CN110964117A - 聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG‑rTβ4)及其制备方法和应用。该PEG‑rTβ4蛋白是通过用聚乙二醇对重组人胸腺素β4二串体蛋白进行特异性的化学修饰后得到，其中所述的rTβ4是由具有以下连接顺序的基因序列编码：HKCDI基因序列‑胸腺素β4基因序列‑GS Linker GSGSG‑胸腺素β4基因序列‑6*His标签基因序列。其次，本发明还公开了制备上述蛋白的方法，通过该制备方法可获得纯度达90％以上的目的蛋白质，而且还具有成本低、简单、快速、生物活性高等优点。实验证明，该PEG‑rTβ4蛋白具有促进心肌细胞的增殖、迁移、抗凋亡、促进毛发生长、促进血管新生、加速伤口愈合的作用，因此，该PEG‑rTβ4蛋白在心肌梗死后心脏功能恢复、促毛发生长、加速伤口愈合中将具有广泛的应用前景。

Description

聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(简称PEG-rTβ4)，还涉及该蛋白的制备方法和应用。本发明属于医药生物技术领域。
背景技术
人胸腺素β4是一种由43个氨基酸组成的酸性小肽，分子量为5053，等电点为5.1，有较少疏水性氨基酸，以单链形式存在并发挥作用。在物种中高度保守，广泛分布于除红细胞外的大部分细胞中。它参与人体许多重要的生命活动，能够促进伤口愈合，促进毛发生长、抗炎、促进组织修复抗内毒素性休克、促血管生成，维持细胞骨架的动态平衡等；尤其在心血管疾病领域的应用一直被广泛关注。
聚乙二醇(以下简称PEG)是由乙二醇单体分子聚合而成的高分子无毒的亲水性高分子材料，由于其具有良好的生物学性质；所以PEG常被用于对多肽类、蛋白质等生物大分子进行修饰，其修饰的生物类药物因其药效相比未修饰之前得到明显提高，因此很多PEG修饰的生物类药物已取代未修饰之前的药物被广泛应用于临床。
目前人胸腺素β4对于多种创伤性疾病以及心肌梗死后心脏保护作用促进伤口愈合及毛发生长的研究均已进入临床试验阶段。现阶段使用的人胸腺素β4主要来源于化学合成；然而长度为43个氨基酸的多肽化学合成时存在合成效率低，造价高，且环境污染严重，无法大规模生产等缺点。人胸腺素β4的基因工程产品又因其分子量较小，不利于原核表达系统的表达与后期的纯化。在前期研究中，我们参照以往人胸腺素β4利用基因工程方法制备蛋白的方法，克服了其化学合成和原核表达的缺陷；而且采用基因重组技术融合其它功能序列，使该蛋白更具生物学价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(以下简称PEG-rTβ4)及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白，命名为PEG-rTβ4，通过用聚乙二醇对重组人胸腺素β4二串体蛋白进行特异性的化学修饰后得到，其中所述的重组人胸腺素β4二串体蛋白是由具有以下连接顺序的基因序列编码：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列。
其中，优选的，所述的基因序列为根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列。
其中，优选的，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。该序列为根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列，优化前的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
编码所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白的多核苷酸也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白的方法，包括以下步骤：
1)pET-28a(+)-rTβ4的构建
将人胸腺素β4，与HKCDI基因序列、GS linker基因序列、6*His标签基因序列融合形成新的基因序列，连接顺序为：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列，该基因序列经过大肠杆菌密码子偏好性优化后，通过化学合成，然后克隆进入表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a(+)-rTβ4；
2)人胸腺素β4二串体蛋白(rTβ4)的诱导表达
a诱导培养含有重组人胸腺素β4二串体的重组质粒pET-28a(+)-rTβ4的菌液，离心获得菌体；
b对菌体进行裂菌，超声破碎菌体，离心，收集上清液；
c将步骤b得到的上清液溶经无菌微孔滤膜过滤即得到蛋白粗品；
d将步骤c得到蛋白粗品溶液样品经亲和层析柱，获得纯度达90％以上的rTβ4蛋白；
3)聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG-rTβ4)的制备
将步骤d得到的rTβ4蛋白、甲氧基聚乙二醇马来酰亚mPEGn-MAL，n为PEG的分子量范围1000-20000，按质量比1：(5-20)与10-30mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)在PBS(pH8.0)溶液中反应4-10℃，其中优选6-8℃反应过夜；其中，优选的，n在1000-10000时rTβ4蛋白与甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的质量比为1：(5-10)，n在10000-20000时rTβ4蛋白与甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的质量比为1：(10-20)，其中三(2-羧乙基)膦(TCEP)的浓度优选为15-25mmol/L；
4)聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG-rTβ4)的纯化
将步骤3)反应产物经凝胶柱，获得纯度达90％以上的PEG-rTβ4蛋白。
其中，优选的，步骤1)中经过大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列如SEQ IDNO.2所示。
其中，优选的，步骤2)a中，诱导所使用的诱导剂为0.03mM的IPTG；所使用的表达菌株为BL21(DE3)；
其中，优选的，步骤2)b中，所述的裂菌是按照lL菌液离心所得的菌体中加入100mlBinding buffer缓冲液和0.1g溶菌酶；该Binding buffer缓冲液含50mmol/L NaH2PO4，300mmol NaCl 20mmol咪唑以及0.01％v/v Tween80，pH＝8.0。
其中，优选的，步骤d中所用亲和层析柱为镍螯合高流速琼脂糖层析预装柱(IDA)，步骤4)中所用凝胶柱为葡聚糖凝胶G25、G50或G75装载的玻璃层析柱，其中G25用于纯化PEG分子量为1000-6000的PEG-rTβ4蛋白、G50用于纯化PEG分子量为6000-12000的PEG-rTβ4蛋白、G75用于纯化PEG分子量为12000-20000的PEG-rTβ4蛋白。
更进一步的，本发明还提出了所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白在制备用于心肌梗死后心肌细胞保护药物中的应用。以及
所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白在制备促进伤口愈合的药物以及在制备促进毛发生长的药物中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明制备的PEG-rTβ4蛋白具有操作简单、方便易行、实验要求及成本低等优点，实验仅通过一个亲和层析柱和一个凝胶柱即可制备纯度90％以上的PEG-rTβ4蛋白；纯化的PEG-rTβ4蛋白产量高，活性保存好、稳定性高。本发明制备的PEG-rTβ4蛋白具有促进心肌细胞增殖、迁移、抗细胞凋亡等方面作用明显，从而对受损心肌起到保护作用；在动物实验中表明其具有促进伤口愈合，促进毛发生长的作用。
附图说明
图1为重组rTβ4蛋白诱导考染胶图；
图中1、8泳道为不同的蛋白marker；2、3、4、5、6、7泳道为0.2、0.3、0.4mmol/L的IPTG诱导后上清与沉淀中rTβ4蛋白表达情况；
图2为rTβ4蛋白纯化流程图；
图3为rTβ4蛋白纯化后SDS-PAGE胶图；
图中1蛋白marker，2泳道为粗品蛋白上清液，3-8泳道为不同时段的蛋白洗脱样品；
图4为rTβ4蛋白的Western-Blot显影结果图；
图5为PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白纯化流程图；
图6为PEG-rTβ4(n＝12000)蛋白纯化流程图；
图7为PEG-rTβ4(n＝20000)蛋白纯化流程图；
图8为mPEG2000-MAL与rTβ4蛋白反应碘染与考染胶图；
碘染胶图(左)1泳道为蛋白Marker、2泳道为mPEG2000-MAL+rTβ4蛋白物理混合、3泳道PEG-rTβ4蛋白、4泳道rTβ4蛋白，5泳道mPEG2000-MAL；考染胶图(中)1泳道为蛋白Marker、2泳道只含loading、3泳道mPEG2000-MAL、4泳道rTβ4蛋白，5泳道为未纯化的PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白；考染胶图(右)1泳道为rTβ4蛋白，2-5泳道为纯化后的PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白；
图9为mPEG12000-MAL和mPEG20000-MAL和rTβ4蛋白反应考染胶图；
图中1泳道为蛋白Marker、2泳道为泳道rTβ4蛋白、3泳道为未纯化的PEG-rTβ4(n＝12000)蛋白、4泳道为纯化后的PEG-rTβ4(n＝12000)蛋白、5泳道为未纯化的PEG-rTβ4(n＝20000)蛋白、6泳道为纯化后的PEG-rTβ4(n＝20000)蛋白；
图10为rTβ4蛋白MALDI-TOF分子量测定结果图；
图11为PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白MALDI-TOF分子量测定结果图；
图12为DSC/TGA同步分析PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白结果图；
图13为纯化后的不同浓度的rTβ4蛋白(μg/mL)对H9C2细胞增殖的结果图(*P<0.05**P<0.01***P<0.001)；
图14为纯化后的不同浓度的rTβ4及PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白(μg/mL)对H9C2细胞迁移结果图；
图15为对图14中迁移面积进行分析的折线图(左)条形图(右)；
图16A以及16B为细胞凋亡检测流式散点图和流式结果条形图(*P<0.05**P<0.01)；
图17为早期凋亡实验阴性组、阳性组、实验组细胞荧光图；
图18为动物实验(伤口愈合)实验结果图；
图19为动物实验(毛发生长)实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明在详述之前特对一些常用术语进行限定和解释如下：
6.本发明中所提到的重组人胸腺素β4二串体蛋白(以下简称rTβ4)意指无法在大肠杆菌中无法实现高效表达的人胸腺素β4，在融合HKCDI基因序列、GS linker基因序列、6*His标签基因序列的基础上，共同构成新的基因序列，基因序列的连接顺序为：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列，经过密码子偏好性优化后形成行的基因序列，该基因序列通过化学合成后以NcoI(酶切位点CCATG/G为避免移码基因合成时去掉碱基G)和XhoI(C/TCGAG)为酶切位点通过同源重组克隆进入表达载体pET-28a(+)-rTβ4中形成重组质粒；重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达纯化得到rTβ4蛋白。重组后经密码子优化合成的基因序列为：
Figure BDA0002241471150000061
其中：
NcoI和XhoI酶切位点为CCATG、CTCGAG
HKCDI基因序列为
Figure BDA0002241471150000062
GS Linker GSGSG基因序列为
Figure BDA0002241471150000063
6*His标签基因序列为
Figure BDA0002241471150000064
剩余序列为原始人胸腺素β4基因序列经优化后的两段重复序列。
文中所用术语“亲和层析柱”为镍螯合琼脂糖层析预装柱(IDA)具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，不仅有利于保持产品的生物活性，提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。
文中所用术语“凝胶柱”为装载了葡聚糖凝胶(G25)(用于纯化PEG分子量为2000的PEG-rTβ4蛋白)、(G50)(用于纯化PEG分子量为12000的PEG-rTβ4蛋白)、(G75)(用于纯化PEG分子量为20000的PEG-rTβ4蛋白)的玻璃层析柱；
文中的AKTA PrimePlus为通用电气公司生产的小规模蛋白质纯化仪；
文中的列举用来修饰rTβ4蛋白的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEGn-MAL n为2000、12000、20000)。
实施例一人胸腺素β4二串体蛋白(rTβ4)的制备
1、pET-28a(+)-rTβ4的构建
将人胸腺素β4，与HKCDI基因序列、GS linker基因序列、6*His标签基因序列融合，并经过密码子偏好性优化后形成新的基因序列(SEQ ID NO.1所示)，基因序列的连接顺序为：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列，该基因序列通过化学合成后以NcoI(酶切位点CCATG/G为避免移码基因合成时去掉碱基G)和XhoI(C/TCGAG)为酶切位点通过同源重组克隆进入表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a(+)-rTβ4。重组后经密码子优化合成的基因序列为：
Figure BDA0002241471150000071
其中：
NcoI和XhoI酶切位点为CCATG、CTCGAG
HKCDI基因序列为
Figure BDA0002241471150000072
GS Linker GSGSG基因序列为
Figure BDA0002241471150000073
6*His标签基因序列为
Figure BDA0002241471150000074
剩余序列为原始人胸腺素β4基因序列经优化后的两段重复序列。
2、人胸腺素β4二串体蛋白(rTβ4)的诱导表达
本发明的制备的rTβ4蛋白包含以下步骤：
1)将重组质粒pET-28a(+)-rTβ4转入大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化后pET-28a(+)-rTβ4的菌液，接种于液体LB(含有100μg/ml卡那霉素)培养基中，空气摇床37℃震荡培养过夜；
2)次日取过夜培养物以1:100的比例接种于LB(含有100μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃震荡培养，当培养物OD600值达到0.6时，加入IPTG诱导(不同IPTG浓度诱导结果见图1，最终选择0.3mmol/L IPTG用于后续实验)；
3)将诱导后4h的菌液样本加到离心管中，5000rpm 4℃离心5min，弃上清，收集菌体；
4)用Banding buffer漂洗菌体后重悬菌体，加入溶菌酶0.1g/100ml菌体，4℃放置30min；超声破碎收集上清液，重复上述步骤收集上清液，上清液冰上保存，将蛋白粗品用220nm聚碳酸酯微孔滤膜过滤备用；
5)使用AKTA Prime Plus进行rTβ4蛋白纯化，首先用Binding buffer以5个柱体积充分平衡柱子；然后将上一步制备粗品蛋白吸入柱子，用Wash buffer以10个柱体积冲洗柱子；最后用Elution buffer以5个柱体积洗脱柱子上的rTβ4蛋白，收集Elution buffer即为rTβ4蛋白溶液(见图2)；通过收集峰液之后，经SDS-PAGE确定目的蛋白纯度在90％以上(见图3)；用透析装置将纯化的rTβ4蛋白置换为PBS(pH8.0)中，之后用BCA对蛋白进行定量，-20℃保存用于后续实验。
蛋白纯化缓冲液的配制：
Binding buffer：50mmol/L NaH2PO4、300mmol NaCl、20mmol咪唑以及0.01％v/vTween80
Wash buffer：50mmol/L NaH2PO4、300mmol NaCl、50mmol咪唑以及0.01％v/vTween80
Elution buffer：50mmol/L NaH2PO4、300mmol NaCl、500mmol咪唑以及0.01％v/vTween80
PBS：NaCl 8.0g、Na2HPO4 3.58g、KCl 0.2g KH2PO4 0.24g以及0.01％v/vTween80
注：无特殊标注pH值均为8.0
3、Western-Blot检测rTβ4蛋白
Western-Blot检测rTβ4蛋白步骤如下：在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶洗去残余表面电泳液，除去积层胶，按照Bio-Rad电泳仪器说明书，将凝胶靠近阴极一侧、聚偏氟乙烯(PVDF)膜靠近阳极一侧，在转膜缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20％甲醇)中200mA电泳0.5h,将rTβ4蛋白转移至PVDF膜上。电转移结束后，取下PVDF膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HC1,pH7.5、150mM NaCl、0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)中室温封闭2h,TBST室温洗3次，每次5min,加入小鼠抗人His标签单克隆抗体(1:1000稀释)，4℃孵育过夜，TBST室温洗3次，每次5min,再加入HRP标记兔抗小鼠IgG(1:3000稀释)，室温孵育2h,TBST室温洗3次，每次5min,最后用TBST(20mM Tris-HCl,pH7.5、150mM NaCl)洗3次，PVDF膜浸入ECL显色液中，室温避光显色3min，取出TBST室温洗3次，用凝胶成像仪拍照保存实验结果(见图4)，结果显示诱导表达后纯化出的蛋白为rTβ4蛋白。
实施例二聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG-rTβ4)的制备
本发明的制备的PEG-rTβ4(n＝2000、n＝12000、n＝20000)蛋白包含以下步骤：
1、将得到的rTβ4蛋白与甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(以下简称mPEG2000-MAL、mPEG12000-MAL、mPEG20000-MAL)和三(2-羧乙基)膦(以下简称TCEP)按1：1：4、1：15：6、1：40：8(w:w:w)溶于PBS(pH8.0)中，每毫升PBS溶液中含有rTβ4蛋白、mPEGn-MAL、TCEP分别为1mg、1mg、4mg,1mg、15mg、6mg，1mg、40mg、8mg，8℃摇床(200rpm/min)反应过夜；
2、反应产物经透析装置置换为PBS(pH8.0)中，使用AKTA Prime Plus进行PEG-rTβ4蛋白纯化；首先用PBS(pH8.0)以5个柱体积使充分平衡凝胶柱，然后将上一步制备的蛋白溶液吸入柱子，用PBS(pH8.0)收集各峰液蛋白进行鉴定确定PEG-rTβ4蛋白所在峰(见图5、图6、图7)；
3、通过收集峰液之后，经SDS-PAGE通过考马斯亮蓝染色(简称考染)和碘染色法(简称碘染)确定目的蛋白纯度，最终获得纯度达90％以上的PEG-rTβ4蛋白(见图8、图9)。
考马斯亮蓝染色步骤如下：
1、将胶从胶板中取下，去离子水洗去表面电泳液；2、放入50ml染色液；37℃摇床15min，回收染色液，放入脱色液200ml中微波炉加热5min；3、放入自来水重复上述步骤2-3次，待可显示出条带即可，后放入脱色摇床脱色过夜后，背景清晰后，拍照即可。
PEG-rTβ4蛋白的碘染：
原理：PEG可以与碘和氯化钡发生特异性原位显色反应，通过SDS-PAGE分离蛋白和游离PEG，然后通过碘染色法可进行分离游的mPEG2000-MAL和PEG-rTβ4蛋白的分析。实验步骤:1、将SDS-PAGE结果的凝胶用水漂洗3次；2、用5％氯化钡溶液固定30min,固定后水洗2-3次；3、用0.1mol/L碘液染色待显示清晰，更换为去离子水水漂洗至背景清晰；4、用凝胶成像仪拍照保存实验结果。
实施例三rTβ4蛋白和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白MALDI-TOF分子量测定
本实验是将rTβ4蛋白和PEG-rTβ4蛋白冻干粉末邮寄到上海中科新生命生物科技有限公司进行MALDI-TOF分子量测定，结果显示测定结果与预期的rTβ4蛋白和PEG-rTβ4蛋白分子量一致且纯度较高(见图10、图11)。
实施例四rTβ4蛋白和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白差示扫描/热重(以下简称DSC/TGA)同步分析
步骤如下：1、按梅特勒-托利多DSC/TGA同步分析仪操作步骤开启并运行仪器2、打开控制仪器软件点击常规编辑器—实验编辑方法—开始温度设置为30℃终止温度设置为600℃—升温速度10℃/min程序端气体氮气20ml/min；3、打开炉体放入空白坩埚，等待m、HF值稳定后点击运行空白曲线两次；4、运行空白曲线后加入提前称好的样品坩埚(5mg样品)，输入样品名称发送实验；5、保存并分析实验结果。
结果显示mPEG2000-MAL与rTβ4蛋白的成功连接且无游离mPEG2000-MAL(见图12)。
实施例五细胞增殖实验
细胞增殖实验步骤如下：1、实验选取H9C2心肌细胞系，选择对数生长期的细胞进行消化处理；2、以每孔1000个细胞铺入含有10％FBS DMEM高糖培养基的96孔板中；3、铺板后24h对细胞进行处理，每板分两大组为有血清组和无血清组；每组分别设置0、5、10、20μgrTβ4蛋白，选择12、24、48、72h，进行细胞计数；4、实验中个别孔细胞生长趋势不符合总体规律故应舍去，染色选用Hochest33258染细胞核；5、每孔染色前弃去培养基，用温浴过的PBS(pH7.4无0.01％Tween80)清洗后加入100μl无血清DMEM高糖培养基，每孔加入8μl染料；染色30s弃去液体用PBS(pH7.4无0.01％Tween80)清洗三次；6、再加入100μl无血清DMEM高糖培养基，即上机检测用BioTek Cytation 5细胞成像检测系统进行细胞计数并用统计学软件Graphpad prism6.0分析分析实验结果(n＝3)。
结果显示纯化后的rTβ4蛋白活性较高，具有明显的促进细胞增殖的作用(见图13)。
实施例六迁移实验
迁移实验步骤如下：1、将处于对数生长期的H9C2心肌细胞系经胰酶消化后用培养基重悬成单细胞悬液计数；2、细胞铺板于12孔板中，以次日细胞增殖到90％为宜；3、第二天换低浓度无血清培养基，使用200μl枪头垂直对准12孔板的左端中央部位向下平拉形成划痕；4、使用PBS(pH7.4无0.01％Tween80)轻轻洗涤2-3次，洗去划完以后孔板中地养液中遗落少量细胞；5、向孔板中加入无血清培养基，及事先稀释好的蛋白溶液0、1、2、5μg/ml rTβ4蛋白及稀释后的2μg/mL PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白；6、用荧光显微镜明场拍摄给药后不同时间段的细胞图像(见图14)；7、分析迁移面积用image J软件分析划痕处的面积。实验结果处理以每组自身0h为对照用后续时间点减去得到迁移面积，用统计学软件Graphpad prism6.0分析迁移面积(n＝3)。
结果显示rTβ4蛋白和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白活性较高，具有明显的促进细胞迁移的作用，PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白的作用更为明显(见图15)。
实施例七细胞凋亡实验
细胞凋亡实验步骤如下：1、将处于对数生长期的H9C2大鼠心肌细胞系经胰酶消化后用培养基重悬成单细胞悬液计数；2、细胞铺板于12孔板中，以次日细胞增值到到90％为宜；H9C2在缺氧培养箱无血清处理12h诱导H9C2凋亡，12h后加入2μg/mL的mPEG2000-MAL、rTβ4、PEG-rTβ4(n＝2000)，之后在5％CO2培养箱中培养24h后；按照线粒体膜电位检测试制盒JC-1(购自碧云天生物技术有限公司)说明书的处理方法处理细胞，之后用C6流式细胞仪(BD公司)进行流式细胞凋亡检测，并用Graphpad prism6.0分析实验中凋亡细胞比例(n＝3)(见图16A、B)。细胞凋亡的荧光检测步骤如下：1、将处于对数生长期的H9C2心肌细胞系经胰酶消化后，进行细胞爬片，之后按凋亡的流式检测细胞的处理步骤处理爬片后的细胞；2、用荧光显微镜(Leica公司)对玻片进行拍照。
细胞凋亡实验结果显示rTβ4蛋白和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白具有明显的对抗缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用(见图17)。
实施例八动物实验(伤口愈合)
动物实验(伤口愈合)步骤如下：1、用10％水合氯醛对SD大鼠进行腹腔麻醉；2、用75％乙醇将大鼠耳朵和打孔器进行局部消毒清理；3、待乙醇挥干后，用打孔器在大鼠耳廓外缘约0.25cm处，垂直一次完成打孔；4、清理好血渍和残余组织，进行涂抹rTβ4和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白溶液2mg/mL，每侧重复涂抹两次；5、以后每天一次进行涂抹rTβ4和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白溶液，选择0、7、14、21天进行拍照。
实验结果表明纯化出的rTβ4和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白具有促进大鼠耳部毛细血管新生和加速伤口愈合的作用且PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白的作用更为明显(见图18)。
实施例九动物实验(毛发生长)
动物实验(毛发生长)步骤如下：1、用10％水合氯醛给SD大鼠进行腹腔麻醉；2、对SD大鼠背部毛发进行脱毛处理，选用脱毛膏涂抹SD大鼠背部作用时间约10min；3、10min后用干棉花擦去脱毛膏和脱去的毛发；4、用PBS(pH7.4无0.01％Tween80)进一步清理皮肤，进行涂抹rTβ4蛋白和PEG-rTβ4溶液2mg/mL，重复涂抹两次；5、以后每天重复步骤4连续给药1周；6、选择0、3、7天进行拍照。
实验结果表明纯化出的rTβ4和PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白体外给药浓度2mg/mL时，具有促进大鼠毛发生长的作用且PEG-rTβ4(n＝2000)蛋白的作用更为明显(见图19)。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> 聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用
<130> KLPI190554
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 315
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
atgcacaaat gcgacatctc tgacaaaccg gacatggctg aaatcgaaaa attcgacaaa 60
tctaaactga aaaaaaccga aacccaggaa aaaaacccgc tgccgtctaa agaaaccatc 120
gaacaggaaa aacaggctgg tgaatctggt tctggttctg gttctgacaa accggacatg 180
gctgaaatcg aaaaattcga caaatctaaa ctgaaaaaaa ccgaaaccca ggaaaaaaac 240
ccgctgccgt ctaaagaaac catcgaacag gaaaaacagg ctggtgaatc tcaccaccac 300
caccaccact aataa 315
<210> 2
<211> 323
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ccatgcacaa atgcgacatc tctgacaaac cggacatggc tgaaatcgaa aaattcgaca 60
aatctaaact gaaaaaaacc gaaacccagg aaaaaaaccc gctgccgtct aaagaaacca 120
tcgaacagga aaaacaggct ggtgaatctg gttctggttc tggttctgac aaaccggaca 180
tggctgaaat cgaaaaattc gacaaatcta aactgaaaaa aaccgaaacc caggaaaaaa 240
acccgctgcc gtctaaagaa accatcgaac aggaaaaaca ggctggtgaa tctcaccacc 300
accaccacca ctaataactc gag 323
<210> 3
<211> 315
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
atgcataaat gcgatattag tgataaaccg gatatggccg agattgagaa atttgataag 60
tcaaaattga agaaaacgga aactcaggaa aagaacccgt tgccttcaaa agagaccatc 120
gaacaggaaa agcaggcggg ggaaagcggg tctgggtctg ggagtgataa accggatatg 180
gccgagattg agaaatttga taagtcaaaa ttgaagaaaa cggaaactca ggaaaagaac 240
ccgttgcctt caaaagagac catcgaacag gaaaagcagg cgggggaaag ccatcatcat 300
catcatcatt aataa 315

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白，命名为PEG-rTβ4，其特征在于，通过用聚乙二醇对重组人胸腺素β4二串体蛋白进行特异性的化学修饰后得到，其中所述的重组人胸腺素β4二串体蛋白是由具有以下连接顺序的基因序列编码：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白，其特征在于，所述的基因序列为根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列。
3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白的多核苷酸，优选的，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种制备如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)pET-28a(+)-rTβ4的构建
将人胸腺素β4，与HKCDI基因序列、GS linker基因序列、6*His标签基因序列融合形成新的基因序列，连接顺序为：HKCDI基因序列-胸腺素β4基因序列-GS Linker GSGSG-胸腺素β4基因序列-6*His标签基因序列，该基因序列经过大肠杆菌密码子偏好性优化后，通过化学合成，然后克隆进入表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a(+)-rTβ4；
2)人胸腺素β4二串体蛋白(rTβ4)的诱导表达
a诱导培养含有重组人胸腺素β4二串体的重组质粒pET-28a(+)-rTβ4的菌液，离心获得菌体；
b对菌体进行裂菌，超声破碎菌体，离心，收集上清液；
c将步骤b得到的上清液溶经无菌微孔滤膜过滤即得到蛋白粗品；
d将步骤c得到蛋白粗品溶液样品经亲和层析柱，获得纯度达90％以上的rTβ4蛋白；
3)聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG-rTβ4)的制备
将步骤d得到的rTβ4蛋白、甲氧基聚乙二醇马来酰亚mPEGn-MAL，n为PEG的分子量范围1000-20000，按质量比1：(5-20)与10-30mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)在PBS(pH8.0)溶液中反应4-10℃，其中优选6-8℃反应过夜；其中，优选的，n在1000-10000时rTβ4蛋白与甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的质量比为1：(5-10)，n在10000-20000时rTβ4蛋白与甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的质量比为1：(10-20)，其中三(2-羧乙基)膦(TCEP)的浓度优选为15-25mmol/L；
4)聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白(PEG-rTβ4)的纯化
将步骤3)反应产物经凝胶柱，获得纯度达90％以上的PEG-rTβ4蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中经过大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)a中，诱导所使用的诱导剂为0.03mM的IPTG；所使用的表达菌株为BL21(DE3)；
步骤2)b中，所述的裂菌是按照lL菌液离心所得的菌体中加入100ml Binding buffer缓冲液和0.1g溶菌酶；该Binding buffer缓冲液含50mmol/L NaH2PO4，300mmol NaCl20mmol咪唑以及0.01％v/vTween80，pH＝8.0。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤d中所用亲和层析柱为镍螯合高流速琼脂糖层析预装柱(IDA)，步骤4)中所用凝胶柱为葡聚糖凝胶G25、G50或G75装载的玻璃层析柱，其中G25用于纯化PEG分子量为1000-6000的PEG-rTβ4蛋白、G50用于纯化PEG分子量为6000-12000的PEG-rTβ4蛋白、G75用于纯化PEG分子量为12000-20000的PEG-rTβ4蛋白。
9.权利要求1-3任一项所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白在制备用于心肌梗死后心肌细胞保护药物中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白在制备促进伤口愈合的药物以及在制备促进毛发生长的药物中的应用。
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