CN101671689B - 含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫热休克蛋白60基因。本发明还公开了日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法及上述重组表达载体的应用。本发明的含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫热休克蛋白60，该高表达的重组日本血吸虫Hsp60蛋白能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。

Description

含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用。

背景技术

血吸虫病是分布最广泛、危害最严重的被忽略热带疾病之一，我国流行的是日本血吸虫病，其病原体为日本血吸虫。日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)的生活周期复杂，有钉螺作为其中间宿主和人、水牛、黄牛等哺乳动物作为其终末宿主。近年来，对于血吸虫生命活动的分子机制和其重要功能分子的研究受到越来越多的关注，其中热休克蛋白(Heatshock proteins，Hsp)便是一类重要的功能分子，它是很多生命活动的参与者。热休克蛋白是一类高水平基础表达的蛋白质，占正常生长条件下所有类型细胞中蛋白总量的5％-10％。当细胞处于逆境时，热休克蛋白的表达量明显上调。Hsp60是热休克蛋白的家族之一，是一种在细胞保护中起重要作用的分子伴侣。真核生物的Hsp60主要定位于线粒体，另有一小部分存在于胞浆。线粒体中的Hsp60可作用于凋亡相关因子而抑制线粒体凋亡通路的激活，并且能够减少线粒体产生氧自由基；胞浆中的少量Hsp60亦可通过与凋亡相关因子的相互作用等途径抑制细胞凋亡。作为分子伴侣，Hsp60帮助变性和不可溶的蛋白聚集体恢复正确构象。正常条件下，Hsp60以稳定状态存在于线粒体基质和胞浆中；应激条件下，Hsp60迅速从胞浆转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白。张玲等用吡喹酮对日本血吸虫成虫进行体外作用，采用二维-纳喷雾-液相色谱联合串联质谱的方法，发现经吡喹酮作用后，Hsp60和Hsp70蛋白明显上调，提示热休克蛋白可能参与缓解吡喹酮对细胞损害的作用，导致生物体合成这类蛋白质的能力增强。由此推测，抑制热休克蛋白基因表达或抑制热休克蛋白活性以减少其他多种蛋白的合成可能能够作为一种抗血吸虫的新途径。

疫苗是控制传染性疾病的有效手段，也是血吸虫病综合防治的重要措施之一，世界卫生组织专家认为，短效的化疗手段必须与长效的疫苗措施相结合。尽管目前所有实验性血吸虫病疫苗在免疫后均只能诱导出对血吸虫感染部分抵抗力，但由于血吸虫在其终宿主体内不繁殖，故对控制血吸虫病仍有重要的生物学与临床意义。寻找新的疫苗候选抗原仍是当今血吸虫疫苗研究的重点之一。

到目前为止，还没有出现关于本发明日本血吸虫热休克蛋白60作为疫苗应用的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，该重组载体表达的日本血吸虫热休克蛋白60可作为抗血吸虫的疫苗候选抗原。

此外，还需要提供一种含日本血吸虫基因的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，所述基因是日本血吸虫热休克蛋白60基因。

优选的，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因序列是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列；更优选的，该日本血吸虫热休克蛋白60基因序列为SFQ ID NO：2所示核苷酸序列。

优选的，所述表达载体为原核表达载体；更优选的，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫热休克蛋白60基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫热休克蛋白60；

纯化诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60。

优选的，所述诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60还连接有包含6个组氨酸的标签序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

本发明重组载体表达的日本血吸虫热休克蛋白60可以作为诊断抗原对血吸虫病畜进行诊断。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述制备方法生产的日本血吸虫热休克蛋白60作为预防或治疗血吸虫病疫苗的用途。

本发明含日本血吸虫基因的重组表达载体，能够高表达日本血吸虫热休克蛋白60，该高表达的重组日本血吸虫Hsp60蛋白在小鼠免疫性保护实验中，使免疫组小鼠的减虫率与肝组织减卵率分别达到28.76％和24.85％，表明本发明重组日本血吸虫Hsp60蛋白能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1重组质粒的酶切与PCR鉴定图；

图2是本发明实施例2重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达结果图；

图3是本发明实施例3重组日本血吸虫hsp60蛋白表达形式的鉴定与纯化图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明利用重组DNA技术将日本血吸虫热休克蛋白60(hsp60)基因的编码序列克隆至原核表达载体，并使其在大肠杆菌中大量表达，且纯化得到其表达产物。纯化产物可应用于小鼠免疫保护实验，以评估其抗血吸虫的保护效果，为抗血吸虫病疫苗分子的筛选提供重要的参考价值。

实施例1日本血吸虫hsp60基因编码序列原核表达载体的构建

查找日本血吸虫hsp60基因在Genebank中的序列设计引物，用DNAstar分析其序列特征，并找到其最大的开放阅读框(SEQ ID NO：2)，即其编码蛋白质的序列部分，根据这一部分序列设计引物如下：

sense：5’-CCGGGATCCATGTTACGAGCTCTAAGTTCA-3’(SEQ ID NO：3)，

anti-sense：5’-GCGCTCGAGCATCATGCCTCCCATTCCA-3’(SEQ ID NO：4)，

分别引入限制性内切酶BamH I和Xho I酶切位点(下划线部分)。Hsp60开放阅读框的扩增以日本血吸虫雌虫cDNA文库为模板进行PCR。采用的原核表达载体pET28a(+)为表达6×His标签的高效表达载体，该载体设计有多克隆酶切位点，可以插入外源基因片段hsp60基因编码序列。将扩增hsp60基因编码序列的PCR产物经胶回收、双酶切后，与同样双酶切的质粒pET28a(+)于16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布于含有卡那霉素(100ug/ml)的LB平板上。挑取单一菌落扩大培养，提取质粒，进行PCR及单、双酶切鉴定，将初步鉴定正确的阳性克隆菌液进行测序。

图1为重组质粒Sjhsp60-pET28a(+)的酶切与PCR鉴定图，在图1中，M1：DNA标志物(DL15000)；1：重组质粒BamH I单酶切鉴定；2：重组质粒BamH I、Xhol I双酶切鉴定；3：重组质粒PCR鉴定；M2：DNA标志物(DL2000)。从图1可以看出，在“2”、“3”泳道都有明显的1725bp大小的hsp60条带，表明经PCR扩增出的hsp60基因片段，成功地插入了原核表达载体pET28a(+)的多克隆酶切位点。

重组质粒DNA经测序得知，重组质粒中插入片段的序列与Genebank中公布的日本血吸虫SJCHGC09129蛋白mRNA完整编码区完全一致，达到100％的吻合度，且与曼氏血吸虫热休克蛋白60的mRNA也有81％的吻合度，可以证明本发明成功地将日本血吸虫hsp60的编码序列插入了原核表达载体，且插入方向正确。

实施例2日本血吸虫hsp60基因原核表达载体的诱导表达

将测序正确的阳性克隆的质粒Sjhsp60-pET28a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取单一菌落，鉴定正确后接种于液体LB培养基中，待达到对数生长期后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为1mM/L)进行诱导表达，分别收集诱导前及诱导后1h、2h、4h及6h的菌液，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳，5％浓缩胶80V电压，12％分离胶120V电压)分析验证。

结果如图2所示，在图2中，M：蛋白质标志物；1：未诱导的菌液；2：诱导后1h；3：诱导后2h；4：诱导后4h；5：诱导后6h。从图2可以看出，诱导前及诱导后各时相，经过SDS-PAGE，其中1条带随着诱导时间的延长而增宽，4h达最大，该条带与目的蛋白大小Mr67000Da相近(日本血吸虫hsp60基因所编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示，其相对分子质量约为62000Da，表达出的产物为包含有部分载体序列的6个组氨酸标签和插入片段Sjhsp60基因所编码的蛋白质的融合体rSjhsp60，该融合体蛋白的相对分子质量约为67000Da)。可以证实，重组质粒在大肠杆菌当中获得了高水平的表达。

实施例3原核表达载体表达产物的纯化

小量诱导重组菌(100ml)，4℃，4000rpm离心15min，收集菌体沉淀，用PBS洗涤后，加入1×结合缓冲液(binding buffer)重悬菌体，反复冻融3次后，超声破碎细胞。将超声后的悬液于4℃，12000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀鉴定其表达形式。由图3可知，重组质粒的表达产物出现在超声后的沉淀中，说明其表达形式为包涵体。在图3中，1：超声后的上清；2：超声后的沉淀；3：纯化后的蛋白。

利用重组表达的融合体蛋白中的组氨酸和镍离子的亲和性可将该融合体蛋白加以纯化，纯化步骤按照Novagen His-tag纯化手册进行。

将沉淀用含6M尿素的1×结合缓冲液溶解，4℃，12000rpm，离心30min，收集上清。用His·Bind树脂纯化表达产物。具体操作如下：

(1)将400μL树脂悬液加入到1.5mL离心管中，低速离心后除去上清。

(2)按以下顺序和次数进行树脂的离子化和平衡。

a.2倍体积灭菌去离子水，2次

b.2倍体积1×离子化缓冲液(charge buffer)，3次

c.2倍体积1×结合缓冲液，2次

(3)加入前述用尿素溶解后的上清，轻柔混匀，孵育5min，2000rpm，离心5min，弃上清。

(4)3倍体积1×结合缓冲液清洗树脂3次。

(5)3倍体积1×冲洗缓冲液(washing buffer)清洗树脂3次。

(6)1倍体积1×洗脱缓冲液(stripping buffer)将目的蛋白从树脂上剥离下来。

由图3可知，表达产物rSjhsp60得到了纯化(见图3第“3”泳道箭头所指的条带)，且纯度较高。

实施例4纯化后表达产物对小鼠的免疫

将6周龄雄性BALB/c小鼠分为两组(实验组和对照组)，每组10只。首次免疫按每只小鼠100μg纯化后的日本血吸虫hsp60(rSjhsp60)与206佐剂混合的乳剂，皮下注射。每隔14天同样剂量进行第二次和第三次免疫。用PBS与206佐剂的混合乳剂以同样方法处理对照组小鼠。

第三次免疫一周后，每只小鼠攻击日本血吸虫尾蚴40条。

感染后42天将两组小鼠剖杀，肝门静脉冲虫，计算减虫率。同时每只小鼠取0.5g肝脏，匀浆后，经氢氧化钾消化后进行肝组织虫卵计数，计算减卵率。通过对减虫率与减卵率的分析，评估本发明重组日本血吸虫hsp60蛋白作为抗原的免疫保护效果。

减虫率＝(1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数)×100％

减卵率＝(1-免疫组平均卵荷数/对照组平均卵荷数)×100％

结果如下表1所示，rSjhsp60实验组的减虫率与减卵率分别为28.76％和24.85％，表明rSjhsp60能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用，本发明重组抗原rSjhsp60具有一定的免疫保护效果。

表1rSjhsp60免疫小鼠的减虫率和减卵率

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>含日本血吸虫基因的重组表达载体及其应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>574

<212>PRT

<213>Schistosoma japonicum

<400>1

Met Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu Arg Gly Ser Leu Val Pro Ala Arg

1               5                   10                  15

Gln Lys Val Val Gln Arg Phe Tyr Ala Lys Glu Val Lys Phe Gly Ala

            20                  25                  30

Asp Ala Arg Ser Ala Met Leu Ile Gly Val Asp Val Leu Ala Asp Ala

        35                  40                  45

Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Ile Ile Glu Ser

    50                  55                  60

Ser Trp Lys Ser Pro Lys Ile Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys

65                  70                  75                  80

Gly Ile Glu Leu Lys Asp Lys Phe Gln Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val

                85                  90                  95

Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr

            100                 105                 110

Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Glu Lys

        115                 120                 125

Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Ile Glu Phe Arg Arg Gly Val Met Leu

    130                 135                 140

Ala Val Asp Ala Val Val Lys Glu Leu Lys Ser Phe Ser Lys Gln Ile

145                 150                 155                 160

Ser Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly

                165                 170                 175

Asp Lys Ala Ile Gly Asp Leu Ile Ala Ser Ala Met Lys Arg Val Gly

            180                 185                 190

Asn Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu His Asp Glu

        195                 200                 205

Leu Glu Phe Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Pro

    210                 215                 220

Tyr Phe Ile Asn Thr Glu Lys Gly Ala Arg Cys Glu Phe Gln Asp Ala

225                 230                 235                 240

Phe Ile Leu Phe Ser Glu Lys Lys Ile Asn Ser Ile Gln Thr Leu Leu

                245                 250                 255

Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gln Gln Lys Arg Pro Leu Leu Ile Ile

            260                 265                 270

Ala Lys Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Arg

        275                 280                 285

Leu Lys Leu Gly Leu Gln Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Lys Val Phe

    290                 295                 300

Gly Asp Asn Arg Glu Lys Tyr Ile Lys Arg Tyr Gly Cys Ser Asn Arg

305                 310                 315                 320

Gly Ile Val Phe Gly Thr Lys Gln Ile Phe Val Gln Val Arg Gly Cys

                325                 330                 335

Thr Thr Ala Arg Phe Gly Thr Cys Phe Arg Ser Cys Asn Asn Lys Arg

            340                 345                 350

Arg Leu Phe Thr Asn Ala Arg Ser Trp Lys Gln Asn Gly His Arg Gln

        355                 360                 365

Thr Tyr Arg His Lys Leu Lys Met Lys Trp Lys Pro Pro Thr Ala Ser

    370                 375                 380

Met Lys Lys Glu Lys Met His Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asn Gly

385                 390                 395                 400

Val Ala Val Ile Lys Val Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu

                405                 410                 415

Lys Lys Asp Arg Tyr Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Ile

            420                 425                 430

Glu Glu Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ile

        435                 440                 445

Pro Val Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp Gln Arg Thr Gly

    450                 455                 460

Val Arg Ile Val Leu Arg Ala Leu Ser Thr Pro Cys Tyr Thr Ile Ala

465                 470                 475                 480

His Asn Ala Gly Val Asn Ala Ser Val Val Val Glu Lys Val Lys Gly

                485                 490                 495

Met Ser Gln Asn Met Gly Tyr Asp Ala Gln Asn Asp Val Tyr Val Asp

            500                 505                 510

Met Ile Glu Ala Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala

        515                 520                 525

Leu Val Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Thr

    530                 535                 540

Val Val Thr Asp Leu Pro Lys Glu Glu Thr Gly Gly Asn Ala Ala Gly

545                 550                 555                 560

Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met

                565                 570

<210>2

<211>1725

<212>DNA

<213>Schistosoma japonicum

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1725)

<400>2

atg tta cga gct cta agt tca ctt cgt ggt agt ttg gtt cca gct aga    48

Met Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu Arg Gly Ser Leu Val Pro Ala Arg

1               5                   10                  15

caa aaa gtt gtt caa agg ttt tat gca aag gaa gtg aag ttc ggg gct    96

Gln Lys Val Val Gln Arg Phe Tyr Ala Lys Glu Val Lys Phe Gly Ala

            20                  25                  30

gac gca aga tca gct atg ttg att ggt gtt gat gta ctg gcg gat gct    144

Asp Ala Arg Ser Ala Met Leu Ile Gly Val Asp Val Leu Ala Asp Ala

        35                  40                  45

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Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Ile Ile Glu Ser

    50                  55                  60

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Ser Trp Lys Ser Pro Lys Ile Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys

65                  70                  75                  80

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Gly Ile Glu Leu Lys Asp Lys Phe Gln Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val

                85                  90                  95

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Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr

            100                 105                 110

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Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Glu Lys

        115                 120                 125

ata agt aaa ggc gct aat cct atc gag ttc cga aga ggt gtt atg ctt    432

Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Ile Glu Phe Arg Arg Gly Val Met Leu

    130                 135                 140

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Ala Val Asp Ala Val Val Lys Glu Leu Lys Ser Phe Ser Lys Gln Ile

145                 150                 155                 160

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Ser Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly

                165                 170                 175

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Asp Lys Ala Ile Gly Asp Leu Ile Ala Ser Ala Met Lys Arg Val Gly

            180                 185                 190

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Asn Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu His Asp Glu

        195                 200                 205

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Leu Glu Phe Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Pro

    210                 215                 220

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Tyr Phe Ile Asn Thr Glu Lys Gly Ala Arg Cys Glu Phe Gln Asp Ala

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Phe Ile Leu Phe Ser Glu Lys Lys Ile Asn Ser Ile Gln Thr Leu Leu

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Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gln Gln Lys Arg Pro Leu Leu Ile Ile

            260                 265                 270

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Ala Lys Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Arg

        275                 280                 285

tta aaa ctg ggc tta cag gtc tgt gca gtc aag gca ccc aag gtt ttc    912

Leu Lys Leu Gly Leu Gln Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Lys Val Phe

    290                 295                 300

ggg gat aat cgc gaa aaa tac att aaa aga tat ggc tgt agc aac agg    960

Gly Asp Asn Arg Glu Lys Tyr Ile Lys Arg Tyr Gly Cys Ser Asn Arg

305                 310                 315                 320

ggt ata gtg ttc ggg acg aag cag ata ttt gtc caa gtt aga gga tgt    1008

Gly Ile Val Phe Gly Thr Lys Gln Ile Phe Val Gln Val Arg Gly Cys

                325                 330                 335

aca act gca aga ttt ggg acg tgt ttc aga agc tgt aat aac aaa aga    1056

Thr Thr Ala Arg Phe Gly Thr Cys Phe Arg Ser Cys Asn Asn Lys Arg

            340                 345                 350

cga ttg ttt act aat gcg agg tcg tgg aaa caa aat gga cat cga caa    1104

Arg Leu Phe Thr Asn Ala Arg Ser Trp Lys Gln Asn Gly His Arg Gln

        355                 360                 365

acg tat cgc cac aaa tta aag atg aaa tgg aag cct cca aca gcg agt    1152

Thr Tyr Arg His Lys Leu Lys Met Lys Trp Lys Pro Pro Thr Ala Ser

    370                 375                 380

atg aaa aaa gaa aaa atg cac gaa cgc ttg gcc aag ttg tca aac ggc    1200

Met Lys Lys Glu Lys Met His Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asn Gly

385                 390                 395                 400

gtc gca gta att aag gtt ggt gga agt agt gaa gta gaa gtt agt gag    1248

Val Ala Val Ile Lys Val Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu

                405                 410                 415

aaa aag gat cga tat act gat gca ctc aat gca acg aga gca gca att    1296

Lys Lys Asp Arg Tyr Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Ile

            420                 425                 430

gag gaa ggc ata gtg cct ggt ggt ggc act gct ttg ctg cga tgc att    1344

Glu Glu Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ile

        435                 440                 445

cct gtc ctg gat acg tta tct acc aag aac gaa gat cag cga aca ggt    1392

Pro Val Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp Gln Arg Thr Gly

    450                 455                 460

gtg cgg att gtt cta cgt gca ctt tca act ccg tgc tat acc att gca    1440

Val Arg Ile Val Leu Arg Ala Leu Ser Thr Pro Cys Tyr Thr Ile Ala

465                 470                 475                 480

cat aac gca ggt gtc aac gcc tct gtt gtc gtt gaa aaa gtc aaa ggt    1488

His Asn Ala Gly Val Asn Ala Ser Val Val Val Glu Lys Val Lys Gly

                485                 490                 495

atg agc cag aat atg ggt tac gat gct caa aat gat gtt tac gtt gat    1536

Met Ser Gln Asn Met Gly Tyr Asp Ala Gln Asn Asp Val Tyr Val Asp

            500                 505                 510

atg atc gag gct ggg att att gac cca act aag gtc gtc aga act gca    1584

Met Ile Glu Ala Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala

        515                 520                 525

ttg gtt gat gca gct ggt gtt gct tcc tta ctc aca act gca gaa acc    1632

Leu Val Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Thr

    530                 535                 540

gtg gtg acg gat tta cca aaa gaa gag acc gga ggc aac gca gca gga    1680

Val Val Thr Asp Leu Pro Lys Glu Glu Thr Gly Gly Asn Ala Ala Gly

545                 550                 555                 560

atg ggt ggg atg gga ggt atg ggt gga atg gga ggc atg atg taa        1725

Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met

                565                 570

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<220>

<221>misc_signal

<222>(4)..(9)

<223>BamH I酶切位点

<400>3

ccgggatcca tgttacgagc tctaagttca             30

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<220>

<221>misc_signal

<222>(4)..(9)

<223>Xho I酶切位点

<400>4

gcgctcgagc atcatgcctc ccattcca               28

Claims (8)

1.一种含日本血吸虫基因的重组表达载体，其特征在于，所述基因是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的日本血吸虫热休克蛋白60基因，所述重组表达载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因插入在空载体pET28a(+)的BamH I和Xho I两个酶切位点之间。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

3.一种包含权利要求1所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。

4.一种日本血吸虫热休克蛋白60的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫热休克蛋白60基因的重组表达载体，所述基因是编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的日本血吸虫热休克蛋白60基因，所述重组表达载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫热休克蛋白60基因插入在空载体pET28a(+)的BamH I和Xho I两个酶切位点之间；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫热休克蛋白60；

纯化诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的日本血吸虫热休克蛋白60还连接有包含6个组氨酸的标签序列。

6.权利要求1所述的重组表达载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

7.权利要求1所述的重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

8.权利要求4所述制备方法生产的日本血吸虫热休克蛋白60在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗中的应用。

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