CN100379863C - 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 - Google Patents
以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100379863C CN100379863C CNB2005100500696A CN200510050069A CN100379863C CN 100379863 C CN100379863 C CN 100379863C CN B2005100500696 A CNB2005100500696 A CN B2005100500696A CN 200510050069 A CN200510050069 A CN 200510050069A CN 100379863 C CN100379863 C CN 100379863C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xho
- double digestion
- thymosin
- bgl
- bamh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 title claims description 21
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 title claims description 15
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 title claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 5
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- ZSZFTYVFQLUWBF-QXEWZRGKSA-N Val-Asp-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N ZSZFTYVFQLUWBF-QXEWZRGKSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 2
- 101500028961 Homo sapiens Thymosin alpha-1 Proteins 0.000 abstract 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 abstract 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 102220023256 rs387907547 Human genes 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 description 1
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- -1 isopropyl- Chemical group 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 1
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生物多肽的制备方法，特别涉及以基因串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法。包括合成两条多聚核苷酸片断、合成片断的连接、扩增、质粒的双酶切、Tα1基因的三次串连、高效表达重组子的构建、工程菌的构建、Tα1多肽六串体在工程菌中的表达、Tα1多肽六串体的纯化和裂解等步骤。本发明应用人工合成的方法，按照大肠杆菌惯用密码子合成Tα1的基因序列，并采用六串体的方法表达，表达产物以包涵体的形式存在于菌内，从而大量表达目的蛋白；工艺简单、操作简便、成本低廉，还能恢复Tα1的天然组成，不影响其生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物多肽的制备方法，特别涉及以基因串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法。
背景技术
胸腺素α1(Thymosin-α1，Tα1)是由28个氨基酸残基组成的多肽，等电点为4.2，无二级结构无二硫键，唯一的修饰是N-末端乙酰化。其氨基酸序列为N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂。它可以使T细胞成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子如白介素-2、γ-干扰素，也可以同时促进白介素-2受体的生成，促使高亲和力的白介素-2受体(IL-2)的生成。
Tα1作为一种免疫增强剂，主要用于免疫缺陷和免疫抑制类疾病。当病人感染某些病毒如HIV、HBV或者癌症以及经过放疗或者化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制甚至破坏，而不能发挥对病毒或癌细胞的正常杀伤作用。Tα1可以恢复T淋巴细胞的功能，促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生，这样就大大增强了免疫细胞的作用，提高了对病毒和癌症的抵抗能力。
Tα1在医疗上的应用主要有以下几个方面：(1)癌症的治疗，已证实对恶性黑色素瘤、肺癌、白血病、鳞状上皮细胞癌、直结肠癌有效。(2)病毒性肝炎HBV的治疗。(3)艾滋病病毒(HIV)的治疗。Tα1也应用于放疗和化疗病人的免疫系统恢复。
Tα1不仅对多种恶性肿瘤、病毒性肝炎、HIV等常见、多发、高死亡率性的疾病有良好的治疗和缓解作用，还在新生儿免疫、老年人的医疗保健等方面的应用具有很大的潜力。
目前，国内制备胸腺α1常用的方法是从动物的胸腺中提取，这种方法的缺点是操作复杂，提取Tα1的纯度不高，且来源受物数量限制。国外制备胸腺素α1常用的方法是化学合成法，该方法的缺点是成本较高且容易造成环境污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，利用基因工程技术，根据Tα1的氨基酸序列，推导并合成其编码核苷酸序列，以串连的方式在大肠杆菌中表达，经包涵体分离纯化后，利用羟胺裂解，得到高纯度的天然人胸腺素α1。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法，包括以下步骤：
(1)将天然人胸腺素α1所包含的28个氨基酸按照大肠杆菌的惯用密码子，翻译成如下序列：
TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAAC
AGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCT
TCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；
(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性内切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性内切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所对应的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性内切酶Bgl II、终止子、核酸限制性内切酶Xho I所对应的核苷酸；
(3)两片断经退火、延伸得到如下一段基因片断：
GTC GAC ATG GGA TCC AAT GGG--84bp-GGC AGA TCT TGA CTC GAG
Val Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg Ser StopLeu Glu
Hind III BamH I Bgl II Xho I
将该片断克隆入pUCm-T中，测序鉴定证明无误后，扩大培养；
(4)提取质粒分为两份，BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4 ligase连接为Tα1二串体；
(5)将该二串体克隆扩大培养，提取质粒分为两份，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4ligase连接为Tα1四串体；
(6)提取二串体质粒，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；提取四串体质粒，用Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片断用T4 ligase连接为Tα1六串体；
(7)将天然胸腺素α1六串体克隆在质粒pET22-b(+)的核酸限制性内切酶Hind III、Xho I位点之间，经酶切、测序鉴定无误，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导下以包涵体形式表达；
(8)分离纯化包涵体得到Tα1六串体蛋白，于37℃、pH4.5条件下，经0.2M的羟胺裂解48h，得到天然人胸腺素α1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明应用人工合成的方法，按照大肠杆菌惯用密码子合成Tα1的基因序列，并采用六串体的方法表达，表达产物以包涵体的形式存在于菌内，从而大量表达目的蛋白；
(2)本发明采用包涵体的形式表达，只需破碎菌体后使用离心沉淀的方法就可以分离、纯化目的蛋白，工艺简单、操作简便、成本低廉。
(3)在Tα1六串体的各单体之间设计有甘氨酸，可以通过羟胺有效的切割分离，并且使单体的N-末端带上乙酰基，恢复Tα1的天然组成，不影响其生物活性。
具体实施方式
以下通过具体实施例1进一步对本发明进行描述。
具体实施例1中以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法前面的准备工作首先包括以下步骤：
(1)将天然人胸腺素α1所包含的28个氨基酸按照大肠杆菌的惯用密码子，翻译成如下序列：
TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAAC
AGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCT
TCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；
(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性内切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性内切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所对应的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性内切酶Bgl II、终止子、核酸限制性内切酶Xho I所对应的核苷酸；
(3)两片断经退火、延伸得到如下一段基因片断：
GTC GAC ATG GGA TCC AAT GGG--84bp-GGC AGA TCT TGA CTC GAG
Val Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg Ser StopLeu Glu
Hind III BamH I Bgl II Xho I
将该片断克隆入pUCm-T中，测序鉴定证明无误后，扩大培养；
前述步骤即对应以下操作步骤：
(1)合成两条多聚核苷酸片断
Th1
GTCGACATGGGATCCAACGGTTCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGAC CTAA
Th2
CTCGAGTCAAGATCTCCCGTTCTCAGCCTCTTCGACAACTTCCTTCTTCTCCTTTAGGTCTTTAGT AGTA
其中带有下划线的部分为相互配对的碱基。
(2)合成片断的连接、扩增
按如下条件进行PCR，以连接、扩增Tα1基因：
PCR各试剂用量： PCR反应条件：
Th1 5ul 94℃ 5min
Th2 5ul 94℃ 30s
dNTP 16ul 60℃ 30s
buffer 10ul 72℃ 30s
Mgcl2 10ul 重复上三步30次
H2O 53ul 72℃ 5min
Taq plus 1ul
(3)合成片断的检测与克隆
将步骤2中的连接片断电泳检测，回收后克隆在pUMc-T载体内并测序检测。
之后的步骤还包括：
(4)质粒的双酶切
步骤2中测序鉴定证明无误的克隆，扩大培养。提取质粒分为两份，BamHI和Xho I双酶切，电泳回收小片段(约120个核苷酸残基)；Bgl II和Xho I双酶切，电泳回收大片段(约2800个核苷酸残基)。
(5)Tα1基因的第一次串连
步骤4中的小片断取3ul，大片断取5ul，加入1ul连接buffer和1ul连接酶，于4℃保温16h；连接产物为Tα1基因两串体。
(6)连接产物的转化及阳性克隆的筛选
将步骤5中的连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，通过铺板、培养、扩增、酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆。
(7)Tα1基因的第二次串连
步骤6中测序鉴定证明无误的克隆，扩大培养。提取质粒分为两份，BamHI和Xho I双酶切，电泳回收小片段(约240个核苷酸残基)；Bgl II和Xho I双酶切，电泳回收大片段(约3000个核苷酸残基)；取小片断3ul，取大片断5ul，加入1ul连接buffer和1ul连接酶。于4℃保温16h，连接产物为Tα1基因四串体。该连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，通过铺板、培养、扩增、酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆。
(8)Tα1基因的第三次串连
提取步骤6中正确克隆的质粒，BamH I和Xho I双酶切，电泳回收小片段(约240个核苷酸残基)；提取步骤7中正确克隆的质粒，Bgl II和Xho I双酶切，电泳回收大片段(约3200个核苷酸残基)；取小片断3ul，取大片断5ul，加入1ul连接buffer和1ul连接酶。于4℃保温16h，连接产物为Tα1基因六串体。该连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，通过铺板、培养、扩增、酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆。
(9)高效表达重组子的构建
提取步骤8中正确克隆的质粒，Hind III和Xho I双酶切，电泳回收后插入pET22-b(+)质粒的Hind III和Xho I位点之间。
(10)工程菌的构建
将步骤9中构建好的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过铺板、培养、扩增、酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆为pET22-b(+)-Tα1/BL21。
(11)Tα1多肽六串体在工程菌中的表达
将步骤10中筛选出的工程菌pET22-b(+)-Tα1/BL21，37℃培养2h至对数生长期，于3mmol/L IPTG的诱导下37℃培养3小时，离心沉淀菌体，加入2xSDS-PAGE上样buffer95℃处理5min，进行SDS-PAGE，染色、脱色后扫面分析，在23kD出有明显的诱导条带，约占菌体总蛋白的10％。
(12)Tα1多肽六串体的纯化
工程菌pET22-b(+)-Tα1/BL21经扩大培养并诱导表达后，离心沉淀；将沉淀悬浮于细胞裂解缓冲液中，在200w的功率下超生破碎15min；破碎后溶液离心回收沉淀；用包涵体洗涤缓冲液洗涤两次；加入包涵体溶解缓冲液置于摇床于200rpm作用过夜，得到Tα1多肽六串体。
(13)Tα1多肽六串体的裂解
在Tα1多肽六串体溶液(浓度为1mg/ml)中加入羟胺使终浓度至0.2M，调pH至4.5，于25℃反应48h，经色普检测并分离得到Tα1多肽。
产品多肽的序列与天然Tα1一致为：
N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C
具体实施例2：
除第(13)步裂解条件为加入羟胺使终浓度至1.0M，调pH至6.0，于37℃反应60h外，其它与具体实施例1相同。
具体实施例3：
除第(13)步裂解条件为加入羟胺使终浓度至2.0M，调pH至7.0，于45℃反应72h外，其它与具体实施例1相同。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将天然人胸腺素α1所包含的28个氨基酸按照大肠杆菌的惯用密码子，翻译成如下序列：
TCTGATGCTGCTGTAGATACTTCTTCTGAGATTACTACTAAAGACCTAAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAAC
AGACTACGACGACATCTATGAAGAAGACTCTAATGATGATTTCTGGATTTCCTCT
TCTTCCTTCAACAGCTTCTCCGACTCTTG；
(2)在天然胸腺素α1序列前面加上核酸限制性内切酶Hind III、蛋氨酸、核酸限制性内切酶BamH I、天冬酰氨、甘氨酸所对应的核苷酸；在天然胸腺素α1序列后面加上甘氨酸、核酸限制性内切酶Bgl II、终止子、核酸限制性内切酶Xho I所对应的核苷酸；
(3)两片断经退火、延伸得到如下一段基因片断：
GTC GAC ATG GGA TCC AAT GGG--84bp-GGC AGA TCT TGA CTC GAG
Val Asp Met Gly Ser Asn Gly Tα1 Gly Arg SerStop Leu Glu
Hind III BamH I Bgl II Xho I
将该片断克隆入pUCm-T中，测序鉴定证明无误后，扩大培养；
(4)提取质粒分为两份，BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4 ligase连接为Tα1二串体；
(5)将该二串体克隆扩大培养，提取质粒分为两份，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片段用T4 ligase连接为Tα1四串体；
(6)提取二串体质粒，用BamH I和Xho I双酶切，回收小片段；提取四串体质粒，用Bgl II和Xho I双酶切，回收大片段；两片断用T4 ligase连接为Tα1六串体；
(7)将天然胸腺素α1六串体克隆在质粒pET22-b(+)的核酸限制性内切酶Hind III、Xho I位点之间，经酶切、测序鉴定无误，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下以包涵体形式表达；
(8)分离纯化包涵体得到Tα1六串体蛋白，于25～45℃、pH4.5～7.0条件下，经0.2～2.0M的羟胺裂解48～72h，得到天然人胸腺素α。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100500696A CN100379863C (zh) | 2005-06-14 | 2005-06-14 | 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100500696A CN100379863C (zh) | 2005-06-14 | 2005-06-14 | 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1724663A CN1724663A (zh) | 2006-01-25 |
| CN100379863C true CN100379863C (zh) | 2008-04-09 |
Family
ID=35924293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100500696A Active CN100379863C (zh) | 2005-06-14 | 2005-06-14 | 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100379863C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101544693B (zh) * | 2008-12-11 | 2012-06-06 | 中国人民解放军第四军医大学 | 重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法 |
| CN102676534B (zh) * | 2012-04-12 | 2014-07-16 | 上海育臣生物工程技术有限公司 | 一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法 |
| CN103789321B (zh) * | 2014-02-24 | 2016-06-08 | 东北制药集团股份有限公司 | 一种重组人胸腺肽α1的制备方法 |
| CN110964117A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-04-07 | 哈尔滨医科大学 | 聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1150602A (zh) * | 1996-05-31 | 1997-05-28 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境研究所 | 人胸腺素α原及其制备方法 |
| CN1258747A (zh) * | 1998-12-30 | 2000-07-05 | 中国人民解放军第四军医大学 | 以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1 |
| CN1532289A (zh) * | 2003-03-20 | 2004-09-29 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工 | 用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法 |
-
2005
- 2005-06-14 CN CNB2005100500696A patent/CN100379863C/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1150602A (zh) * | 1996-05-31 | 1997-05-28 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境研究所 | 人胸腺素α原及其制备方法 |
| CN1258747A (zh) * | 1998-12-30 | 2000-07-05 | 中国人民解放军第四军医大学 | 以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1 |
| CN1532289A (zh) * | 2003-03-20 | 2004-09-29 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工 | 用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 胸腺素alpha-1基因的克隆、表达及其对淋巴细胞增殖的影响. 宫照龙.安徽医科大学硕士学位论文. 2004 * |
| 胸腺素α1串连体基因的克隆表达、产物纯化及其生物学活性研究. 薛晓畅.第四军医大学硕士学位论文. 2001 * |
| 胸腺素α1基因的克隆表达及其生物活性. 石继红等.中国生物化学与分子生物学报，第17卷第3期. 2001 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1724663A (zh) | 2006-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172013B1 (da) | DNA, vektor indeholdende dette DNA, vært transformeret med vektoren,polypeptid indeholdt i DNA'et og salt deraf, aggregat indeholdende polypeptidet samt pharmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet eller aggregatet. | |
| JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| NO165201B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av hybrid munamleukocyttinterferoner paa 165-166 aminosyrer omfattende en subsekvens fra human leukocytt-interferon a og en subsekvens fra human leukocytt-interferon b eller d. | |
| CN106674354B (zh) | 一种鸡干扰素IFN-λ与IFN-α的融合蛋白 | |
| CN100379863C (zh) | 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 | |
| CN1044479C (zh) | 抗凝血酶多肽的制备方法 | |
| CN106939042A (zh) | 一种猪α干扰素及其应用 | |
| CN102286490A (zh) | 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 | |
| CN101376887B (zh) | 猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用 | |
| CN108794638A (zh) | 一种重组牛长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN100436576C (zh) | 一株产生纳豆激酶的枯草芽孢杆菌 | |
| CN109627298B (zh) | 一种具有抗hiv-1作用的重组鞭毛蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN107286255A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101560248A (zh) | 减毒肠毒素c2超抗原突变蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN102827289A (zh) | 猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及应用 | |
| CN102676534B (zh) | 一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法 | |
| CN103012578B (zh) | 一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法 | |
| CN113121672B (zh) | 猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用 | |
| CN108840934B (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN1861635A (zh) | 人胰高血糖素相关肽－2类似物 | |
| CN103937828A (zh) | 一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 | |
| CN100425697C (zh) | 一种人白细胞介素21的核苷酸序列及生产成熟的人白细胞介素21的方法和应用 | |
| CN109851666A (zh) | 一种重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN1258747A (zh) | 以大肠杆菌制备4串体胸腺素α1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI ENTS BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: ZHEJIANG UNIVERSITY Effective date: 20140731 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 310027 HANGZHOU, ZHEJIANG PROVINCE TO: 200120 PUDONG NEW AREA, SHANGHAI |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140731 Address after: 200120, room 2, building 3377, 321, Kang Xin Road, Shanghai, Pudong New Area Patentee after: Shanghai ENTS Biotechnology Co., Ltd. Address before: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Patentee before: Zhejiang University |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HUNAN FANGSHENG YUCHEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI ENTS BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150820 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150820 Address after: 410295, building 4, building 402, building 789, Lu Song Road, hi tech Development Zone, Hunan, Changsha Patentee after: Hunan Sheng Yuchen Biotechnology Co. Ltd. Address before: 200120, room 2, building 3377, 321, Kang Xin Road, Shanghai, Pudong New Area Patentee before: Shanghai ENTS Biotechnology Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201215 Address after: 570316 No. A-8, national high tech Industrial Development Zone, Haikou City, Hainan Province Patentee after: HAINAN DOCTOR PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: Room 402, 4 / F, complex building, 789 lushong Road, high tech Development Zone, Changsha City, Hunan Province Patentee before: HUNAN FANGSHENG YUCHEN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210611 Address after: No. 206, Kaiyuan Avenue, Science City, Guangzhou Economic and Technological Development Zone, Guangdong 510000 Patentee after: GUANGDONG JIDA GENETIC MEDICINE ENGINEERING RESEARCH CENTER Co.,Ltd. Address before: 570316 No. A-8, national high tech Industrial Development Zone, Haikou City, Hainan Province Patentee before: HAINAN DOCTOR PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |