпируют 20-кратным молярным 8% раствором бикарбоната аммония течение 4 ч при 2-8°С.
Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы ИБ/ЛБ (МкШроге ХЬ) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10К или 30К МАСО против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% ЫаС1, рН 7,0. Ретентат собирают, фильтруют и анализируют через фильтр 0,2 мкм и анализируют на содержание белка (колориметрический анализ Ьотегу или Мюго-ВСА), методом 8Л8-РАСЕ, аминокислотным анализом, и на иммуногенность на мышах.
Пример 4.
Количественное определение 8-карбоксиметилцистеина и 8-карбоксиметилцистеамина как оценка степени конъюгации и кэпирования конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид.
Кислотный гидролиз пептид-пептидных конъюгатов, полученных с помощью бромацетильной активации, приводит к образованию устойчивого к кислоте 8-карбоксиметилцистеина (СМС) из цистеинов в конъюгированных сайтах и образованию устойчивого к кислоте 8-карбоксиметилцистеамина (СМСА) из цистеинов в кэпированных сайтах (фиг. 2). Все конъюгированные и кэпированные лизины превращают обратно в лизин и детектируют в виде лизина. Все другие аминокислоты гидролизуются до свободных аминокислот, за исключением триптофана и цистеина, которые в условиях гидролиза разрушаются. Аспарагин и глутамин превращаются в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно.
Образцы конъюгатов разводят деионизированной водой до общей концентрации белка менее 1 мг/мл. Аликвоты 10 мкг каждого конъюгата сушат и ресуспендируют в 100 мкл 6Ν НС1 [Р1егсе], 5 мкл расплавленного фенола |8щта-А1бпс11| и 1 мкл 2-меркаптоэтанола [81дта-А1бгюй]. Затем образцы инкубируют в вакууме (100 миллитор) при 110°С в течение 22 ч. Полученные гидролизаты сушат, ресуспендируют в 250 мкл Весктап Να-8 буфера цитрата натрия для разведения образцов (рН 2,2) [Весктап 1пйгитепк, 1пс., Би11ейоп, СА] и фильтруют, используя 0,2 мкм нейлоновые мундштучные фильтры АНаИпап и шприцы на 1 мл.
Каждый образец затем вносят в петлю для жидких образцов аминокислотного анализатора Весктап 6300 и помещают в анализатор. Аминокислоты из каждого гидролизованного образца и контрольного образца разделяют ионообменной хроматографией с последующей реакцией с раствором нингидрина Весктап Νίπΐυτάππ ΝίπΡΧ при 135°С. Дериватизированные аминокислоты затем детектируют в частотном интервале видимого излучения при 570 и 440 нм (см. табл. 1). В каждой серии анализов наряду с образцами и контрольными образцами используют стандартный набор аминокислот [Р1егсе Атто Ааб 8!апбагб Н], содержащий по 500 пикомолей каждой кислоты. К стандарту добавляют 8карбоксиметилцистеин [81дта-А1бпсй].
- 22 012984
Таблица 1
Время удерживания аминокислот, определенное с помощью СгаШеЩ Ргодгат 1 на аминокислотном анализаторе Весктап 6300
Время удерживания (мин) Аминокислота Длина волны обнаружения
8.3 Карбокеиметилцистеин СМС 570
9.6 Аспарагиновая кислота и аспарагин Азх 570
11.3 Треонин ТЬг 570
12.2 Серин Зег 570
15.8 Глутаминовая кислота и глутамин С1х 570 и 440
18.5 Пролин Рго 440
21.8 Глицин О1у 570
23.3 Аланин А1а 570
29.0 Валин Уа1 570
32.8 Метионин Ме1 570
35.5 Изолейцин Пе 570
36.8 Лейцин Ьеи 570
40.5 Тирозин Туг 570
42.3 Фенилаланин РЬе 570
45.4 Карбокеиметилцистеин СМСА 570
48.8 Г истидин Н18 570
53.6 Лизин Ь18 570
70.8 Аргинин Ага 570
Площади каждого стандартного пика используют как количественный эквивалент для пропорциональной оценки каждого образца. Пролин определяют от 440 нм и превращают в эквивалент при 570 нм, используя глутаминовую кислоту, ближайшую аминокислоту.
Каждое из отих значений в пикомолях превращают в молярное отношение аминокислотных остатков, используя сравнение пикомолей лизина с теоретической величиной лизина в белке. Для такой оценки выбирают лизин, исходя из его ковалентного связывания с цистеином и цистеамином и ожидаемым аналогичным гидролизом. Полученное число молей аминокислот сравнивают затем с аминокислотным составом белка и сообщают наряду с величинами для СМС и ΟΜΟΑ. Величину СМС применяют непосредственно для оценки степени конъюгации, а величину ί'ΜΟΑ применяют непосредственно для оценки степени копирования.
Пример 5.
Характеристики и оптимизация пептидных конъюгатов Αβ-СВМ^.
Для проверки конъюгации все конъюгаты пептид-СКМ197 анализируют аминокислотным анализом и время - пролетной масс-спектрометрией с лазерной десорбцией и ионизацией пробы (МАЙЭ1-ТОР). Для каждого конъюгата моли пептида, конъюгированного с каждым молем СВМ197, определяют аминокислотным анализом (число 8-карбоксиметилцистеиновых остатков) и МАЙШ-ТОР спектрометрией. В целом значения, полученные каждым методом, согласуются друг с другом.
I. Эксклюзионная хроматография по размеру частиц.
Образцы партий концентрата берут из места хранения и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Образец конъюгата Αβ пептида осторожно перемешивают для того, чтобы гарантировать однородность препарата. Образец конъюгата Αβ пептида центрифугируют на микроцентрифуге от Эппендорфа для удаления всех частиц. Супернатант хроматографируют на колонке ТокоНаак Т8К-Се1 Ο30008\ν (ТокоНаак, 81и11даг1. Сегтапу). Колонку ТокоНаак Т8К-Се1 Ο30008\ν соединяют с ВЭЖХ системой и предельное давление повышают до 1,4 МПа. Колонку уравновешивают, используя по меньшей мере 30 мл РВ8 (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ №С1, рН 7,2±0,1), при скорости потока 0,75 мл/мин. Образец конъюгата Αβ пептида наносят на колонку ТокоНаак Т8К-Се1 630008ν, используя следующие показатели:
Концентрация образца конъюгата Αβ пептида: 1,5±1,0 мг/мл
Скорость потока: 0,75 мл/мин
Объем образца: 0,1 мл
Время прогона: 30 мин
Оптическую плотность определяют как при 280 нм, так и при 210 нм. Для продолжительного хранения колонку ТокоНаак Т8К-Се1 Ο30008\ν уравновешивают по меньшей мере 50 мл 20% отанола при скорости потока 0,5-1,0 мл/мин.
- 23 012984
II. РАСЕ (Электрофорез в полиакриламидном геле).
Активированный (бромацетилированный) СЯМ197 и конъюгаты Αβ пептид-СЯМ197 изучают на 808гелях методом электрофореза с NиРΑСЕ В18-1л8 (№уех, ЕгапкГий, Сегтапу), с нейтральным рН, готовой (заводской) полиакриламидной мини-гель системой и рабочим буфером №.1РАСЕ МЕ8 808. ΑликвоΊу 8 мкг каждого активированного СЯМ или конъюгата смешивают с буфером для восстановления образца и нагревают при 100°С в течение 5 мин. Конъюгаты и стандарты молекулярных масс (МВ) (1пу11годеп, СаткЬаб, СА) наносят на 10% (вес./об., акриламид) гель NиРаде (№уех) на основе системы, забуференной В18-ТГ18-НС1, и проводят электрофорез в рабочем буфере МЕ8 808-РАСЕ (ЬаеттН). После 808РАСЕ гель окрашивают с помощью Р1егсе Се1 Собе В1ие (Р1егсе, ЯоскГогб, 1Ь). Конъюгат Αβ пептидСЯМ197 представлен основной полосой около 66 кДа, выше полосы нативного СЯМ и полосы димера около 120 кДа, наряду с полосами минорных мультимеров (данные не показаны).
III. Масс-спектрометрический анализ МАБОЕТОЕ конъюгатов пептид-СЯМ197.
Масс-спектрометрические измерения проводят для непосредственного определения примерной степени конъюгации. Соответствующие аликвоты активированного СЯМ197 и образцов конъюгатов анализируют с помощью МАБОЕТ0Е масс-спектрометрии с 3,5-диметокси-4-гидроксикоричной кислотой (синапиновой кислотой) в качестве матрицы. Молекулярная масса активированного СЯМ197, определенная методом МАБОЕТОЕ масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ешшдап МАТ Ьазегта! 2000, Ятдоез, ΝΥ), составляет около 60,5 кДа, а для конъюгатов варьируется от 65 до 74 кДа в зависимости от степени конъюгации (данные не показаны). Найдено, что до 22 лизиновых остатков (~50%) в СЯМ197 модифицировано в отношении 1:1.
IV. Эксперименты по оптимизации.
Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент:белок, температуры реакции и рН реакционного буфера. Ниже даны некоторые примеры для иллюстрации оптимальных условий конъюгации, проведенные с целью определения оптимальной величины рН для получения воспроизводимых контрольных показателей процесса в реакциях конъюгации. Результаты (фиг. 3) показывают, что реакция конъюгации с Αβ 5-мером (ОАЕЕЯС) (8ЕС ГО N0:1), так же как с Αβ 7-мером (ОАЕЕЯНОС) (8ЕС ГО N0:2), зависит от рН, и более высокую степень модификации/конъюгации получают при повышенном значении рН. При использовании ТФК (ТЕА) соли 5-мерного и 7-мерного пептидов, меняя пептидную нагрузку, оценивают степень конъюгации при рН 9,0 (фиг. 4). Из этих результатов видно, что пептидные конъюгаты с определенным числом пептидных копий на молекулу СЯМ можно получать, меняя в процессе конъюгации отношение пептид/активированный СЯМ. Αналогичные эксперименты проводят с ацетатом (уксуснокислой солью) Αβ 7-мерного пептида.
При конъюгации Αβ1-7/СЯМ процесс кэпирования оценивают, сравнивая число молей СМСΑ на СЯМ с числом молей СМС на СЯМ. Когда сумма СМС и СМСΑ для каждого тестированного соотношения пептид:СЯМ остается постоянной, предполагают, что процесс кэпирования закончен (фиг. 5). Общая (тотальная) модификация в конъюгате остается между 19 и 21, что сравнимо с числом бромацетилированных лизиновых остатков (фиг. 5). Эти эксперименты проводят с ТФК (ТЕА) в качестве противоиона для пептида. Конъюгацию Αβ1-7/СЯМ повторяют, предпочтительно используя не ТФК соль, а ацетат, и эти данные показаны на фиг. 5 и 6. Процесс кэпирования, очевидно, закончен, при этом общее число СМС и СМСΑ для каждой точки остается между значениями 20 и 22. Условия реакции конъюгации ΑβСЯМ оптимизируют при рН 9,0, причем степень конъюгации в ходе реакции регулируется отношением пептида к СЯМ. Варьируя отношения от 0,1 до 1,5, можно менять степень конъюгации (фиг. 6).
Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент:белок, температуры реакции и рН реакционного буфера. Степень модификации (конъюгации) для каждого конъюгата рассчитывают, вычитая величину массы активированного СЯМ197 из величины массы каждого конъюгата, а затем делят на массу пептида, использованного для получения конъюгата. Степень модификации (конъюгации) для всех конъюгатов дана в табл. 2.
Степень конъюгации также сравнивают со значениями, полученными при определении числа образовавшихся 8-карбоксиметилцистеиновых остатков на моль СЯМ197 (также показано в табл. 2)
- 24 012984
Таблица 2
Степень модификации: сравнение данных МАЬИТ-ТОЕ и ААА
Образец Да (Массспектрометрия) Степень конъюгации (Массспектрометрия) Степень конъюгации (СМСаминокислотный анализ)
СКМ197 58408 — —
ВгАс- СКМ 60752 19 —
Αβί- 7/СКМ 74463 14 15
ΑβΙ-7/СКМ 72375 12 14
Αβί- 5/СКМ 75425 20 21
Αβί - 5/СКМ 71690 15 18
Пример 6.
Исследование иммуногенности конъюгатов Αβ пептида.
Пептиды, охватываемые Ν-концевыми остатками 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 Αβ (с линкерной последовательностью САСАС или без нее), и пептид, соответствующий Ν-концу Αβ в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), каждый из них конъюгирован с СКМ197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным Αβ 1-12-мерным пептидом в композиции со 8ТГМиЬО№м 08-21. Каждую группу мышей иммунизируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъюванта 8Т!МГкО\м 08-21, в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Протокол исследования представлен в табл. 3.
Как показано в табл. 3, пептиды, охватывающие Ν-концевые остатки 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 Аβ (с линкерной последовательностью САСАС или без нее), и пептид, соответствующий Ν-концу Αβ в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), конъюгированные с СКМ197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным Αβ 1-12-мерным пептидом в композиции с 08-21. Каждую группу мышей вакцинируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъюванта 08-21, в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Для полного исследования берут мышей 8\\зззХУеЬзЮг по 5 мышей в каждой группе. Объем инъекции=100 мкл; В=взятие пробы крови; У=вакцинация; Е=кровопускание.
Титры антител против Αβ определяют методом ЕЫ8А против Αβ и СКМ197, как описано далее. В нескольких словах: на 96-луночных планшетах Соз1аг (#3591) в течение ночи при комнатной температуре иммобилизуют 2 мкг/мл Αβ 1-42 в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты опорожняют и блокируют в течение 2 ч при комнатной температуре с помощью 200 мкл/лунка 0,05% В8А в 1Х РВ8/0,05% Тетееи 20. Блокированные планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего ТВ8, 0,1% Вгу-35 (не содержащий азида) буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят с 0,05% В8А в 1Х РВ8, содержащем 0,05% Т\гееп 20/0,02% азид, и 100 мкл каждого разведения затем переносят в соответствующие лунки планшета и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного 1дС, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от 8ои1йегп Вю1ес11 (город, штат), разводят 1:1000 с 0,05% В8А в РВ8, содержащем Т\гееп 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше, и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1мг/мл раствора субстрата п-нитрофенилфосфата, приготовленного в диэтаноламине/МдС12, рН 9,8. Проявление цвета прекращают, добавляя 50 мкг/лунка 3Ν раствора №ОН. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при О.И. (оптической плотности) 0,1 Аи (Ед.).
- 25 012984
Таблица 3
Протокол исследования иммунизации мышей
Код группы Описание Доза (мкг) ЗУкО 3¥к8 ИТс13 У¥к16
АЕ488 СКМ/1-7 с линкером/ без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ489 СКМ/1-12 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ490 СКМ/1-9 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ491 СКМ/1-7 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ492 СКМ/1-5 с линкером/ без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ493 СКМ/1-9 с линкером/ без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ494 СКМ/1-12 с линкером/ без линкера 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ495 СКМ/1-5 с линкером 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ496 СКМ/1-7 с линкером/ без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ497 СКМ/1 -12 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ498 СКМ/1-9 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ499 СКМ/1-7 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ500 СКМ/1-5 с линкером/ без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ501 СКМ/1-9 с линкером/ без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ502 СКМ/1-12 с линкером/ без линкера 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ503 СКМ/1-5 с линкером 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ504 СКМ197 С1-6151 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ505 СКМ197 С1-6151 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ506 СКМ/12-1тег 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ507 СКМ/12-1тег 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ508 1-12мерный пептид 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ509 1-12мерный пептид 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ510 АЪ 30 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
АЕ511 АЪ 5 Β,ν Β,ν Β,ν в в Е
Метод ЕЫ8А для СРМ197.
96-луночные планшеты Сгешег (#650011) при 37°С в течение 90 мин покрывают пленкой 5,0 мкг/мл (100 мкл/лунка) С.'К.М|9- в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего 1Х ТВ8, 0,1% Вгу-35 буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят в 1Х РВ8, содержащем 0,3% Т\уееп 20/ ЕИТА, и 100 мкл каждого разведения переносят затем в соответствующие лунки планшета и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного 1дС, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от 8ои1йегп Вю1ее11 (город, штат), разводят 1:1000 с 1Х РВ8, содержащем 0,05% Т\уееп 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше, и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1мг/мл раствора субстрата п-нитрофенилфосфата, приготовленного в диэтаноламине/МдС12, рН 9,8. Проявление прекращают, добавляя 50 мкг/лунка 3Ν раствора ΝαΟΗ. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при Ο.Ό. (оптической плотности) 0,1 Аи (Ед.).
Табл. 4-6 иллюстрируют ЕЫ8А титры в конечной точке против Ав. После первичной иммунизации все восемь конъюгатов (исключая негативный контроль) индуцируют заметный (измеримый) 1дС иммунный ответ против Ав. Однако, доза 30 мкг, но не доза 5 мкг, Ав вызывает позитивный ответ на 3-ей неделе после первичной иммунизации. Среди всех конъюгатов, по-видимому, пептид Ав 1-7, конъюгированный без линкера, вызывает такой же или лучший ответ, чем другие изученные конъюгаты. В дозе 5 мкг Ав 1-5С лучше действует на 8-16 неделях. Ав 1-7С является лучшим в дозе 30 мкг. Анализ титров антител после второй и третьей иммунизации в дозе как 5, так и 30 мкг показывает, что максимальный иммунный ответ на Ав для большинства конъюгатов наблюдается после второй иммунизации. По меньшей мере, у мышей третья иммунизация, по-видимому, не повышает иммунный ответ. Однако в случае Ав пептида требуются три иммунизации в дозе 30 мкг для достижения максимального иммунного ответа против пептида (табл. 5). Что касается распада антитела через продолжительный период времени, уровень антител в группах, иммунизированных конъюгатами, понижается в 2-3 раза по сравнению с наивысшим уровнем в этой группе. Отдельный образцы в группах на 6 и 8 неделях анализируют для расчета СМТ (среднегеометрических титров антител) против Ав для каждой группы (табл. 6), чтобы узнать, действительно ли какой-либо конъюгат значительно лучше других. Статистический анализ титров на неделе
- 26 012984
Таблица 4 в группах конъюгатов Ав1-5С, Ав1-7С и Ав1-9С показывает, что конъюгат Ав 1-7 индуцирует значительно более высокий титр. Также из этого эксперимента очевидно, что линкерная последовательность САСАС не способствует повышению иммунного ответа на пептид.
Группа Неделя 3 Неделя 6 Неделя 8 Неделя 13 Неделя 16
1-5С <100 14,960 687,691 882,012 625,208 771,828
1-7С <100 51,253 1,280,181 860,463 520,060 571,043
1-9С <100 18,615 1,008,872 622,325 348,967 380,755
1-12С <100 615 132,009 390,624 166,162 184,170
1-51,С <100 4,999 458,075 454,631 237,573 220,091
1-7ЬС <100 17,693 849,170 842,402 446,089 400,536
1-9ЬС <100 18,544 1,465,115 1,180,347 571,127 579,477
1-12ЪС <100 12,664 908,360 598,867 368,101 316,075
СЕМ] 97 <100 <100 <100 <100 <100 <100
М2 <100 <100 <100 <100 <100 <100
1-12 <100 <100 <100 <100 <100 <100
12-1С <100 <100 <100 <100 <100 <100
Табл. 4. Конечные титры антител против Ав на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методом ЕЫ8А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 5 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые амилоидные Ав пептиды различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1ап #592=3073307. Конечная точка при Θ.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей 8\νί55ХУсЬйсг иммунизируют 8С-Ы (подкожно) дозой 5 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг 8ТМиЬОК™ Р8-21 на 0, 3 и 6 неделях.
Таблица 5
Г руппа Неделя 0 Неделя 3 Неделя 6 Неделя 8 Неделя 13 Неделя 16
1-5С <100 18,150 590,355 332,832 204,645 176,159
1-7С <100 100,672 1,840,741 647,470 592,638 779,072
1-9С <100 18,520 1,184,696 713,494 363,459 327,065
1-12С <100 7,837 1,325,725 1,126,389 681,268 577,604
1-5ЬС <100 16,347 469,191 184,077 177,358 164,680
1-7ЬС <100 47,866 971,229 462,200 463,466 529,726
1-9ЬС <100 59,002 921,544 787,273 405,023 500,468
1-12ЬС <100 27,348 697,150 483,320 284,800 397,816
СКМ197 <100 <100 <100 <100 <100 <100
1-42 <100 <100 3,327 109,718 48,646 27,901
1-12 <100 <100 <100 <100 <100 <100
12-1С <100 <100 <100 <100 <100 <100
Табл. 5. Конечные титры антител против Ав на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методом ЕЫ8А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые амилоидные Ав пептиды различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1ап #592=3073307. Конечная точка при Ο.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей 8\νί55\УсЬ51сг иммунизируют 8С-Ы (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг 8ΤΙΜυΕΟΝ™ Р8-21 на 0, 3 и 6 неделях.
Таблица 6
Группа Неделя 6 Неделя 8
1-5С 237,668 ’ 161,671 11
1-7С 1,866,702® 881,146 ь
1-9С 963,323а 595,414”
1-12С 940,260 955,470
1-5ГС: 395,553 141,084
1-7ЬС 516,921 394,521
1-9ЬС 826,773 562,458
1-12ЬС 544,768 376,952
1-42 365 4,565
- 27 012984
Табл. 6. Конечные СМТ (среднегеометрические титры) антител против Ав через 6 и 8 недель, полученные методом ЕЫ8А при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих Ν-концевые пептиды амилоида-Ав различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Е1ап #592=3073307. Конечная точка при Θ.Ό. 0,1 Аи (Ед.). Мышей 8\\'155-\УеЬ51ег иммунизируют ЗС-Ν (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг 8Т1МиЬО№м 08-21 на 0, 3 и 6 неделях.
а. Статистический анализ титров антител на 6 неделе после введения 1-5С, 1-7С и 1-9С с применением критерия Тьюки-Крамера показывает статистическую разницу только между 1-5С по сравнению с 1-7С, тогда как анализ с применением Т-теста Стьюдента показывает статистическую разницу между 15С по сравнению с 1-7С и между 1-5С по сравнению с 1-9С.
Ь. Статистический анализ титров антител на 8 неделе после введения 1-5С, 1-7С и 1-9С не показывает статистической разницы между этими тремя группами. Однако, очевидно, имеется тенденция, которая может указывать на разницу между 1-5С по сравнению с 1-7С.
Окрашивание тканей мозга мышей линии РЭАРР.
Анализ окрашивания тканей мозга мышей линии РЭАРР указывает на функциональность конъюгатов Ав пептида и/или Ав 1-42 антисыворотки. Образцы сыворотки отдельных групп мышей анализируют отдельно на их способность узнавать бляшки, содержащие амилоидный пептид, в тканях мозга мышей РЭАРР. Результаты показаны в табл. 7А и 7В. За исключением антисывороток в результате введения конъюгата Ав 5-мера, наблюдается зависящий от дозы (доза-эффект) ответ узнавания бляшек. Вне зависимости от линкера антисыворотки, полученные в результате введения 30 мкг конъюгата, имеют лучший паттерн реактивности по сравнению с антисыворотками, полученными в результате введения 5 мкг конъюгата. Однако в случае антисывороток, полученных в результате введения конъюгата Ав 5-мера, наблюдается, по-видимому, сходная или лучшая реактивность в группе, получавшей дозу 5 мкг. Сравнение всех этих результатов приводит к выводу, что конъюгаты, полученные из Ав 1-5-мера по Ав 1-9-мер, достаточны для выявления распознающего бляшки иммунного ответа у мышей и присутствие линкера не является существенным. Из данного исследования можно сделать следующие заключения.
(а) Все пептидные конъюгаты индуцируют высокие титры антител против белка-носителя СКМ197, с равными или более высокими уровнями по сравнению с контрольным неконъюгированным СК.М19- (не показано).
(б) Конъюгаты с линкером ОАОАС не повышают иммуногенность или функциональность по сравнению с конъюгатами без линкера.
(в) Данные по иммуногенности и окрашиванию тканей мозга мышей РЭАРР (первичный показатель функционального антитела) показывают, что конъюгаты Ав 1-5-мера и Ав 1-7-мера, очевидно, являются предпочтительными иммуногенами для дальнейшей разработки.
Таблица 7А
Окрашивание тканей мозга мышей линии РЭАЭЭ
Доза
В отсутствие линкера
Вакцина Животное # Окрашивание РВАРР
1 +(нет диффузии)
СКМ/Αβ 1-5 2 3 -ΙΙ-/+++ ++/-НН-
4 -н-
5 -н-
1 ++
СКМ/Αβ 1-7 2 3 ++ ++
4 ++
5 -Е+
1 +
СКМ/Αβ 1-9 2 +/++
3
4
5
1 -
2 9
СКМ/Αβ 1- 12 3 ±
4 -
5 ±
СКМ/Αβ 1 -
12- 2 -
1 мерный 3 ±
4 -
5 ±
I 5 мкг
С линкером
Вакцина Животное # Окрашивание РВАРР
1 -
2 -
СКМ/Αβ 1-5 3
4
5
1
2 -н-
СКМ/Αβ 1-7 3 ++
4 +
5 ++
1 ++
2 ++
СКМ/Αβ 1-9 3 +
4 +
5 +
1 +
2 +
СКМ/Αβ 1-12 3 ++
4 -
5
Αβ42 1
2
3
4
5
Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания.
- 28 012984
Таблица 7В Окрашивание тканей мозга мышей линии РЭАЭЭ
Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания.
Пример 7.
Изучение иммуногенности на обезьянах.
Группы из 6 обезьян получают 30 мкг конъюгата 7-мера (тотальный конъюгат) с адъювантом, в качестве которого берут 8Т1МиЬО№™ 08-21, соли алюминия (а1ит) или препарат КС5298Е, в дни 0, 29 и 58. Дополнительные группы получают 30 мкг конъюгата 5-мера либо с соединением (гидроксидом) алюминия (а1ит, А1(ОН)3), либо с КС5298Е, 75 и 300 мкг Ав со 8Т1МиЬО№™ 08-21 в качестве позитивного контроля. Позитивный контроль вводят каждые две недели. На 36 и 64 день определяют титры антител против Ав (фиг. 7-9). На 36 день ОМТ титры антител, вырабатываемых конъюгатами 7-мер/СМК плюс 8Т1\И:1.О№™ 08-21, гидроксид алюминия и КС5298Е, составляют 10110, 13330 и 17090 соответственно (фиг. 7). Напротив, Ав 1-42 плюс 8Т1МиЬО№™ 08-21 выявляют ОМТ антител 223 и 1734 при уровнях доз 75 и 300 мкг соответственно. Конъюгат Ав 5-мера дает титр 2134 с соединением алюминия и 15980 с КС5298Е. На 64 день, т.е. после 3 доз, конъюгаты либо со 8Т1МиЬО№™ 08-21, либо с КС5298Е индуцируют значительно более высокие титры, чем после второй дозы (ОМТ 69910 для конъюгата 7мер/КС529 8Е; 21640 для конъюгата Ав 5-Мер/КС529 8Е и 30310 для конъюгата Ав 7-мер/8Т1МиЬО№™ 08-21) (фиг. 8). Конъюгаты с соединением алюминия индуцируют пониженные титры после третьей иммунизации по сравнению с результатами после второй иммунизацией. По-видимому, конъюгат Ав 7мера вызывает лучший (более высокий) ответ по сравнению с конъюгатом Ав 5-мера. У обезьян введение конъюгата Ав 7-мера с КС529 8Е или со 8Т1МиЬО№™ 08-21 в качестве адъюванта вызывают самый высокий ответ (фиг. 9). Ответ на конъюгат Ав 7-мера с соединением алюминия умеренный и сходен с ответом на введение 300 мкг Ав 1-42 плюс 8Т1МиЬО№™ 08-21.
Из данного примера можно сделать несколько выводов. Во-первых, оба конъюгата являются в высокой степени иммуногенными в отношении приматов. Во-вторых, присутствие адъювантов в препарате для иммунизации заметно влияет на иммунный ответ. В-третьих, за исключением алюминиевого адъюванта, КС529 8Е и 8Т1МиЬО№™ 08-21 повышают иммунный ответ после каждой вводимой при иммунизации дозы, по меньшей мере, вплоть до трех доз (фиг. 9). В целом конъюгат Ав 7-мера вызывает более высокий антительный ответ в присутствии 529, а затем следует 8Т1МиЬО№™ 08-21.
Пример 8.
Получение конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП, МАР) и изучение их иммуногенности.
Имеется несколько методов получения множественных антигенных сайтов на носителях. В предыдущих примерах каждый антигенный сайт по отдельности конъюгировался с носителем с помощью описанных реакций конъюгации и кэпирования. В данном примере множественные антигенные сайты создают твердофазным синтезом тандемных повторов Ав 1-7-мера. Или же эти тандемные повторы могут связываться с Т-клеточными эпитопами с соединением или без соединения через лизиновое ядро, как описано в другом месте. Эти множественные антигенные пептиды синтезируют с дополнительным цистеиновым остатком для конъюгации с белком-носителем. Синтезируют пептиды, содержащие одну единицу повтора (1-7), три единицы повтора (1-7)3 и пять единиц повтора (1-7)5 с дополнительным цистеи
- 29 012984 нильным остатком на карбоксильном конце. Эти пептиды ковалентно связывают с бромацетилированным СЕМ в течение ночи через С-концевые цистеиновые остатки. Реакцию проводят при рН 9,0-9,2 при соотношениях пептид:СЕМ, приведенных в табл. 8. Бромацетильные группы, не прореагировавшие с пептидом, кэпируют Ν-ацетилцистеамином. Эти группы представляют собой конъюгаты, содержащие, соответственно, одну единичную копию, три тандемных копии и пять тандемных копий пептида Ав 1-7, конъюгированные с СЕМ. В табл. 8 коротко показаны свойства образцов.
Таблица 8
Образцы конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП, МАР)
Конъюгат Пептид: СВМ (вес/всс) рН реакции
Αβ(1- 7)1/СКМ 0378^99
Αβ(1- 7)3/СКМ 1.028.95
Αβ(1- 7)Г/СКМ 1.679.17
Пептидная нагрузка (среднее число Ав1-7 пептидов на носитель) и число кэширований (табл. 9) представляют собой число уникальных аминокислот (СМС или СМСА) на носитель, определенное аминокислотным анализом. Величины СМС и СМСА отнесены к лизину.
Таблица 9
Степень конъюгации и копирования каждого конъюгата
Конъюгат Пептидная нагрузка (СМС) Кэпироваиие (СМСА)
Αβ(1-7)]/СКМ 12.5 8.99
Αβ(1- 7)з>СКМ 10.4 8.95
Αβ(1- 7)<'С'Г<_М 9.8 9.17
Мышей 8\\'155-АеЬ51ег (по 10 в группе) иммунизируют, вводя подкожно 1 или 0,1 мкг конъюгированного пептида Ар/СЕМ. Половину мышей иммунизируют композицией, приготовленной со 100 мкг адъюванта А1(ОН)3, а половину иммунизируют без адъюванта. Иммунизацию проводят на 0 и 3 неделе. Отбор проб крови проводят на 0, 3 и 6 неделе. Образцы сыворотки анализируют на антительный ответ против Ав 1-42-мерного пептида. Результаты показаны в табл. 10.
Таблица 10 Конечные титры антител против Ав для конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП)
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 ОМТ Неделя 6 СМТ
АС332 1 мкг Ар (1-7УСКМ А1(ОН)3 <100 18,096 100,279
АОЗЗЗ 1 мкг Αβ(1-7)3/Οΰνί А1(ОН)3 <100 44,911 420,235
А6334 1 мкг Ар(1-7)3/СВМ А1(ОН)з <100 27,032 394,488
АО335 0.1 мкг Αβ (1-7)]/СВМ А1(ОН)з <100 19,350 66,834
АО336 0.1 мкг Αβ (1-7)з/СКМ А1(ОН)3 <100 13,307 208,272
АО337 0.1 мкг Αβ(1-7)Λ’ΚΜ А1(ОН)3 <100 1,196 22,665
АС338. 1 мкг АД(1-7)]/СКМ Нет <100 5,273 370,980
АО339 1 мкг Αβ (1-7)»/СКМ Нет <100 9,299 541,093
АС340 1 мкг Αβ (1-7)5/СКМ Нет <100 3,100 185,272
АО341 0.1 мкг Αβ (1-7)1/СКМ Нет <100 340 25,839
АО342 0.1 мкг Αβ (1-7)3/СКМ Нет <100 128 5,553
АО343 0.1 мкг Αβ (1-7)ΛΚΜ Нет <100 668 2,098
Все конъюгаты индуцируют титр антитела против Ав 1-42 после первичной иммунизации, и уровни заметно повышаются после бустерной дозы. В отсутствие алюминиевого адъюванта разница доза-эффект очевидна в пробах крови как на 3, так и на 6 неделе. Более высокая доза вызывает антительный ответ с высоким титром. Алюминиевый адъювант вызывает значительно более высокий антительный ответ на 3 неделе в случае обоих уровней доз (0,1 и 1 мкг) по сравнению с группами, не получающими адъюванта. После вторичной иммунизации конъюгаты в дозе 1 мкг вызывают 5-10-кратное повышение уровней антител. В таком уровне доз пептидные конъюгаты с 3 и 5 повторами индуцируют более высокий антительный ответ, чем конъюгат, содержащий одиночный (однократный) повтор. Также определяют титры против носителя СЕМ, они представлены в табл. 11.
- 30 012984
Таблица 11 Конечные титры антител против СВМ для конъюгатов множественных антигенных пептидов (ΜΑΠ)
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 С,МТ Неделя 6 ОМТ
АО332 1 мкг Αβ (1-7)1/СКМ А1(ОН), <50 10,531 114,602
А6333 1 мкг Αβ (1-7)з/СКМ А1(ОН)3 <50 4,274 83,065
АО334 1 мкг Αβ (1-7),/СЕМ А1(ОН)3 <50 1,680 49,320
АО335 0.1 мкг Αβ (ЦТр/СКМ А1(ОН)з <50 1,114 13,231
АСгЗЗб 0.1 мкг Αβ (1-7)з/СКМ А1(ОН)з <50 197 1,484
А4Э337 од ΜκτΑβίι-ηί/σκΜ А1(ОН)3 <50 65 222
АС338 1 мкгАрЦ^/СВМ Нет <50 35 309
АО339 1 мкг Αβ (1-7)3/СВМ Нет <50 29 1,085
АС340 1 мкг Αβ (1-7)5/СКМ Нет <50 29 542
АО341 0.1 мкг Αβ (1-7)]/СКМ Нет <50 25 55
АС342 0.1 мкгАР (Ь7)Э/СКМ Нет <50 25 34
АС343 0.1 мкг Αβ (1-7УСВМ Нет <50 29 Не определялся
Животных иммунизируют на 0 и 3 неделе и пробы крови берут на 0, 3 и 6 неделе. Αдъювант 100 мкг А1(ОН)3 или отсутствует.
Данные в табл. 11 показывают, что в группах, не получающих адъюванта, индуцируются очень низкие уровни антительного ответа против СВМ при введении дозы как 1 мкг, так и 0,1 мкг даже после двух иммунизаций. Однако конъюгаты с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта индуцируют значительные уровни антительного ответа против СВМ в дозе 1 мкг и значительно более низкий ответ в дозе 0,1 мкг. В присутствии адъюванта титры СВМ наиболее высоки для конъюгата с единичным повтором, имеют промежуточное значение для конъюгата с тройным повтором и наиболее низкие для конъюгата с пятикратным повтором. Это и ожидалось, так как доза СВМ на дозу пептида является наиболее низкой для Αβ(1-7)5/СВМ и наиболее высокой для Αβ^^ι^Κ^. Разница становится статистически значимой только на 6 неделе при дозе 0,1 мкг.
Целью настоящего исследования является вызвать иммуногенный ответ с высокими титрами против антигенного пептида и необязательно против белка-носителя. В некоторых случаях желательно вызвать оптимальный иммунный ответ против антигенной детерминанты гаптена при наименьшем или нулевом иммунной ответе против белка-носителя. Для такого применения служат конъюгаты с тандемными повторами множественных антигенных детерминант в препаратах, не содержащих адъюванта.
Пример 9.
Получение конъюгатов Αβ-пептидов с различными белками-носителями и их иммуногенность.
В данном примере проводится сравнение иммуногенности конъюгатов при использовании шести различных белков-носителей. Соль ацетат Αβ1-7 прибавляют к бромацетилированным носителям в весовом соотношении 1:1 при рН 9. Все конъюгаты, за исключением Αβ1-7/^С5ар, копируют Νацетилцистеамином. Все альтернативные носители представляют собой рекомбинантные бактериальные белки, включая СВМ (дифтерийный токсоид), рекомбинантную С5а пептидазу (г5ар; клонируют при использовании 81геркососсик ада1асЕае, включает мутации Ό130Α и 8512А), ОВР 1224, 1664, 2452 (все клонируют при использовании 81геркососсик руодепек) и Т367, Т858 (каждый клонируют при использовании СЫатуФа рпеитошае). Результаты оксперимента для носителей представлены в табл. 12. Степень конъюгации и коширования каждого конъюгата Αβ1-7 с отими носителями даны в табл. 13.
В данном исследовании показано, что конъюгат рекомбинантной С5а пептидазы вырабатывает более высокие титры антитела против Αβ, чем большинство других тестированных носителей, включая СВМ. Эта разница статистически значима для титров на 6 неделе в группах, которые получают гидроксид алюминия. Кроме того, конъюгат Αβ1-7Α'858 является значительно более иммуногенным, чем большинство других конъюгатов в отсутствие адъюванта. Единственным конъюгатом, вызывающим слабый ответ по сравнению с контрольным СВМ конъюгатом, является Αβ1-7/Τ367, конъюгат, который также не реагирует со специфическим к Αβ моноклональным антителом при анализе Вестернблоттингом. Это исследование подтверждает, что для иммунизации против Αβ пептида можно успешно использовать многие другие носители.
- 31 012984
Таблица 12
Носители и свойства конъюгатов
Белок- М.В. носителя (Да) # лизинов носитель
СКМ 58408 39
гС5ар 108560 85
ОКИ 224 30950 18
ОКИ 664 31270 38
ОКР2452 31790 29
Т367 49700 29
Т858 37190 23
Таблица 13
Степень конъюгации и допирования каждого конъюгата
Конъюгат Пептидная нагрузка Копирование (СМС)(СМСА)
Αβί- 7/гС5ар 25.9 -
Αβί- 7/ОКН664 12.8 5.7
Αβί-7/ОКГ1664 13.4 10.8
Αβί- 7/ОКГ2452 12.03 10.5
Αβί- 7/Τ367 13.2 8.2
Αβί- 7/Τ858 5.2 1.7
Результаты конъюгации.
Пептидная нагрузка (среднее число Ав 1-7 пептидов на носитель) и число (степень) кэпирования и число уникальных аминокислот (СМС или СМСА) на носитель, определенные аминокислотным анализом. Значения СМС и СМСА отнесены к лизину.
Результаты иммунизации.
Средние геометрические титры для каждой группы в данном исследовании представлены в табл. 14. На 3 неделе, вне зависимости от присутствия адъюванта, Ав1-7/гС5ар индуцирует значительно более высокие титры антитела против Ав, чем соответствующие конъюгаты, приготовленные с 81гер1ососси8 руодепек ОКР 1224, 1664, 2452, или СЬ1атуб1а рпеитошае Т367 и Т858. На 3 неделе в отсутствие адъюванта Ав1-7/гС5ар также является более иммуногенным, чем все другие адъюванты, за исключением Ав1-7/Т858. Конъюгат Т858 в отсутствие А1(ОН)3 индуцирует более высокие титры, чем конъюгаты ОКР1224, ОКР1664, ОКР2452 и СКМ без адъюванта. Единственным конъюгатом, значительно менее иммуногенным, чем Ав1-7/СКМ, является Ав1-7/Т367 (р<0,00002). Носитель Т367 плохо работает в присутствии и в отсутствие адъюванта как на 3, так и на 6 неделе. На 6 неделе конъюгат гС5ар с гидроксидом алюминия является более иммуногенным (р<0,04), чем все остальные конъюгаты, за исключением Ав1-7/ОКР2452. В отсутствие адъюванта как Ав1-7/гС5ар, так и Ав1-7/Т858 вызывают значительно более высокие титры, чем конъюгаты с ОКР 1224, 1664 или Т367. Конъюгат Ав1-7/СКМ без гидроксида алюминия вызывает более высокие титры, чем Ав1-7/ОКР1664 или Ав1-7/Т367.
Таблица 14
Конечные титры антител против Ав 1-42
Код группы Описание образца Адъювант Неделя 0 Пул Неделя 3 амт Неделя 6 амт
ΑΟ344 5 мкг ΑβΙ-7/СКМ А1(ОН), <100 21,404 54,157
ΑΟ345 5 мкг Ар1-7ЛС5ар А1(ОН)3 <100 61,967 402,972
ΑΟ346 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΓ1224 А1(ОН)3 <100 10,711 30,084
ΑΟ347 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΓΊ664 А1(ОН)3 <100 7,188 43,226
ΑΟ348 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΓ2452 А1(ОН)3 <100 11,437 109,091
ΑΟ349 5 мкг Αβ1-7/Τ367 А1(ОН)з <100 321 5,139
ΑΟ350 5 мкг Αβ1-7/Τ858 А1(ОН)з <100 16,656 33,328
ΑΟ351 5 мкг ΑβΙ-7/СКМ Нет <100 2,615 119,488
ΑΟ352 5 мкг Ар1’7/гС5ар Нет <100 11,858 279,113
АС353 5 мкг Αβ1-7/ΟΕΡ1224 Нет <100 1,674 18,719
АС354 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΓ1664 Нет <100 119 9,832
ΑΟ355 5 мкг Αβ1-7/ΟΚΡ2452 Нет <100 2,493 76,038
ΑΟ356 5 мкг Αβ1-7/Τ367 Нет <100 50 620
ΑΟ357 5 мкг Αβ1-7/Τ858 Нет <100 28,820 275,202
- 32 012984
Животных иммунизируют на 0 и 3 неделе и пробы крови берут на 0, 3 и 6 неделе. Доза соответствует общему количеству конъюгата. Адъювант 100 мкг А1(ОН)3 или отсутствует.
Пример 10.
Получение других (дополнительных) конъюгатов Αβ пептид-белок.
I. Активация.
Размороженный СКМ197 (8 мл, 59,84 мг с концентрацией 7,48 мг/мл) растворяют в 0,1 М боратном буфере (рН 9, 3.968 мл), получают концентрацию 5 мг/мл. Раствор охлаждают в бане со льдом до 0-5°С. К раствору СКМ197 по каплям прибавляют раствор эфира Ν-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (59.9 мг) (А1бпс11-Зфта) в 100 мкл ДМФА (А1блсй-З1дта). После прибавления эфира Νгидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты выпадает осадок. При проверке рН оказывается, что его значение понижается до рН 6. рН реакционной смеси снова доводят до 9, добавляя 0,1 боратный буфер. Затем реакционную смесь перемешивают при 4°С в течение 1 ч при слабом вихревом движении. Смесь очищают, концентрируют на препаративной центрифуге ΥΜ-10 и повторно очищают на носителе Сефадекс-25, используя в качестве элюента 10 мМ раствор бората. Фракции, позитивные к реагенту Брэдфорд, собирают и концентрируют на препаративной центрифуге ΥΜ-10. Степень бромацетилирования определяют методом Брэдфорд (линейным). Найдено, что концентрация составляет 5,36 мг/мл (выход 30 мг). Конечную концентрацию доводят до 5 мг/мл и хранят в морозильнике в 5% сахарозе до последующего применения.
II. Конъюгация.
Для каждой конъюгации используют размороженный бромацетилированный СКМ197.
Пептиды растворяют в боратном буфере (2,5 мг в 125 мл 0,1 М боратного буфера). Неполная растворимость наблюдается в случае Αβ пептидов КЬУЕРАЕПС (ЗЕО ГО ΝΟ:45), СЬУЕРАЕПУ (ЗЕО ГО ΝΟ:47), СКЕУЕЕАЕ1) (ЗЕО ГО ΝΟ:48) и ЕУЕЕАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:50). Бромацетилированный СВМ (5 мг/мл) обрабатывают растворам/суспензиями пептидов. Соотношение пептида и белка в смеси равно 1:2. Смеси конъюгата с пептидами КЕУЕЕАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:45), СЕУЕЕАЕОУ (ЗЕО ГО ΝΟ:47), СКЬУРРАЕО (ЗЕО ГО ΝΟ:48) и КЬУРРАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:45) являются мутными. Затем проверяют рН смесей (рН 9) и инкубируют при 4°С в течение ночи при медленном перемешивании. Перед инкубацией концентрацию смесей доводят до 3 мг/мл. Помутнение смесей конъюгатов с пептидами СЬУРРАЕОУ (ЗЕО ГО ΝΟ:47) и ЬУРРАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:50) после инкубации исчезает. Однако смеси с КЬУЕРАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:45) и СКБУЕЕАЕО (ЗЕО ГО ΝΟ:48) остаются слегка мутными. Растворимый проверочный конъюгат (имитатор) с белком также готовят с цистеамином в отношении 1:1 (вес./вес.). Синтезированные пептиды получают от Β[Ο8ΟυΕΟΈ с чистотой около 95%.
Октамеры
ЕУРРАЕОУС (5ЕО ГО N0:44)
КЕУРРАЕОС (5Ер ГО N0:45)
УТРАЕОУСгС (ВЕС) ГО N0:43)
СЬУРРАЕОУ (ЗЕО ГО N0:47) СКЬУРРАЕО (8Е0 ГО N0:48) СУРРАЕОУО (8Еф ГО N0:46)
Гептамеры
УРРЛЕОУС (ЗЕО ГО N0:49)
БУРРАЕГЭС (ЗВО ГО N0:50)
III. Кэпирование непрореагировавших лизиновых групп белка.
Непрореагировавшие лизиновые остатки кэпируют Ν-ацетилцистеином (СМСА; А1бпсй-З1дта) в соотношении 1/1 (вес./вес.) в течение 4 ч при 4°С при встряхивании в темноте. Непрореагировавшие пептиды и кэпирующие реагенты удаляют из конъюгатов диализом с применением кассеты Зйбе-А-Ьакег (М„ срез 10000) (Р1егсе) против РВЗ буфера (2 л) в течение ночи (13 ч). Замену буфера и диализ проводят дважды (2±14 ч). Неполная растворимость наблюдается в конъюгатах с пептидами КЬУЕЕАЕОС (ЗЕО ГО ΝΟ:45) и СКЬУЕЕАЕО (ЗЕО ГО ΝΟ:48). Затем все конъюгаты хранят в холодильнике при 4°С с защитным покрытием.
ГУ. Характеристика белка-носителя.
ΜА^^I-ΤΟР МЗ применяют для определения массы бромацетилированного СВМ|9,- и массы проверочного конъюгата Ν-ацетилцистеамин-СВМи;-.
На основании массы СКМ197 и бромацетилированного СВМ19,- делают вывод, что модифицировано 11 лизиновых остатков.
(59941,46-58590,29)/122=11 где М\г СВМ197 составляет 58624,29
М\г бромацетилированного СВМ197 составляет 59941,46
М\г бромацетата составляет 122
Степень бромацетилирования составляет более 28% (общее число лизиновых остатков в СКМ197 со
- 33 012984 ставляет 39). Из этих 11 модифицированных лизиновых остатков 10 связывается с цистеамином. Эффективность связывания составляет 90%.
(61143-59941)/119=10 где М\у бромацетилированного СЯМ197 составляет 59941,46
М\у проверочного конъюгата составляет 61143
М\у №ацетилцистеамина составляет 119 (10/11)х 100=90
V. Характеристика конъюгатов пептид-белок с помощью 8Э8-РАСЕ Вестерн-блоттинга.
Αнализ с применением готового геля Тпз-Тпсте.
Конъюгаты белок-пептид анализируют Вестерн-блоттингом. Дорожки следующие: маркер (дорожка 1); Ь-28375 24/01 (дорожка 2); Ь-28375 24/02 (дорожка 3); Ь-28375 24/03 (дорожка 4); Ь-28375 24/04 (дорожка 5); Ь-28375 24/05 (дорожка 6); Ь-28375 24/06 (дорожка 7); Ь-28375 24/07 (дорожка 8); Ь-28375 24/08 (дорожка 9); Ь-28375 24/08 (проверочная, имитация) (дорожка 10) и ВгАсСЯМ197 (дорожка 11). Пептидспецифическое моноклональное антитело мышей (248-6Н9-806 Αβ 17-28) используют в качестве первичного антитела (антисыворотки) (найдено, что наилучшим является разведение 1:3000). Вторичным антителом является антитело козы против мышиного ^С (Н+Ь)-НРЯ (разведение 1:1000). Наблюдают, что все конъюгаты узнаются первичным антителом, за исключением проверочного конъюгата и активированного СЯМ197 (см. фиг. 10).
Концентрация белка.
Концентрации белка в образцах конъюгата определяют Р1егсе ВСА анализом (см. табл. 15).
Αминокислотный анализ.
Αминокислотный анализ проводят для определения степени конъюгации. Степень конъюгации рассчитывают на основании остатков СМСΑ (карбоксиметилцистеамина), обнаруживаемых после конъюгации. СМСΑ применяют для кэпирования непрореагировавших сайтов после конъюгации с пептидами (см. табл. 15).
Таблица 15
Степень конъюгации пептидов с ВгАсСЯМ197
Код конъюгата Пептидная последовательность (8ΈΟΙΒΝΟ:) Конечная концентрация (мг/мл) Степень конъюгации (по СМСА)
Ь-28375 24/01 ЬУРРАЕПУ-С (8ЕЦ ГО N0:44) 1.67 8/10
Ь-28375 24/02 КЬУЕРАЕО-С (8Ε(}ΙΟΝΟ:45) 0.82 5/10
Ь-28375 24/03 УГГАЕОУО-С (8Е(2 ГО N0:43) 1.43 8/10
Ь-28375 24/04 С-ЬУРРАЕОУ (8ЕОГО№3:47) 1.04 9/10
Ь-28375 24/05 С-ΚΙΛΤΡΑΕΌ (5ЕС) П> N0:48) 0.78 1/10
Ь-28375 24/06 С-УРРАЕОУС (8ΕΟΤΟΝΟ:46) 0.97 9/10
Ь-28375 24/07 νΡΡΑΕΟν-С (8Е0 ГО N0:49) 1.00 7/10
Ь-28375 24/08 ЕУРРАЮ-С (8ΕΟΙΒΝΟ:50) 0.99 8/10
Ь-28375 24/09 (проверочная, имитация) 1.89 10/11
Все колориметрические анализы проводят на спектрофотометре для микропланшет с применением 80ЕТтах Рго.
Пример 11.
Изучение иммуногенности конъюгатов Αβ пептидов на мышах 8\у188-\УеЬ81ег.
Αутбредных мышей 8\у188-\УеЬ81ег иммунизируют с помощью VЕЕΑЕ^VС-С (8ЕО ГО N0:43), ^VЕЕΑЕ^V-С (8 ЕС) ГО N0:44), КЕ\Т'ЕАЕ1)-С (8 ЕС) ГО N0:45), С-VЕЕΑЕ^VС (8 ЕС) ГО N0:46), С^VЕЕΑЕ^V (8ЕС) ГО N0:47), С‘-КЕ\ЬЕАЕ1) (8ЕС) ГО N0:48), VЕЕΑЕ^V-С (8ЕС) ГО N0:49), Е\ЬЕАЕ1)-С‘ (8Е0 ГО N0:50), каждый из которых конъюгирован с СЯМ197, или с Αβ1-7СЯМ197, все приготовлены с адъювантом ЯС 529 8Е. Девять групп по 10 животных в группе иммунизируют подкожно одним из пептидных конъюгатов в начале исследования (неделя 0) и затем на 4 неделе. Сыворотку отбирают перед иммунизацией, но в тот же день.
- 34 012984
Исследование иммуногенности конъюгатов Αβ пептидов на инбредных мышах Ва1Ь/с.
Инбредных мышей Ва1Ь/с иммунизируют, как в предыдущем абзаце, но повторно иммунизируют (бустерная инъекция) конъюгатом и адъювантом на 12 неделе.
Результаты.
Сыворотки от обоих исследований собирают для анализа титра антитела 1дС, специфического к пептиду Αβ13-28. Сыворотки мышей Ва1Ь/с также собирают для анализа за один день до бустерной инъекции на 12 неделе. Клетки селезенки животных из примера 11 оценивают на их возможность отвечать ш уйго на стимуляцию пулом перекрывающихся пептидов, охватывающих Αβ1-42, полноразмерным Αβ1-42, СКМ197 или поликлональными активаторами. Αнализ включает считывания показаний реакции Ейзро! для интерлейкинов 4 и 5 и интерферона гамма. По завершении Αβ пептидные конъюгаты оценивают как описано выше и в примере 6.
Пример 12.
Изучение иммуногенности Αβ пептидных конъюгатов на мышах Р8АРР.
Мышей Р8АРР иммунизируют с помощью УЕЕАЕЭУС-С (8Е0 ΙΌ NО:43), БУЕЕЛЕОУ-С (8Е0 ΙΌ ^:44), КЬУЕЕАЕП-С (8ЕЕ) ΙΌ ^:45), С-УЕЕАЕПУС (8ЕЕ) ΙΌ ^:46), С-ЬУЕЕАЕПУ (8ЕЕ) ГО ^:47), С-КЬУЕЕАЕП (8 ЕЕ) ΙΌ ^:48), УЕЕАЕПУ-С (8 ЕЕ) ΙΌ ^:49), ЬУЕЕАЕП-С (8ЕЕ) ΙΌ ^:50). Мышь Р8АРР, дважды трансгенная мышь (Р8АРР), сверхэкспрессирующая мутантные ΑΡΡ и Р81 трансгены, описана в Но1сошЬ, е1 а1. (1998) №11иге Мебюте 4: 97-11.
Изучение иммуногенности Αβ пептидных конъюгатов на мышах РОАРР.
Мышей РОАРР иммунизируют с помощью УЕЕАЕОУС-С (8ЕО ΙΌ NО:43), ЬУЕЕАЕПУ-С (8ЕО ΙΌ ^:44), КЬУЕЕАЕП-С (8ЕЕ) ΙΌ ^:45), С-УЕЕАЕПУС (8ЕЕ) ΙΌ ^:46), С-ЬУЕЕАЕПУ (8ЕЕ) ΙΌ ^:47), С-КЬУЕЕАЕП (8 ЕЕ) ΙΌ ^:48), УЕЕАЕПУ-С (8 ЕЕ) ΙΌ ^:49), ЬУЕЕАЕП-С (8 ЕЕ) ΙΌ ^:50). Мышь РОАРР экспрессирует мутантную форму человеческого ΑΡΡ (АРРУ71р), и у нее в раннем возрасте развивается болезнь Αльцгеймера (Вагб, е1 а1. (2000) №11иге Мебюте 6: 916-919; Мазйай Е, е1 а1. (1996), I. №игозск 15; 16(18): 5795-811).
Результаты.
Сыворотки в обоих исследованиях собирают для анализа титра ΙβΟ антитела, специфического к Αβ13-28 пептиду. По завершении Αβ-пептидные конъюгаты оценивают, как описано выше и в примерах 6 и 11, а также анализируя выработку ситуативного страха (СЕС).
Выработка ситуативного страха является обычной формой обучения, исключительно надежной и быстро усваиваемой большинством животных, например млекопитающими. Испытуемые животные обучаются бояться нейтральных ранее раздражителей и/или окружения (среды) вследствие их ассоциации с аверсивным опытом (см., например, Еапзе1оте, Атт. Ьеат. ВеНате. 18:264-270 (1990); \Уе1тег е1 а1., №1иге Е>еие1. 17:331-334. (1997); Са1багопе е1 а1., №1иге Сепе1. 17:335-337 (1997)).
Выработка (условного рефлекса) ситуативного страха особенно применима для определения когнитивной функции или дисфункции, например, в результате заболевания или нарушения, такого как нейродегенеративное заболевание или нарушение, Αβ-зависимое заболевание или нарушение, амилоидогенное заболевание или нарушение, наличие нежелательного генетического изменения, влияющего на когнитивную функцию (например, генетической мутации, дизрупции гена или нежелательного генотипа), и/или эффективности агента, например, Αβ конъюгата, в отношении когнитивной способности. Следовательно, СЕС анализ обеспечивает способ независимого тестирования /или оценки терапевтического действия агентов для предупреждения или лечения когнитивного заболевания или нарушения, и в частности, заболевания или нарушения, влияющих на одну или более областей мозга, например, гиппокамп, субикулум (основание), цингулярную кору, префронтальную кору, околоносовую область коры, сенсорную область коры и среднюю височную долю.
Обычно СЕС анализ проводят, используя стандартные камеры для животных и обучение-выработку условного рефлекса, включающую слабый шок (например, шок в результате пропускания через лапу тока 0,35 мΑ) одновременно со слуховым (например, белый шум 85 децибел в течение некоторого периода), обонятельным (например, экстракт лимона или миндаля), осязательным (например, текстура дна клетки) и/или визуальным сигналом (световая вспышка). Ответ на аверсивный опыт (шок) обычно представляет собой замирание (отсутствие движения, за исключением дыхания), но может также включать моргание глазами или изменение рефлекса моргающей мембраны, в зависимости от выбранного опытного животного. Αверсивный ответ обычно характеризуют в первый день обучения, чтобы определить фон (базовую линию) для неситуативного страха, при этом аверсивный ответ возникает в последующие дни испытания, например, замирание при создании определенной ситуации и/или в присутствии сигнала, но в отсутствие аверсивного опыта, характеризуется как страх, обусловленный сигналом или ситуацией (сигнальный или ситуативный), соответственно. Для повышения надежности опытных животных обычно тестируют отдельно независимые специалисты и оценивают в динамике. Дополнительные детали экспериментального дизайна можно найти в уровне техники, например, в СгаМеу, I. Ν., ^УНа('з ^гопд \νί11ι ту Моизе; Ве11атюга1 Р11епо1уртд оГ Тгапздешс апб Кпоскои! Мюе, ^йеу-Ызз, ΝΥ (2000).
Типичные опытные животные (например, животные модели) включают млекопитающих (например,
- 35 012984 грызунов или нечеловеческих приматов), которые проявляют заметные симптомы или патологию, характерные для амилоидогенного нарушения, такого как болезнь Альцгеймера. Животные модели можно создать селективным инбридингом или их можно получить с помощью рекомбинантной ДНК трансгенными методами, общеизвестными в технике, такими как целенаправленное генетическое изменение (например, генетическая мутация, дизрупция гена) в гене, которое ассоциировано с деменцией, ведущее к аберрантной экспрессии или аберрантному функционированию целевого гена. Например, имеется несколько штаммов трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют АРР и у которых развивается патология в виде амилоидных бляшек и/или развивается когнитивная недостаточность, характерные для болезни Альцгеймера (см., например, батек е1 а1., кирга, йобпкоп-^ооб е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 94:1550 (1997); Макбаб Е. апб Коскепкйет Е. (2000), 1. №ига1. Тгапкт. 8ирр1.; 59: 175-83).
Или же, животную модель можно создать, используя химические соединения (например, нейротоксины, анестетики), или хирургические методы (например, такие как стереотаксическая абляция, аксотомия, трансекция, аспирация), когда происходит удаление или иное вмешательство в нормальную функцию анатомической области мозга (например, гиппокампа, миндалевидного тела, околоносовой области коры, среднего септального ядра, голубого пятна, маммиллярных тел) или специфических нейронов (например, серотонергических холинергических или допаминергических нейронов), которые связаны с характерными симптомами или патологией амилоидогенного нарушения. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения животная модель проявляет заметную когнитивную недостаточность, связанную с обучением или памятью, помимо нейродегенеративной патологии, обусловленной амилоидогенным нарушением. Более предпочтительно когнитивная недостаточность значительно ухудшается с возрастом, так что прогрессирование заболевания у животной модели соответствует прогрессированию заболевания у субъекта, страдающего от амилоидогенного нарушения.
Выработка ситуативного страха (условный рефлекс ситуативного страха) и другие ш у1уо анализы для проверки функциональности конъюгатов по данному описанию можно проводить на мышах дикого типа или мышах, имеющих определенное генетическое изменение, ведущее к ослаблению памяти, или мышиной модели нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включая мышиные модели, у которых наблюдаются повышенные уровни растворимого Ав в спинно-мозговой жидкости (ликворе) (С8Р) или плазме. Например, животные модели болезни Альцгеймера включают трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют шведскую мутацию человеческого амилоидного белкапредшественника (бАРРкте; Тд2576), что свидетельствует о возрастном ослаблении памяти и бляшках (Нк1ао е1 а1. (1996) 8с1епсе 274: 99-102). 1п у1уо функциональность конъюгатов по данному описанию можно также проверять на мутантной мыши Р8-1, описанной в Пий, е1 а1. (1996) №1иге 383, 710-713. Другие генетически измененные трансгенные модели болезни Альцгеймера описаны в Макбаб Е. апб Коскепкйет Е. (2000), 1. №ига1. Тгапкт. 8ирр1.; 59: 175-83.
В различных аспектах способы по изобретению включают введение Ав конъюгата, который способен улучшать познавательную способность субъекта, причем определено, что Ав конъюгат применим в анализе, который соответствующим образом предсказывает иммунотерапевтическую эффективность в отношении субъекта. В типичных примерах анализ является анализом на животной модели, основанным, по меньшей мере, частично на сравнении познавательной способности, определенной при исследовании выработки ситуативной памяти, животного после введения животному тестируемого иммунологического реагента, по сравнению с соответствующим контрольным. СРС анализ позволяет оценить изменения познавательной способности животного (обычно мыши или крысы) при обработке потенциальным терапевтическим соединением. В некоторых вариантах изобретения изменение познавательной способности представляет собой улучшение статуса нарушенной (ослабленной) памяти или реверсию ослабления памяти. Следовательно, анализ СРС дает прямой (непосредственный) метод определения терапевтического эффекта агентов по предупреждению или лечению когнитивного заболевания, и, в частности, заболевания или нарушения, влияющего на одну или более областей мозга, например на гиппокамп, субикулум (основание), цингулярную кору, префронтальную кору, околоносовую область коры, сенсорную область коры и среднюю височную долю. Такие СРС анализы обсуждаются в одновременно рассматриваемой патентной заявке США, озаглавленной Выработка ситуативного страха для прогнозирования иммунотерапевтической активности (номер у патентного поверенного ЕЬ№058-1), поданной 15 декабря 2004 г., и патентной заявке США, озаглавленной Выработка ситуативного страха для прогнозирования иммунотерапевтической активности (номер у патентного поверенного ЕЬ№058-2).
Библиография
Вегпайо^йс/, М.8., апб Майкиеба, О.К. (1986) Апа1уййса1 Вюсбетйкйгу 155: 95-102.
Кпйккет, Р.1, апб Магбигд, 8. (1994) Эеуе1ортеп1 апб Сбшса1 Икек ой Наеторббик б Сопщдайе Уассйпек: Сопщдабоп: Оекйдп, Сбетйкйгу, апб Апайукйк Е1бк К.^., апб Огапойй, Э.М., Ебк; Магсе1 Эеккег, 1пс: кем Уогк, ΝΥ, 37-70.
Ат/оп, У., Вйесб1ег, К., Ситтйпдк, й., апб Нагбаидб, й. (1991) Нйдб-РегГогтапсе Ыс.|шб Сбготайодгарбу ой Рерббе апб Ргойейпк: 8ерагабоп, Апайукйк, апб СопГогтаИоп Мапй, С.Т. апб Нобдек, В 8., Ебк; СКС Ргекк: Воса Кайоп, РЬ, 859-863.
- 36 012984
Саг1ккоп, 1. е! а1. (1978) Вюскет 1., 173: 723.
Меапк, Θ.Ε., Сапдбоп, ^.1., апб Вепбег, Μ.Ι. (1972) Вюскеткйу 11: 3564-3574.
С1еппег & \Уопд (1984) Вюскет. Вюркук. Век. Соттип. 120: 1131.
Нагбу (1984) Тгепбк т №игокс1епсек 20: 1131.
Нагбу (1977) Тгепбк т №игокс1епсек 20: 154.
8!ои!е с! а1. (1997) Ν. Епд1. 1. Меб. 336: 86-91.
СоеЬе1 с! а1., (1939) 1. Ехр. Меб. 69: 53.
8скпеегкоп е! а1. (1980) 1. Ехр. Меб. 152: 361-376.
Ски е! а1. (1983) 1пГес1. 1ттип. 40: 245.
8скпеегкоп е! а1. (1984) 1пГес1. 1ттип. 45: 582-591.
Апбегкопк е! а1. (1985) 1. Реб1а1г. 107: 346.
1пке1 е! а1. (1986) 1. Ехр. Меб. 158: 294.
и.8. Ра!еп! № 4673574 1ип., 1987 Апбегкоп.
и.8. Ра!еп! № 4902506 ЕеЬ., 1990 Апбегкоп е! а1.
и.8. Ра!еп! № 5192540 Маг., 1993 Кио е! а1.
И.8. Ра!еп! № 5306492 Арг., 1994 Рогго.
и.8. Ра!еп! № 5360897 Νθν., 1994 Апбегкоп е! а1.
и.8. Ра!еп! № 5785973 М., 1998 В1х1ег е! а1.
и.8. Ра!еп! № 6361777 Маг., 2002 Ноодегкои!.
8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (С.8.Н. Р. Ргек, ΝΥ 2б еб., 1989).

Claims (41)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения иммуногенного конъюгата, включающий:
    (а) введение реактивной группы в аминокислотный остаток пептидного иммуногена;
    (б) дериватизацию одной или более функциональных групп белкового носителя с образованием активированной функциональной группы на белковом носителе;
    (в) реакцию пептидного иммуногена со стадии (а) с белковым носителем со стадии (б) в таких условиях, при которых образуется конъюгат, при этом реактивная группа пептидного иммуногена ковалентно присоединена к активированной функциональной группе белкового носителя; и (г) последующую реакцию конъюгата со стадии (в) с кэпирующим реагентом для инактивации оставшихся активированных функциональных групп на белковом носителе, с получением иммуногенного конъюгата и защитой функциональности носителя, так что он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ на пептидный иммуноген.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАОВЕ полипептида, сйситкрого/Не (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад!9-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СВМ197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдепек ΘΒΕ1224, 81гер!ососсик рюдепек ΘΒΕ1664, 8!гер!ососсик рюдепек ΘΒΕ2452, С111атуб1а рпеитошае ΘΒΕ Т367, СЪ1атуб1а рпеитошае ΘΒΕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Τ1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СВАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой СВМ197.
  4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
  5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового носителя дериватизируется с помощью сшивающего реагента.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что белковый носитель дериватизируется с галогенацетилирующим агентом.
  7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что кэпирующий реагент, который применяют для инактивации активированных функциональных групп на белковом носителе, выбирают из группы реагентов, состоящей из цистеамина, Ν-ацетилцистеамина, этаноламина, гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
  8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой добавление аминокислотного остатка, имеющего реактивную группу.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что аминокислотный остаток представляет собой цистеин, а реактивная группа содержит -8Н, или аргинин, с реактивной группой, содержащей гуанидильную группу, или глютамат или аспартат с реактивной группой, содержащей -СООН, или лизин с реактивной груп
    - 37 012984 пой, содержащей -ΝΗ2.
  10. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что аминокислотный остаток вводят в пептидный иммуноген добавлением во время синтеза пептида.
  11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой генерирование боковой тиольной группы у аминокислотного остатка путем его модификации при помощи тиолирующего реагента.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что тиолирующий реагент представляет собой Νацетилгомоцистеин тиолактон.
  13. 13. Способ по пп.8, 10 или 11, отличающийся тем, что аминокислотный остаток расположен на аминоконце пептидного иммуногена или карбоксиконце пептидного иммуногена.
  14. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что белковый носитель дополнительно содержит один или несколько полипептидных линкеров, ковалентно связанных с белковым носителем, а одна или несколько функциональных групп содержит заместитель одного или более полипептидных линкеров.
  15. 15. Иммуногенный конъюгат, содержащий пептидный иммуноген, ковалентно связанный с белковым носителем, отличающийся тем, что белковый носитель имеет формулу где С обозначает белковый носитель, а
    X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на носителе, т обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и иммуногенный конъюгат имеет формулу где С обозначает белковый носитель, а
    X0 обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя,
    Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный через реактивную группу аминокислотного остатка пептидного иммуногена с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
    Р обозначает кэпирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;
    п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
  16. 16. Конъюгат по п.15, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАЭРЕ полипептида, сйсипърого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад19-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1о515 (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СРМ197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 81гер1ососса1 С5а пептидазы, 8(гер1ососси5 рюдепе5 ΟΡΕ1224, 8!гер!ососси5 рюдепе5 ΟΡΕ1664, 8!гер!ососси5 рюдепе5 ΟΡΕ2452, СЬ1атуб1а рпеитошае ΟΡΕ Т367, СЬ1атуб1а рпеитошае ΟΡΕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СРАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  17. 17. Конъюгат по п.16, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой СРМ197.
  18. 18. Конъюгат по п.15, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
  19. 19. Иммуногенный конъюгат, полученный способом по п.1 и имеющий формулу где С обозначает белковый носитель, а
    X0 обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя,
    Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный через реактивную группу аминокислот
    - 38 012984 ного остатка пептидного иммуногена с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
    В обозначает кэпирующую молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;
    п обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
  20. 20. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАЭКЕ полипептида, агситкрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад!9-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 8!гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ1224, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ1664, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ2452, СЬ1атуб1а рпеитошае ОКЕ Т367, СЬ1атуб1а рпеитошае ОКЕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СКАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  21. 21. Конъюгат по п.20, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой СКМ197.
  22. 22. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
  23. 23. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что реактивная группа аминокислотного остатка пептидного иммуногена представляет собой свободную сульфгидрильную группу.
  24. 24. Конъюгат по п.23, отличающийся тем, что свободная сульфгидрильная группа представляет собой боковую цепь цистеинового остатка, или тиольную боковую цепь лизинового остатка.
  25. 25. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что реактивная группа аминокислотного остатка пептидного иммуногена представляет собой гуанидильную группу, карбоксильную группу или εаминогруппу.
  26. 26. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что белковый носитель дополнительно содержит полипептидный линкер, ковалентно связанный с белковым носителем, а функциональная группа содержит заместитель полипептидного линкера.
  27. 27. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что аминокислотный остаток пептидного иммуногена, содержащий реактивную группу, расположен на аминоконце пептидного иммуногена или карбоксиконце пептидного иммуногена.
  28. 28. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенный конъюгат пептидного иммуногена с белковым носителем, полученный способом по п.1, совместно с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей и/или адъювантов.
  29. 29. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (КЬН), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, РАЭВЕ полипептида, сйситкрого/Це (С8, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (НВ8Ад!9-28), белка теплового шока (Н8Р) 65, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка СКМ197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной 8!гер!ососса1 С5а пептидазы, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ1224, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ1664, 8!гер!ососсик рюдепек ОКЕ2452, СЬ1ашуб1а рпеитошае ОКЕ Т367, СЬ1атуб1а рпеитошае ОКЕ Т858, столбнячного токсоида, ВИЧ др120 Т1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (М8СКАММ8), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
  30. 30. Иммуногенная композиция по п.29, отличающаяся тем, что белковый носитель представляет собой СКМ197.
  31. 31. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
  32. 32. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что один или более адъювантов выби- рают из группы, состоящей из СМ-С8Е, 529 8Е, 1Б-12, фосфата алюминия, гидроксида алюминия, МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к, Вогбе!е11а рейикык, бактериальных липополисахаридов, аминоалкилглюкозаминфосфатов, МРЬ™ (3-О-деацетилированного монофосфориллипида А), полипептида, Ош1 А,
    8Т!МЕЕО\м р8-21, коклюшного токсина (РТ), Е.со11 термолабильного токсина (ЬТ), 1Ь-1а, К-1в, 1Ь-2, К-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Б-10, 1Б-13, 1Б-14, 1Б-15, 1Б-16, 1Б-17, 1Б-18, интерферона-α, интерферона-в, интерферона-γ, 6-С8Е, ΪΝΕ-α и Т№-в.
  33. 33. Иммуногенный конъюгат по п.26, отличающийся тем, что один или более пептидных линкеров
    - 39 012984 представляют собой полилизин.
  34. 34. Способ по п.11, отличающийся тем, что тиолирующий реагент выбирают из реагента Траута (2иминотиолан), 8АТА (№сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат), 8МРТ (4-сукцинимидилоксикарбонилметил-2-пиридилтиотолуол), 8и1Го ЬС 8РИР (сульфосукцинимидил пиридилдитио пропионамидогексаноат) и 8РИР (сукцинимидилпиридил дитиопропионат).
  35. 35. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образуют из белкового антигена бактерии, полученного из организма, выбранного из группы, состоящей из 81гер1ососси5 рпеитошае, 81арйу1ососсиб аигеиб, 81арйу1ососсиб ер1Фегш1Ф18, №188епа тешпдШФФ, №188епа допоггйеае, НаеторЫ1и8 тПиеп/ае. ЕбйепсЫа сой, К1еЬ81е11а еп1егоЬас1ег. ЬЫепа шопосу1одепе5. VIЬпо сйо1егае, С1о51пФшт регйпдепб, С1о81пФшт ЬоФНпит, видов РзеиФотопаб, 8а1топе11а 1урЫтигшт, ВоггеНа ЬигдФогСеп, 8Ы§е11а йехпеп, 8Ы§е11а ЬоуФи, 8Ы§е11а Фу8еп1пае, А11оюоссиб оФФФй и группы В стрептококков.
  36. 36. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образуют из белкового антигена вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, НА), вируса герпеса (Н8^, человеческого вируса папилломы, вируса парагриппа (₽ΐν), вируса везикулярного стоматита (νδν), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, Κδν), вируса Эпстайна-Барр (ενΕ), коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (НС'У) и вируса гепатита В (ΉΕν).
  37. 37. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена грибов, выбранных из группы, состоящей из вида СапФ1Фа, вида Сгур1ососси8, вида Сосс1Фю1Фе8, вида Н181ор1а8та и вида АбрегдШиб.
  38. 38. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена паразита, выбранного из группы, состоящей из плазмодия, трипаносом, шистосом и лейшмании.
  39. 39. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена, полученного от человека.
  40. 40. Иммуногенный конъюгат по п.39, отличающийся тем, что пептидный иммуноген человеческого происхождения берут из злокачественной опухоли.
  41. 41. Иммуногенный конъюгат по п.40, отличающийся тем, что пептидный иммуноген получают из карциноэмбрионального антигена или опухолевого антигена, полученного из опухоли, выбранной из почечно-клеточного рака, рака молочной железы, меланомы и рака простаты.
EA200800300A 2003-12-17 2004-12-17 Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения EA012984B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53048003P 2003-12-17 2003-12-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800300A1 EA200800300A1 (ru) 2008-10-30
EA012984B1 true EA012984B1 (ru) 2010-02-26

Family

ID=34700142

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800300A EA012984B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
EA200601169A EA010060B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200601169A EA010060B1 (ru) 2003-12-17 2004-12-17 Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения

Country Status (28)

Country Link
US (1) US20070134762A1 (ru)
EP (1) EP1701968B1 (ru)
JP (1) JP4764830B2 (ru)
KR (1) KR101157694B1 (ru)
CN (1) CN1984676A (ru)
AR (1) AR046960A1 (ru)
AU (1) AU2004299501B2 (ru)
BR (1) BRPI0417744B8 (ru)
CA (1) CA2549132C (ru)
CR (1) CR8444A (ru)
DK (1) DK1701968T3 (ru)
EA (2) EA012984B1 (ru)
EC (1) ECSP066655A (ru)
ES (1) ES2546175T3 (ru)
HK (1) HK1091219A1 (ru)
HU (1) HUE026000T2 (ru)
IL (1) IL176006A0 (ru)
MY (1) MY146566A (ru)
NO (1) NO340432B1 (ru)
NZ (1) NZ548352A (ru)
PL (1) PL1701968T3 (ru)
PT (1) PT1701968E (ru)
SG (2) SG149013A1 (ru)
SI (1) SI1701968T1 (ru)
TW (1) TWI355390B (ru)
UA (1) UA93854C2 (ru)
WO (1) WO2005058940A2 (ru)
ZA (1) ZA200604957B (ru)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2495048C1 (ru) * 2012-04-18 2013-10-10 Андрей Валентинович Исаев Пептид, обладающий антиатеросклеротическим действием и композиция для профилактики и лечения атеросклероза сосудов
RU2682754C2 (ru) * 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью
US10407511B2 (en) 2014-01-03 2019-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
US10517945B2 (en) 2012-07-04 2019-12-31 Hoffman-La Roche Inc. Covalently linked antigen-antibody conjugates
RU2723178C2 (ru) * 2014-05-07 2020-06-09 ЭППЛАЙД МОЛЕКЬЮЛАР ТРАНСПОРТ ЭлЭлСи Слитые молекулы, происходящие от Cholix-токсина, для пероральной доставки биологически активных нагрузок
RU2760521C2 (ru) * 2016-09-27 2021-11-26 Вало Терапьютикс Ой Негенетическая модификация оболочечных вирусов

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
RU2390350C2 (ru) * 2003-02-01 2010-05-27 Ньюралаб Лимитед Активная иммунизация для создания антител к растворимому а-бета
TWI306458B (en) * 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
MY144231A (en) 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
KR20070073885A (ko) * 2004-10-05 2007-07-10 뉴랄랩 리미티드 재조합 단백질 생산을 향상시키는 방법 및 조성물
JP2008523815A (ja) 2004-12-15 2008-07-10 エラン ファーマ インターナショナル リミテッド 認知の改善における使用のためのヒト化アミロイドβ抗体
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
TWI445545B (zh) 2005-04-08 2014-07-21 Wyeth Corp 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組合物
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP2269633A1 (en) * 2005-05-05 2011-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of Alzheimer's disease
ZA200710331B (en) * 2005-06-17 2009-04-29 Elan Pharma Int Ltd Methods of purifying anti A Beta antibodies
ES2454990T3 (es) 2005-11-02 2014-04-14 Duke University Quimioterapia e inmunoterapia simultáneas
US8497072B2 (en) 2005-11-30 2013-07-30 Abbott Laboratories Amyloid-beta globulomer antibodies
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
AU2007218318A1 (en) * 2006-02-24 2007-08-30 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
WO2007112079A2 (en) * 2006-03-24 2007-10-04 Duke University Multivalent immunogen
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
CA2659264C (en) * 2006-08-01 2016-01-26 The Scripps Research Institute Immunoconjugates of ghrelin for use in vaccines and methods for controlling adiposity
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
EP2486928A1 (en) 2007-02-27 2012-08-15 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2231180B1 (en) * 2008-01-16 2016-08-17 Ben-gurion University Of The Negev Research And Development Authority Vaccine for alzheimer's disease
EP2145898A1 (en) 2008-07-15 2010-01-20 CHIESI FARMACEUTICI S.p.A. Anti-amyloid immunogenic compositions, methods and uses
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
KR20140119165A (ko) 2009-06-22 2014-10-08 와이어쓰 엘엘씨 황색포도상구균 혈청형 5 및 8 협막 다당류 접합체 면역원성 조성물 및 이의 제조 방법
US8568735B2 (en) 2009-06-22 2013-10-29 Wyeth Llc Immunogenic compositions of Staphylococcus aureus antigens
CN101671689B (zh) * 2009-07-29 2013-05-01 中国农业科学院上海兽医研究所 含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用
CA2768346A1 (en) * 2009-07-30 2011-02-03 Pfizer Vaccines Llc Antigenic tau peptides and uses thereof
JP6091214B2 (ja) * 2009-11-16 2017-03-08 ザ ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン，インコーポレイティド ポリ−グリセロールリン酸をベースにした抗グラム陽性細菌ワクチン
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
WO2011133227A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Ancora Pharmaceuticals Inc. Synthetic oligosaccharides for staphyloccocus vaccine
WO2011137181A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 Ancora Pharmaceuticals Inc. Synthetic oligosaccharides for moraxella vaccine
WO2011149778A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Ancora Pharmaceuticals Inc. Synthetic oligosaccharides for neisseria meningitis vaccine
WO2012011100A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. Peptides based on the transmembrane domain of a toll-like receptor (tlr) for treatment of tlr-mediated diseases
WO2013054329A1 (en) * 2011-10-10 2013-04-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. Toll-like receptor 4 (tlr-4) agonist peptides for modulating tlr-4 mediated immune response
WO2012024187A1 (en) 2010-08-14 2012-02-23 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
DK2646462T3 (en) * 2010-11-29 2017-07-03 Akershus Univ METHODS AND COMPOSITIONS FOR MONITORING PHAGOCYTIC ACTIVITY
CN102526724B (zh) * 2011-01-14 2015-07-22 四川大学 氢氧化铝凝胶-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途
WO2012158701A1 (en) * 2011-05-18 2012-11-22 Matrivax Research & Development Corporation Protein matrix vaccine compositions including polycations
KR101281098B1 (ko) * 2011-06-30 2013-07-02 주식회사 녹십자 Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도
CN102731659B (zh) * 2012-06-07 2014-05-07 北京交通大学 一种6×His-C99重组蛋白及其制备方法和应用
CN103497927B (zh) * 2013-10-21 2016-02-10 深圳大学 表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组bcg活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
CN111228509A (zh) 2014-01-03 2020-06-05 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及其作为血脑屏障穿梭物的应用
US11160855B2 (en) * 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN104059142B (zh) * 2014-07-03 2016-11-23 江南大学 一种用于制备沙门氏菌交叉型抗体的免疫原的合成方法
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CN107406515B (zh) * 2014-12-18 2022-11-04 生物梅里埃公司 合成的双表位化合物
ES2571055B1 (es) * 2016-02-15 2016-12-28 Araclon Biotech, S.L. Conjugado amiloide y usos y procedimientos del mismo
CN106478802B (zh) * 2016-10-11 2019-08-09 浙江省人民医院 TNF-α蛋白B细胞表位，含此表位的多抗原肽及应用
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN107648618B (zh) * 2017-09-27 2020-05-08 国家纳米科学中心 一种药物递送体系及其制备方法与应用
CA3083953A1 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Dry adjuvanted immune stimulating compositions and use thereof for mucosal administration
CN110018253A (zh) * 2019-04-15 2019-07-16 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种生物制品中游离蛋白含量的高效液相测定方法
CN111499724A (zh) * 2020-04-15 2020-08-07 上海领潮生物新材料有限公司 一种s-腺苷同型半胱氨酸-鸡卵白蛋白偶联物的制备方法
CN111896737B (zh) * 2020-08-03 2023-07-07 北京望尔生物技术有限公司 一种蛇形菌素人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
US11571481B2 (en) 2020-12-21 2023-02-07 Cornell University Peptide-linked drug delivery system
CA3221075A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024025397A1 (ko) * 2022-07-29 2024-02-01 주식회사 엘지화학 항원 전달용 재조합 융합 단백질 및 이의 이용

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US5623057A (en) * 1991-01-28 1997-04-22 Merck & Co., Inc. Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine
US5877220A (en) * 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US6645503B1 (en) * 1998-03-10 2003-11-11 Wyeth Holdings Corporation Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US5360897A (en) 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5089603A (en) * 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5192540A (en) 1988-04-19 1993-03-09 American Cyanamid Company Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
CA2084307A1 (en) 1990-06-01 1991-12-02 Cetus Oncology Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
WO1993006121A1 (en) 1991-09-18 1993-04-01 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
JPH07507854A (ja) 1991-12-23 1995-08-31 ツォッヒェ，ミヒャエル 油除去装置を備えたエンジン
NZ249704A (en) * 1992-02-11 1996-11-26 Jackson H M Found Military Med A two carrier immunogenic construct comprising a 70+ kd molecule conjugated to at least 1 t-dependent antigen, preparation, compositions containing the construct
ES2204910T3 (es) 1992-10-01 2004-05-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bibliotecas quimicas combinatorias complejas codificadas con señales.
EP0616034B1 (en) 1993-03-05 2004-10-20 Wyeth Holdings Corporation Plasmid for production of CRM protein and diphtheria toxin
DK0735893T3 (da) 1993-09-14 2009-03-09 Pharmexa Inc PAN DR-bindende peptider til styrkelse af immunsvaret
EP0726906A4 (en) 1993-11-02 1998-10-07 Affymax Tech Nv THE SYNTHESIS AND EXAMINATION OF MOLECULAR DIVERSITY
US5571515A (en) * 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
CA2189634A1 (en) 1994-05-06 1995-11-16 John J. Baldwin Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
IL115933A0 (en) 1995-11-09 1996-01-31 Oramir Semiconductor Ltd Process and apparatus for oblique beam revolution for the effective laser stripping of sidewalls
ATE246808T1 (de) 1995-11-10 2003-08-15 Elan Corp Plc Peptide, die den transport über gewebe erhöhen und verfahren zu ihrer identifizierung und verwendung
WO1998017799A1 (en) 1996-10-23 1998-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunotherapy and improved vaccines
US6962984B2 (en) * 1996-12-05 2005-11-08 Nihon University IgA nephropathy-related DNA
DK0848011T3 (da) 1996-12-16 2001-07-16 Nederlanden Staat Køleelement og køleanordning
US20020086847A1 (en) * 1997-04-09 2002-07-04 Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
EP1078093B1 (en) 1998-02-27 2011-06-08 The Trustees of The University of Pennsylvania Vaccines, immunotherapeutics and methods for using the same
CA2264970A1 (en) * 1998-03-10 1999-09-10 American Cyanamid Company Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria
EP1117435B1 (en) 1998-09-30 2007-11-14 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
CA2363118A1 (en) * 1999-02-25 2000-08-31 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d
US6945135B1 (en) * 1999-09-09 2005-09-20 L. H. Thomson Company, Inc. Bicycle stem for enlarged handlebar portions and associated methods
US20030190322A1 (en) * 2000-03-31 2003-10-09 Peter Kaastrup Immunostimulating properties of a fragment of tgf-beta
US20030092145A1 (en) * 2000-08-24 2003-05-15 Vic Jira Viral vaccine composition, process, and methods of use
EP1404368B1 (en) 2001-06-07 2009-12-09 Wyeth Holdings Corporation Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
JP2005508143A (ja) 2001-06-07 2005-03-31 ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン アジュバントとしてのコレラホロトキシンの突然変異形
US20030135035A1 (en) * 2001-08-09 2003-07-17 Mark Shannon Human ZZAP1 protein
WO2003045128A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID β, PRION PROTEIN, AMYLIN, α-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
AU2004220590B2 (en) * 2003-03-07 2010-02-18 Inhibitex, Inc. Polysaccharide - Staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
MY144231A (en) * 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US5623057A (en) * 1991-01-28 1997-04-22 Merck & Co., Inc. Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine
US5877220A (en) * 1997-03-06 1999-03-02 Genta, Incorporated Amide-based oligomeric cationic lipids
US6645503B1 (en) * 1998-03-10 2003-11-11 Wyeth Holdings Corporation Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2495048C1 (ru) * 2012-04-18 2013-10-10 Андрей Валентинович Исаев Пептид, обладающий антиатеросклеротическим действием и композиция для профилактики и лечения атеросклероза сосудов
US10517945B2 (en) 2012-07-04 2019-12-31 Hoffman-La Roche Inc. Covalently linked antigen-antibody conjugates
RU2682754C2 (ru) * 2014-01-03 2019-03-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Конъюгаты полипептидного токсина и антитела, соединенных ковалентной связью
US10407511B2 (en) 2014-01-03 2019-09-10 Hoffmann-La Roche Inc. Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
US10519249B2 (en) 2014-01-03 2019-12-31 Hoffmann-La Roche Inc. Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
RU2723178C2 (ru) * 2014-05-07 2020-06-09 ЭППЛАЙД МОЛЕКЬЮЛАР ТРАНСПОРТ ЭлЭлСи Слитые молекулы, происходящие от Cholix-токсина, для пероральной доставки биологически активных нагрузок
RU2760521C2 (ru) * 2016-09-27 2021-11-26 Вало Терапьютикс Ой Негенетическая модификация оболочечных вирусов

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004299501A1 (en) 2005-06-30
HUE026000T2 (en) 2016-04-28
EP1701968B1 (en) 2015-06-03
PL1701968T3 (pl) 2015-11-30
NO20062687L (no) 2006-09-15
CA2549132C (en) 2017-03-07
BRPI0417744A8 (pt) 2017-08-08
JP2008505052A (ja) 2008-02-21
WO2005058940A2 (en) 2005-06-30
DK1701968T3 (da) 2015-06-22
EA200800300A1 (ru) 2008-10-30
WO2005058940A3 (en) 2006-10-26
CN1984676A (zh) 2007-06-20
PT1701968E (pt) 2015-09-11
ECSP066655A (es) 2006-12-20
JP4764830B2 (ja) 2011-09-07
UA93854C2 (ru) 2011-03-25
ES2546175T3 (es) 2015-09-21
BRPI0417744B1 (pt) 2020-11-03
SI1701968T1 (sl) 2015-08-31
US20070134762A1 (en) 2007-06-14
BRPI0417744B8 (pt) 2021-05-25
AU2004299501B2 (en) 2010-12-23
KR20070027502A (ko) 2007-03-09
TW200533681A (en) 2005-10-16
SG182163A1 (en) 2012-07-30
TWI355390B (en) 2012-01-01
EA010060B1 (ru) 2008-06-30
EA200601169A1 (ru) 2007-04-27
NZ548352A (en) 2009-09-25
EP1701968A2 (en) 2006-09-20
MY146566A (en) 2012-08-30
NO340432B1 (no) 2017-04-24
ZA200604957B (en) 2008-01-08
CA2549132A1 (en) 2005-06-30
EP1701968A4 (en) 2007-10-03
CR8444A (es) 2008-02-20
KR101157694B1 (ko) 2012-06-20
SG149013A1 (en) 2009-01-29
IL176006A0 (en) 2006-10-05
HK1091219A1 (en) 2007-01-12
BRPI0417744A (pt) 2007-04-10
AR046960A1 (es) 2006-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012984B1 (ru) Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
EA011239B1 (ru) КОНЪЮГАТЫ Aβ ИММУНОГЕННЫХ ПЕПТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
ARUMUGHAM et al. Patent 2549132 Summary
MXPA06006822A (en) Immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title