CN102533911B - 人胸腺素β4二串体蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种人胸腺素β4二串体蛋白质的制备方法。通过该制备方法可获得纯度达98％以上的目的蛋白质，所获得的人胸腺素β4二串体蛋白质具有生物学活性；通过增殖实验、迁移实验测定该蛋白质活性，结果表明，人胸腺素β4二串体蛋白质可促进细胞的增殖与迁移，其活性优于化学合成单体；且该方法仅使用一个层析柱就完成了目的蛋白的分离纯化，步骤简单、快速、成本低，为人胸腺素β4的进一步研究和广泛应用奠定基础。

Description

人胸腺素β4二串体蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及重组人胸腺素β4二串体目的蛋白的制备工艺。

背景技术

胸腺素β4是由43个氨基酸残基组成的多肽，在哺乳动物中高度保守。与胸腺素原或类胸腺素不同，胸腺素β4是胞浆蛋白而非核蛋白，并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys结构区域。其氨基酸序列如下：AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES。胸腺素β4广泛分布于各组织、器官和细胞中，与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切，还可抗炎，促进血管生成、创伤愈合、毛囊发育，修复受损的心肌。

虽然胸腺素β4有着广泛的应用前景，但由于其分子太小，难于直接在大肠杆菌中表达。目前用于实验室及临床试验的胸腺素β4多为化学合成品，价格昂贵；而从哺乳动物组织中提取Tβ4，过程复杂而且产量较低，使其应用受到限制，如何以更经济的方法获取此多肽显得非常重要。

Tsuji Y等用大肠杆菌高效表达了胸腺素β4与TNF构成的嵌合体蛋白，在适当的酸性环境中将二者之间的Asp-Pro桥切开，胸腺素β4从嵌合体蛋白中释放，经过纯化便可得到较多的胸腺素β4蛋白。

陈妍柯等将胸腺素β4基因片段克隆入质粒pLDH4的EcoR V和Hind III位点之间，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5，诱导后的目的蛋白经硫酸铵盐析技术、Source RPC反相层析柱和Q Sepharose HP阴离子交换柱纯化，得到的N端融合5个氨基酸(HKCDI)，可提高E-玫瑰花环结花率并能够促进淋巴细胞的增殖和分化。

贾琪等构建重组表达质粒pET28a(+)-Tβ4，将其转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后表达带6×His标签的融合蛋白，并经镍柱一步亲和层析即获得纯化，CAM试验证明His₆-Tβ4蛋白有促进毛细血管生成的活性。

XK Li等构建重组表达质粒pTXB-Tβ4，将其转化大肠杆菌ER 2566，IPTG诱导得到的融合蛋白经一步亲和纯化、DTT自动水解后，得到的胸腺素β4C端融合5个氨基酸(LEGSS)，不仅可以促进淋巴细胞的增殖和分化，而且可以促进伤口愈合。

发明内容

本发明的目的是提供一种人胸腺素β4二串体蛋白的制备方法，本发明的制备方法步骤简单，快速可靠，成本低，仅仅使用了一个层析柱就完成了纯化过程，且纯度达到98％以上。此方法制备的人胸腺素β4二串体蛋白具有生物学活性，促进HUVECs(人脐静脉内皮细胞)的增殖、迁移，活性优于化学合成的单体。

在本发明的详述之前，应当将一些常用术语进行限定和解释，如下：

所用的术语“人胸腺素β4以二串体蛋白”意指将无法在大肠杆菌中直接表达的人胸腺素β4以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，利用大肠杆菌偏爱密码子，合成人胸腺素β4全长基因，结合PCR技术构建了人胸腺素β4二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导表达得到人胸腺素β4二串体蛋白。其DNA序列为：

CATATG AGT GAT AAA CCG GAT ATG GCC GAG ATT GAG AAA TTT GATAAG TCA AAA TTG AAG AAA ACG GAA ACT CAG GAA AAG AAC CCG TTGCCT TCA AAA GAG ACC ATC GAA CAG GAA AAG CAG GCG GGG GAA AGCGGATCC AGT GAT AAA CCG GAT ATG GCC GAG ATT GAG AAA TTT GATAAG TCA AAA TTG AAG AAA ACG GAA ACC CAG GAA AAG AAC CCG TTGCCT TCA AAA GAG ACC ATC GAA CAG GAA AAG CAG GCG GGG GAA AGCTAG GTCGAC。

划线部分分别为Nde I、BamH I和Sal I酶切点。

所用的术语“疏水作用层析”(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来(见图1)。

所用的术语“Phenyl Sepharose ^TM 6Fast Flow”是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用，如图2。特别的，PhenylSepharose 6Fast Flow(high sub)和Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)意指取代度大约为每ml介质含40μmol苯基和20μmol苯基。

所用的术语“硫酸铵缓冲液”意指含硫酸铵的上样缓冲液，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配给之间发生结合。

本发明的人胸腺素β4二串体蛋白的制备方法，包含以下步骤：1)诱导培养含有重组人胸腺素β4二串体蛋白质的菌，离心获得菌体；2)加入裂菌缓冲液对菌体进行裂菌，破碎细胞，离心，收集上清液；3)将步骤2)得到的上清液溶解在硫酸铵缓冲液中，再离心；4)上清液上样于一个疏水层析柱，收集各峰液进行鉴定，确定目的蛋白质所在峰；最终获得纯度达98％以上的目的蛋白质。

步骤1)中，诱导所使用的诱导剂为0.01mM的IPTG，具体使用的菌体为是本室构建的重组人胸腺素β4二串体表达的菌体，所述菌为大肠杆菌BL21。

步骤2)中，菌体和裂菌缓冲液的比例为1g菌体加10ml裂菌缓冲液，所述裂菌缓冲液为STE裂菌缓冲液，该裂菌缓冲液由100mM NaCl、1mM EDTA、pH 8.0的20mM Tris-HCl组成。再利用超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心、收集上清。

步骤3)中，所述硫酸铵缓冲液为含饱和度为50％硫酸铵的20mM Tris-HCl缓冲液。

步骤4)中，所述层析柱为Phenyl Sepharose 6Fast Flow层析柱。即将上清上样于Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)疏水柱，收集各峰液，经SDS-PAGE鉴定后确定二串体所在峰，其纯度可达98％以上。

经HPLC纯度鉴定获得活性高于98％的人胸腺素β4二串体蛋白。再将该蛋白质经过除菌处理用于细胞增殖和细胞迁移试验。除菌的具体操作过程为：将目的蛋白质装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析24～36h，中间换液2～3次，用0.22μm滤膜过滤除菌既得。通过增殖实验和迁移实验测定其活性，结果表明，人胸腺素β4二串体蛋白可促进细胞的增殖与迁移，其活性优于化学合成单体。因此，本发明制备获得的目的蛋白质可应用于促进细胞增殖和促进细胞迁移。

细胞增殖和细胞迁移试验的具体操作过程为：

a)MTT法测细胞增殖

将HUVECs细胞接种于96孔板，加入不同浓度的人胸腺素β4蛋白(Tβ4)和人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)，继续培养一定时间，然后加入MTT继续培养4h，弃去培养液，加入DMSO，490nm波长处读数。

b)Transwell迁移实验

将含有HUVECs细胞的培养基加入到Transwell小室，下室加入含有不同浓度的人胸腺素β4蛋白(Tβ4)和人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)的培养基中。孵箱培养一定时间后，取出上层小室，用棉签试去小室内的细胞，固定，染色，显微镜下观察微孔滤膜外侧细胞。

附图说明

图1所示为疏水作用层析的基本原理。

图2为Phenyl Sepharose^TM 6Fast Flow结构示意图。

图3所示为不同的硫酸铵饱和度所获得的目的蛋白质的SPS-PAGE电泳图，泳道1：蛋白marker；泳道2：40％硫酸铵上清；泳道3：40％硫酸铵沉淀；泳道4：50％硫酸铵上清；泳道5：50％硫酸铵沉淀；泳道6：60％硫酸铵上清；泳道7：60％硫酸铵沉淀。

图4为目的蛋白质经过疏水层析柱分离后的纯化情况，A图：1：穿过峰；2：目的蛋白洗脱峰；3，4：杂蛋白洗脱峰；B图：泳道1：蛋白marker；泳道2：上样；泳道3：穿过峰；泳道4：目的蛋白；5，6：杂蛋白洗脱峰。

图5所示为目的蛋白质的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鉴定，A图：泳道1：蛋白marker；泳道2：未经诱导的重组菌；泳道3：经诱导的重组菌；B图：泳道1：未经诱导的重组菌；泳道2：经诱导的重组菌。

图6为人胸腺素β4二串体蛋白HPLC纯度鉴定图。

图7所示为MTT增殖实验结果。

图8所示为Transwell迁移实验结果，A图：1：空白对照；2：1μg/ml Tβ4；3：1μg/ml Tβ4②；4：10μg/ml Tβ4；5：10μg/ml Tβ4②；B图：为Transwell迁移实验结果柱状分析图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明作详细的描述。

本次发明依次包括下述步骤：

一、人胸腺素β₄二串体蛋白的细菌细胞破坏

诱导培养含有重组人胸腺素β4二串体蛋白质的工程菌BL21/pET-22b(+)-Tβ₄②，诱导剂为低浓度IPTG(0.01mM)，离心获得菌体。

按1g菌体加10ml STE裂菌缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，100mMNaCl，1mM EDTA)的比例将菌体重悬，约15g，在冰浴中超声裂解菌体，功率300W，工作时间5s，间歇时间10s，全程时间30min，离心(12000rpm×20min，4℃)，收集上清。

二、人胸腺素β₄二串体蛋白的纯化

将步骤一得到的上清(约150ml)，常温溶解在含饱和度分别为40％、50％、60％硫酸铵的20mM Tris-HCl缓冲液中，尽量避免气泡产生，之后再缓慢搅拌30min，离心(12000rpm×20min，4℃)，目的是促进蛋白对疏水配基的结合，收集离心后上清进行电泳后，选择饱和度为50％的硫酸铵缓冲液(见图3)。用0.45μm滤膜过滤后，将其用A液：20mM Tris-HCl pH 7.5，50％(NH₄)₂SO₄充分平衡后的Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)(Pharmacia公司)层析柱纯化，用B液：20mMTris-HCl pH 7.5，负盐梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰进行分析，人胸腺素β₄二串体蛋白在目的峰1中，纯度达98％以上(见图4)。

依据本发明得到的人胸腺素β₄二串体蛋白的主要指标的鉴定方法如下：

1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(见图5A)：

取200μl待鉴定样品加入200μL2×载样缓冲液混匀，沸水中煮5min，离心(12000rpm×5min)，取10μl上清进行15％SDS-PAGE，上样后电压为80V约30min，样品进入分离胶后电压升至120V约1.5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2h，脱色直至背景清洗后进行胶的保存。

2、Western-Blot检测产物(见图5B)：

在SDS-PAGE结束后，拆下凝胶，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液(25mM Tris、192mM Glycine、20％甲醇)中100V恒压电泳1h，将蛋白转移至NC膜上。电转移结束后，取出NC膜，洗涤液TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mMNaCl、0.05％Tween-20)清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中室温封闭1h，TBST室温洗3次，每次5min，加入小鼠抗人Tβ₄单克隆抗体(1∶500)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，再加入HRP-羊抗小鼠IgG(1∶3000)，室温孵育1h，TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBST(20mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl)洗3次，NC膜浸入DAB显色液中，室温避光显色1min，蒸馏水冲洗终止反应.

3、HPLC纯度鉴定

用流动相(20mM Tris-HCl pH 7.5)平衡TSK-Gel PW3000色谱柱至基线平稳，流速为0.5ml/min，取20μl蛋白样品上样，用流动相洗脱，检测波长为280nm，记录并分析结果(见图6)。

4、人胸腺素β₄二串体蛋白的生物活性测定

a)MTT法测细胞增殖

将HUVECs细胞以每孔3000接种于96孔板，5％CO2，37℃孵箱培养，待贴壁后加入不同浓度的Tβ4和Tβ4②继续培养48h。然后加入MTT 20μl/孔(5mg/ml)后继续培养4h，弃去培养液，每孔加入DMSO150μl，10min后在波长490nm处读数。由结果知，人胸腺素β4蛋白(Tβ4)和人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)均可促进HUVECs细胞的增殖，且Tβ4②刺激后的细胞增殖率高于Tβ4，说明Tβ4②有与Tβ4相同的活性且高于化学合成单体(见图7)。

b)Transwell迁移实验

将HUVECs细胞常规消化，终止消化后离心收集细胞沉淀，用无血清的RPMI 1640重悬，调整细胞数至1×10⁶/ml。取100μl加入Transwell小室(8μm，24well)。下室加入600μl含有不同浓度Tβ4和Tβ4②的无血清的RPMI 1640。在5％CO₂，37℃孵箱培养4h后，取出上层小室，用棉签试去小室内的细胞，4％多聚甲醛固定，DAPI染色，荧光显微镜下观察微孔滤膜外侧细胞，每个样本选取10个视野进行细胞计数，取平均值表示(*为P＜0.5，**为P＜0.01)。微孔滤膜外侧细胞即为受刺激后迁移的细胞，由结果知，人胸腺素β4蛋白(Tβ4)和人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)均可促进HUVECs细胞迁移，且Tβ4②刺激后的迁移率高于Tβ4，说明Tβ4②有与Tβ4相同的活性且高于化学合成单体(见图8)。

5、本发明的效果如下：

a)工程菌BL21/pET-22b(+)-Tβ₄②经低浓度IPTG(0.01mM)诱导后便可高效表达目的蛋白的，诱导后菌体的超声裂解上清经疏水作用层析可得到纯度大于98％的目的蛋白。

b)本发明工艺简单，快速，可靠且纯度高，成本低，仅仅使用了一个层析柱就完成了纯化过程。

c)纯化的人胸腺素β₄二串体蛋白与标准品人胸腺素β₄均可促进HUVECs的增殖和迁移且在低剂量便可优于单体，如1-10μg/ml。

序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>人胸腺素β4二串体蛋白的制备方法

<130>2011

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>45

<212>PRT

<213>人胸腺素β4蛋白质

<400>1

AlaCys Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys

1                5                        10                    15

Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser

              20                     25                      30

Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser

         35                      40                     45

<210>2

<211>279

<212>DNA

<213>人胸腺素β4二串体蛋白质的基因序列

<400>2

catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaag    60

aaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaag    120

caggcggggg aaagcggatc cagtgataaa ccggatatgg ccgagattga gaaatttgat    180

aagtcaaaat tgaagaaaac ggaaacccag gaaaagaacc cgttgccttc aaaagagacc    240

atcgaacagg aaaagcaggc gggggaaagc taggtcgac                           279

Claims (1)

1.一种重组人胸腺素β4二串体蛋白质的制备方法，其特征在于，该制备方法包含以下步骤：

1）诱导培养含有重组人胸腺素β4二串体蛋白质的工程菌BL21/pET-22b(+)-Tβ4②，诱导剂为0.01 mM的IPTG，离心获得菌体；

2）按1 g菌体加10 ml STE裂菌缓冲液的比例将菌体重悬, 所述STE裂菌缓冲液由100 mM NaCl、1 mM EDTA、pH 8.0的20 mM Tris-HCl组成；在冰浴中超声裂解菌体，功率300 W，工作时间5 s，间歇时间10 s，全程时间30 min，4℃下以12000 rpm的速度离心20 min，收集上清；

3）将步骤2）得到的上清，常温溶解在含饱和度分别为40%、50%、60%硫酸铵的20 mM Tris-HCl缓冲液中，之后再缓慢搅拌30 min，4℃下以12000 rpm的速度离心20 min；

4）收集离心后上清进行电泳后，选择饱和度为50%的硫酸铵缓冲液，用0.45μm滤膜过滤后，将其用A液：20 mM Tris-HCl pH 7.5，50% (NH4)₂SO₄充分平衡后的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow low sub 层析柱纯化，用B液：20 mM Tris-HCl pH 7.5，负盐梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰进行分析，最终获得纯度达98%以上的目的蛋白质。

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