CN101544693A - 重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素α1(Tα1)，其连接方式为：Tα1－Gly－Ser－Tα1，合成胸腺素α1二串体基因，构建了胸腺素α1二串体基因表达载体，使无法在大肠杆菌中直接表达的胸腺素α1以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达。纯化的胸腺素α1二串体蛋白具有生物学活性，可以促进小鼠淋巴细胞增殖，抑制肿瘤细胞株增殖，并显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。为胸腺素α1的进一步研究和广泛应用奠定基础。

Description

重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原核表达、纯化及鉴定，特别涉及胸腺素α1(Tα1)二串体蛋白及其制备方法。

背景技术

1、胸腺素α1的生物化学特性

1.1 胸腺素家族

胸腺素主要是由胸腺产生，最初由Goldstein自胎牛胸腺蛋白提取液中制备得到，含40多种多肽成分，根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，划分为α、β、γ三个区：α区pI<5，β区pI在5～7之间，γ区pI>7。α族胸腺素包括胸腺素α、前胸腺素α和旁胸腺素α。胸腺素α1(Tα1)是前胸腺素α的N末端的28个氨基酸片段，其产生是由于溶酶体门冬酰内肽酶选择性裂解位于前胸腺素原α序列中的Asn28-Gly29。

1.2 胸腺素α1的化学结构

胸腺素α1是氨基端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽激素，分子量为3108，等电点PH为4.2。胸腺素α1结构高度保守，氨基酸序列为：NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。

化学构象研究表明，胸腺素α1是一种线性多肽，在疏水性环境中显示具有2个特征性的区域：其第5～8残基间是β转角，第17～24残基间是α螺旋。

2 胸腺素α1的生理功能研究进展

2.1 胸腺素α1与免疫学功能

胸腺素α1在体内外可以诱导T细胞的分化和成熟，并能拮抗环磷酰胺或CD3单抗诱导的T细胞凋亡，增强T细胞介导同种或自身淋巴细胞反应能力，增强机体免疫应答功能。并且增多IFN-γ、IL-2及IL—2R的产生。胸腺素α1还能影响NK前体细胞的募集，增强其杀伤活性，并且可以活化巨噬细胞和树突状细胞，纠正免疫抑制及免疫缺陷，从而提高机体的免疫力。并且具有双向性免疫调节效应，在感染病例中，可以减轻细胞因子所致炎性损害，改善感染导致的高代谢状态。

2.2 胸腺素α1与癌症

研究发现胸腺素α1可以诱导肿瘤细胞在胞膜上合成MHCI类分子，增加APC的数量，一定程度的恢复被抑制的细胞免疫。并通过上调癌细胞p53、Bax表达，抑制抗凋亡基因Bcl-2表达诱导多种癌细胞株凋亡，抑制部分癌细胞株DNA合成期。实验室及临床治疗中胸腺素α1与手术、放化疗药物或其他细胞因子联合应用，可以明显加强疗效，减少不良反应，抑制肿瘤细胞的生长并延长生存期。

2.3 胸腺素α1与造血功能

胸腺素α1在正常鼠及荷瘤鼠中均能刺激骨髓造血，刺激小鼠骨髓集落形成，通过上调各种克隆刺激因子如MSCF、GMCSF、GCSF和IL-3，明显增加总克隆数和单克隆型，恢复造血机能。

2.4 胸腺素α1与神经内分泌系统

实验发现，胸腺素α1能在下丘脑及垂体水平影响促肾上腺皮质激素、促乳素、促甲状腺素和促黄体生长激素的分泌，此影响的程度随Tα1在特异作用区的浓度而异。胸腺素α1参与海马神经元兴奋性突触传递，并能影响中枢神经系统中神经分泌细胞的功能。此外，胸腺素α1还证明能够阻止化疗患者神经毒性的发生。

2.5 胸腺素α1与抗氧化

胸腺素α1可以减弱果糖诱导的脂肪变性大鼠模型的脂质过氧化反应，并改善其自由基防御系统的缺陷。使老年人减少的外周血淋巴细胞数，E花环百分率、T细胞增加，提高萎缩后的胸腺水平，起到免疫刺激和调节作用。

3 胸腺素α1的应用前景

3.1 治疗肿瘤

作为生物反应调节剂，胸腺素α1能够以恢复T细胞的功能并促进成熟T细胞的增殖和细胞因子及其受体的产生，从而增强机体对肿瘤的免疫应答能力；修饰肿瘤细胞，以诱导强烈的宿主免疫反应；可减轻化疗放疗的副作用。除此之外，近期研究显示，高剂量胸腺素α1本身还可以抑制肿瘤生长和诱导瘤细胞凋亡，延长生存期。并且大量文献报道，胸腺素α1大剂量使用时无发热及过敏反应，无血液系统及肾脏毒性，不良反应及其轻微。因此，给高剂量应用和肿瘤晚期病人、高恶性程度肿瘤患者的临床应用提供了可能。

3.2 防治病毒感染

机体感染病毒5～10天后胸腺明显萎缩，胸腺功能低下，机体T细胞普遍减少，免疫功能低下。使用胸腺素α1后可以加快胸腺细胞的补充和成熟，加速T细胞的中和抗体反应恢复并促进成熟T细胞的增殖，促进细胞因子及其受体的产生，从而增强体内免疫细胞的作用，提高对病毒的抵抗能力，因此，Tα1能够用于抗乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病毒感染等的治疗。最近有报道，Tα1已经开始被用作流感和乙肝疫苗的佐剂使用。

3.3 治疗感染与促进创伤愈合

感染后促炎因子如TNFα、IL-6升高，同时伴抗炎因子如IL-10等下降，导致炎症介质和抗炎症介质的失衡。应用胸腺素α1后，细胞因子变化加快，TNFα、IL-6下降，IL-10上升，使炎症介质和抗炎症介质的失衡得以纠正。胸腺素α1可减轻高代谢状态，阻止蛋白质分解，保存蛋白质，从而减缓血总蛋白和清蛋白下降的程度。并可增强内皮细胞的形态分化，加速皮下模型的血管发生，促进单核细胞和内皮细胞的趋化作用。提示可能用于创伤愈合、骨折修复以及消化性溃疡等的治疗，减轻炎症反应，并加快愈合速度。

4 胸腺素α1原核表达的研究

虽然胸腺素α1有着广泛的应用前景，但由于其分子太小，难于直接在大肠杆菌中表达。目前用于实验室及临床试验的胸腺素α1多为化学合成品，价格昂贵；而从哺乳动物组织中提取胸腺素α1，产量较低而且纯度低免疫源性强，使其应用受到限制，如何以更经济的方法获取此多肽显得非常重要。

石继红等将用重组四串体胸腺素α1基因构建融合表达载体pThioHisA-Tα1，转化宿主菌TOP10。诱导后融合蛋白得到了表达，用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解，再经离子交换层析可纯化出胸腺素单体，融合蛋白和单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力，与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。

Liang Zhou等构建重组六串体胸腺素α1表达质粒pET28a(+)-Tα1⑥，将其转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后表达胸腺素α1六串体蛋白，并经羟氨裂解后凝胶层析获得纯化的胸腺素α1单体，试验证明纯化产物具有刺激脾细胞增殖的活性。

Yuhui Chen等用大肠杆菌M15表达带His标签的重组胸腺素α1，IPTG诱导得到的蛋白经镍柱亲和纯化后，得到的纯化产物MTT试验证实可以促进淋巴细胞的增殖和分化。

以上方法虽然都能够获得有活性的重组蛋白，但是仍存在诸多的缺点，采用化学裂解法以获得胸腺素α1单体的工艺，往往后期的纯化工艺非常复杂；带有His标签的重组蛋白纯化工艺需要昂贵的镍柱亲和纯化，大大增加了成本，不适于工业化生产；而且His标签影响了重组蛋白在临床试验的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法，本发明将胸腺素α1以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且分离具有生物学活性的胸腺素α1二串体蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。

为了实现上述目的，本发明重组的胸腺素α1二串体蛋白，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素α1(Tα1)，其连接方式为：Tα1-Gly-Ser-Tα1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该重组胸腺素α1二串体蛋白的重组核苷酸是用BamH I酶切位点连接2段胸腺素α1的氨基酸，在5’端加入Nde I酶切位点，3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，其连接方式为：Nde I酶切位点-Tα1基因-BamH I酶切位点-Tα1基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；重组胸腺素α1二串体核苷酸构建于表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tα1②，所述的pET-22b(+)-Tα1②是通过Nde I酶切位点和Sal I酶切位点将质粒pET-22b(+)与权利要求3所述的重组胸腺素α1二串体核苷酸双酶切连接。

重组胸腺素α1二串体蛋白的制备方法，按照以下步骤：

1)构建胸腺素α1二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tα1②

a)胸腺素二串体基因(Tα1②)的设计与合成

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素α1的氨基酸序列转化为cDNA序列，用BamH I酶切位点连接2段胸腺素α1的cDNA序列，再在5’端加入Nde I酶切位点，3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，合成胸腺素α1二串体基因，其核苷酸序列如下所示：

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划线部分分别为Nde I、Sal I酶切位点，人工合成上述胸腺素α1二串体基因基因；

b)胸腺素α1二串体表达载体pET-22b(+)-Tα1②的构建

用Nde I和Sal I双酶切pET-22b(+)质粒回收大片段，Nde I和Sal I双酶切胸腺素α1二串体Pmd18-T-Tα1②重组质粒回收小片断；回收的大、小片断用T4连接酶连接构成胸腺素α1二串体表达载体pET-22b(+)-Tα1②；重组质粒pET-22b(+)-Tα1②转化BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌提取质粒，经酶切鉴定获得预期173bp大小的插入片段，DNA测序结果显示与所合成序列相符，pET-22b(+)-Tα1②重组质粒构建成功；

2)胸腺素α1二串体蛋白的表达

重组胸腺素α1二串体质粒pET-22b(+)-Tα1②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜；次日以1∶100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入0.1mM IPTG诱导4h后12000rpm离心20min收菌，-20℃保存；

3)胸腺素α1二串体蛋白的纯化

a)按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；溶菌酶裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH4)₂SO₄至60％饱和度，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清；

b)收集的上清过A液平衡后的疏水柱，用B液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集含胸腺素α1二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50～100倍于其体积的C液透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液充分平衡的阴离子交换层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰，对该洗脱峰用50～100倍于其体积的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)液进行透析24h，中间更换PBS液三到四次；透析后用0.22μm滤膜过滤除菌，即得到目的蛋白胸腺素α1二串体蛋白；

所述的A液为：20mM Tris-HCl pH7.5、60％(NH4)₂SO₄、1mM EDTA；B液为：20mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA；C液为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，pH5.0，1mM EDTA；D液为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液pH5.0，1M NaCl，1mM EDTA。

重组胸腺素α1二串体蛋白，应用于抗肿瘤药物、免疫增强剂、抗病毒药物、造血刺激剂的制备。

用免疫印迹的半定性分析对胸腺素α1二串体蛋白的鉴定与鼠抗胸腺素α1抗血清特异性结合，说明胸腺素α1二串体蛋白表达成功。

胸腺素α1二串体蛋白的体外生物学活性检测按照经典的小鼠脾淋巴细胞增殖实验MTT法进行，对肿瘤细胞株的体外抑制试验采用MTT法；结果表明，与标准品胸腺素α1相比，胸腺素α1二串体蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸腺素α1刺激组；胸腺素α1二串体蛋白可抑制HL-60、B16、S180、HepG-2、M1这5种瘤株的增殖，且等摩尔量的胸腺素α1二串体蛋白比标准品胸腺素α1有更强的抑制作用。

胸腺素α1二串体体内活性检测，B16荷瘤小鼠随机分为4组，分别采用生理盐水(对照组)、高、低剂量胸腺素α1二串体(试验组)以及化学合成多肽(标准组)腹腔注射，隔天测量瘤体积，干预12天后将小鼠摘眼球取血处死，统计瘤重。胸腺素α1二串体蛋白给药后，高剂量组有显著抑瘤效果(与生理盐水对照组相比P<0.01)，中剂量组也有抑瘤作用(与生理盐水对照组相比P<0.05)，且胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，有更强的抑瘤作用。

与现有技术相比：

本发明构建了胸腺素α1二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tα1②，转染宿主经诱导后便可高效表达目的蛋白的，诱导后菌体的裂菌上清经盐析、疏水作用层析和离子交换作用层析，可得到纯度大于95％的目的蛋白；其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产，为实现胸腺素α1的药学用途鉴定了基础。

纯化的胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，胸腺素α1二串体蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸腺素α1刺激组，可以用做免疫系统增强药物来应用。

胸腺素α1二串体蛋白可抑制可以抑制肿瘤细胞株增殖并抑制荷瘤小鼠HL-60、B16、S180、HepG-2、M1这5种瘤株肿瘤生长的增殖，且等摩尔量的胸腺素α1二串体蛋白比标准品胸腺素α1有更强的抑制作用，具有抗肿瘤药物的应用前景。

附图说明

图1是重组胸腺素α1二串体质粒pET-22b(+)-Tα1②酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是重组胸腺素α1二串体质粒pET-22b(+)-Tα1②的测序结果图；

图3是胸腺素α1二串体蛋白的诱导表达和纯化聚丙烯酰胺电泳图；

图4是胸腺素α1二串体蛋白的免疫印迹鉴定图；

图5是用MTT法测定胸腺素α1二串体蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Excel统计图；

图6是用MTT法测定胸腺素α1二串体蛋白对瘤株的半数有效剂量Excel统计图；

图7是肿瘤体积生长曲线统计图；

图8是肿瘤组织大体照片。

具体实施方式

本发明所采用的技术方案是：构建pET-22b(+)-Tα1②原核表达载体，将胸腺素α1以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，用Western blot、脾淋巴细胞增殖实验测定其活性表明分离出具有生物学活性的胸腺素α1二串体蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。此外，体外试验证明纯化的胸腺素α1二串体可以抑制HL-60、B16、S180、HepG-2、M1等肿瘤细胞的增殖；用纯化的胸腺素α1二串体干预B16荷瘤小鼠，可以显著抑制肿瘤生长，其效果优于化学合成品。

上述方案具体按照以下步骤进行：

1)构建胸腺素α1二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tα1②

a)胸腺素二串体基因(Tα1②)的设计与合成

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素α1的氨基酸序列转化为cDNA序列，用BamHI酶切位点连接2段胸腺素α1的cDNA序列，再在5’端加入Nde I酶切位点，3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，合成胸腺素α1二串体基因，其核苷酸序列如下所示：

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划线部分分别为Nde I、Sa l I酶切位点，送北京奥科生物技术有限责任公司合成上述胸腺素α1二串体基因基因。

b)表达载体pET-22b(+)-Tα1②的构建

用Nde I和Sal I双酶切pET-22b(+)质粒回收大片段(5.4kb)，Nde I和Sal I双酶切Pmd18-T-Tα1②重组质粒回收小片断(174bp)；回收的大、小片断用T4连接酶连接构成表达载体pET-22b(+)-Tα1②；重组质粒pET-22b(+)-Tα1②转化BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌。对菌体提取质粒后Nde I和Sal I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定；如图1重组质粒pET-22b(+)-Tα1②的酶切电泳图所示，图中泳道1：DNA marker；泳道2：Nde I和Sal I双酶切重组质粒pET-22b(+)-Tα1②；泳道2显示经酶切鉴定获得预期174bp大小的插入片段。提取质粒后DNA测序，经过比较得到插入片段Tα1②的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，与所设计序列比较，结果显示正确，参见图2。

至此，pET-22b(+)-Tα1②重组质粒构建成功。

2)胸腺素α1二串体蛋白的表达

重组质粒pET-22b(+)-Tα1②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜；次日以1∶100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入0.01mM IPTG诱导4h后12000rpm离心20min收菌，-20℃保存。

3)胸腺素α1二串体蛋白的纯化

a)按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；溶菌酶裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH4)₂SO₄至60％饱和度，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清；

收集的上清液过A液平衡后的疏水柱苯基琼脂糖凝胶6FF(PhenylSepharose 6 Fast Flow，high sub，Pharmacia公司)，用B液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集含胸腺素α1二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50～100倍于其体积的C液进行透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液充分平衡的阴离子交换(Q琼脂糖凝胶FF，Q Sepharose Fast Flow，Pharmacia公司)层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰，对该洗脱峰用50～100倍于其体积的0.01MPBS(磷酸盐缓冲液)液进行透析24h，中间更换PBS液三到四次。透析后用0.22μm滤膜过滤除菌，即得到目的蛋白胸腺素α1二串体蛋白；所述的A为：20mM Tris-HCl pH7.5、60％(NH4)₂SO₄、1mM EDTA；B为：20mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA；C为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、pH5.0，1mM EDTA；D为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液pH5.0，1M NaCl，1mM EDTA。

4)胸腺素α1二串体蛋白的诱导表达和纯化结果鉴定

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测，参见图3；图中M：蛋白质marker；泳道1：未诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②全菌蛋白电泳；泳道2：0.01mMIPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②1h全菌蛋白电泳；泳道3：0.01mM IPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②2h全菌蛋白电泳；泳道4：0.01mMIPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②3h全菌蛋白电泳；泳道5：0.01mMIPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②4h全菌蛋白电泳；泳道6：裂菌上清；泳道7：裂菌沉淀；泳道8：硫酸铵盐析上清；泳道9：疏水作用纯化目的蛋白；泳道10：阴离子交换作用纯化目的蛋白；电泳结果显示，IPTG诱导后目的蛋白表达，且诱导后4小时表达量最高，如泳道1-5所示；采用本发明所述纯化方法可以成功纯化目的蛋白，得到纯度大于95％的目的蛋白，如泳道8-10所示。

5)胸腺素α1二串体蛋白的免疫印迹鉴定

对诱导前后的全菌分别进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20％甲醇)中100V恒压电泳50分钟，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl，0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min，加入鼠抗胸腺素α1抗血清(按1:200稀释)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，再加入HRP-兔抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，按1:5000稀释)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBS(20mM Tris-HClpH7.5，150mM NaCl)洗3次，NC膜浸入DAB(3’，3’-二甲基联苯胺)显色液中，室温避光显色1min，蒸馏水冲洗终止反应。参见图4，图中泳道M：proteinmarker；泳道1：0.01m MIPTG诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1②4h；泳道2：未诱导BL21/pET-22b(+)-Tα1；结果显示，0.01mM IPTG诱导后重组蛋白胸腺素α1二串体表达，且可胸腺素α1二串体与鼠抗胸腺素α1抗血清特异性结合。

6)胸腺素α1二串体蛋白体外生物学活性检测

将两只BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心)颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠沥干，置于无菌纸上，在小鼠左腹侧中部剪开小口，取出脾脏，置于不锈钢滤网上，滤网置于盛有10ml 10％ FCS RPMI 1640液的培养皿上方，用注射器针芯轻轻研压脾脏，并用培养液反复淋洗，收集脾细胞悬液；

取4个10ml离心管，每管加入5ml小鼠淋巴细胞分离液后，再缓慢加入脾细胞悬液2.5ml，离心(1500rpm×20min)后吸出淋巴细胞层，用10％FCS RPMI 1640培养液洗涤细胞一次，离心(1500rpm×10min)后倾倒上清液，加入5ml 10％ FCS RPMI 1640培养液重悬细胞并计数，调整细胞密度为2×10⁶细胞/ml，加入ConA，使其终浓度为2.5μg/ml；按4×10⁵细胞/孔铺96孔细胞培养板。

将96孔板置37℃ 5％ CO₂培养箱培养6h，再分别加入胸腺素α1二串体蛋白及标准品胸腺素α1(日达仙)，使其终浓度为1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM，对照组加入等量的0.01M的PBS(磷酸盐缓冲液)，每组设3个复孔，继续培养72h后加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃ 5％ CO₂培养箱培养4h，离心(2000rpm×10min)后小心吸弃上清，加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，10min后在波长570nm处读数，此实验重复3次，计算增殖率结果。如图5所示，各个浓度的胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，均可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化，且胸腺素α1二串体蛋白刺激后细胞的增殖率高于标准品胸腺素α1刺激组，说明胸腺素α1二串体蛋白相比标准品胸腺素α1有更高的生物学活性。

7)对肿瘤细胞株的体外抑制试验

HL-60、B16、S180、HepG-2、M1细胞常规传代，取生长良好的对数生长期细胞，调细胞数为5×10⁴/ml，100ul/孔铺96孔板。细胞充分贴壁后，分别加入胸腺素α1二串体蛋白及标准品胸腺素α1(日达仙)，设置浓度梯度，对照组加入等量的PBS，每浓度设3个复孔，继续培养24h后加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃ 5％ CO2培养箱培养4h，离心(2000rpm×10min)后小心吸弃上清，加入150μl DMSO，10min后在波长570nm处读数，此实验重复3次，计算半数有效剂量结果。如图6所示，结果说明胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，均可抑制这5种瘤株的增殖，且等摩尔量的胸腺素α1二串体蛋白比标准品胸腺素α1有更强的抑制作用。

8)胸腺素α1二串体体内活性检测

取对数生长期B16细胞，胰酶消化后离心收集并调整细胞数，按5×10⁵/只给C57小鼠背部皮下接种B16细胞。接种10天后肿瘤长出，按照大小随机分为4组，分别采用生理盐水(对照组)、高、低剂量胸腺素α1二串体(试验组)以及化学合成多肽(标准组)腹腔注射，每日给药，隔天测量瘤体积，结果如图7所示。干预12天后将小鼠摘眼球取血处死，统计瘤重。如图8所示，胸腺素α1二串体蛋白给药后，高剂量组有显著抑瘤效果(与生理盐水对照组相比P<0.01)，中剂量组也有抑瘤作用(与生理盐水对照组相比P<0.05)，且胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，有更强的抑瘤作用。

采用免疫印迹法证明胸腺素α1二串体蛋白可与鼠抗胸腺素α1抗血清特异性结合，说明胸腺素α1二串体蛋白具有预期的胸腺素α1的空间构象。

纯化的胸腺素α1二串体蛋白与标准品胸腺素α1相比，胸腺素α1二串体蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸腺素α1刺激组，可以用做免疫系统增强药物来应用。

胸腺素α1二串体蛋白可抑制可以抑制肿瘤细胞株增殖并抑制荷瘤小鼠HL-60、B16、S180、HepG-2、M1这5种瘤株肿瘤生长的增殖，且等摩尔量的胸腺素α1二串体蛋白比标准品胸腺素α1有更强的抑制作用，具有抗肿瘤药物的应用前景。

核苷酸和氨基酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法

<160>3

<210>1

<211>58

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys

1               5                  10                15                 20

Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu

21              25                 30                35                 40

Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn

41              45                 50                55            58

<210>2

<211>174

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tctgatgcag cggttgacac cagctcggaa atcaccacca aagacctgaa agagaagaaa  60

gaggtggtgg aagaagcgga gaacggatcc agcgatgcgg cggttgacac cagctcggaa  120

atcaccacca aagacctgaa agagaagaaa gaggtggtgg aagaagcgga gaac        174

<210>2

<211>189

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag  60

aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc  120

tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac  180

tagaagctt                                                         189

Claims (6)

1、一种重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素α1(Tα1)，其连接方式为：Tα1-Gly-Ser-Tα1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、如权利要求1所述的重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、如权利要求2所述的重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，该重组胸腺素α1二串体蛋白的重组核苷酸是用BamHI酶切位点连接2段胸腺素α1的氨基酸，在5’端加入Nde I酶切位点，3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，其连接方式为：Nde I酶切位点-Tα1基因-BamH I酶切位点-Tα1基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4、如权利要求3所述的重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，所述的重组胸腺素α1二串体核苷酸构建于表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tα1②，所述的pET-22b(+)-Tα1②是通过Nde I酶切位点和Sal I酶切位点将质粒pET-22b(+)与权利要求3所述的重组胸腺素α1二串体核苷酸双酶切连接。

5、权利要求1所述的重组胸腺素α1二串体蛋白的制备方法，其特征在于，其制备方法按照以下步骤：

1)构建胸腺素α1二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tα1②

a)胸腺素二串体基因(Tα1②)的设计与合成

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素α1的氨基酸序列转化为cDNA序列，用BamH I酶切位点连接2段胸腺素α1的氨基酸序列，再在5’端加入Nde I酶切位点，3’端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，合成胸腺素α1二串体基因，其核苷酸序列如下所示：

catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag  60

aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc 120

tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac 180

tagaagctt；                                                      189

划线部分分别为Nde I、Sal I酶切位点，人工合成上述胸腺素α1二串体基因基因；

b)胸腺素α1二串体表达载体pET-22b(+)-Tα1②的构建

用Nde I和Sal I双酶切pET-22b(+)质粒回收大片段，Nde I和Sal I双酶切胸腺素α1二串体Pmd18-T-Tα1②重组质粒回收小片断；回收的大、小片断用T4连接酶连接构成胸腺素α1二串体表达载体pET-22b(+)-Tα1②；重组质粒pET-22b(+)-Tα1②转化BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养后收菌提取质粒，经酶切鉴定获得预期173bp大小的插入片段，DNA测序结果显示与所合成序列相符，pET-22b(+)-Tα1②重组质粒构建成功；

2)胸腺素α1二串体蛋白的表达

重组胸腺素α1二串体质粒pET-22b(+)-Tα1②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，37℃恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37℃培养过夜；次日以1∶100的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入0.1mM IPTG诱导4h后12000rpm离心20min收菌，-20℃保存；

3)胸腺素α1二串体蛋白的纯化

a)按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；溶菌酶裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH4)₂SO₄至60％饱和度，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清；

b)收集的上清过A液平衡后的疏水柱，用B液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集含胸腺素α1二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50～100倍于其体积的C液透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液充分平衡的阴离子交换层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5～10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰，对该洗脱峰用50～100倍于其体积的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)液进行透析24h，中间更换PBS液三到四次；透析后用0.22μm滤膜过滤除菌，即得到目的蛋白胸腺素α1二串体蛋白；

所述的A液为：20mM Tris-HCl pH 7.5、60％(NH4)₂SO₄、1mM EDTA；B液为：20mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA；C液为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，pH5.0，1mM EDTA；D液为：20mM柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液pH 5.0，1M NaCl，1mM EDTA。

6、权利要求1所述的重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，胸腺素α1二串体蛋白应用于抗肿瘤药物、免疫增强剂、抗病毒药物、造血刺激剂的制备。

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