CN112341545A

CN112341545A - 新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112341545A
Application number: CN202110020890.2A
Authority: CN
Inventors: 姜毅楠; 张晓慧
Original assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明提供一种新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用。本发明通过对新冠病毒S和N重组融合蛋白的基因序列进行设计，选择最优的片段进行整合，再通过人源HEK293细胞系统重组表达融合蛋白，经过纯化后对融合蛋白的分子量、纯度进行检测，最后利用融合蛋白制成新冠病毒抗体胶体金检测试纸条/试剂盒。与单独使用S蛋白或N蛋白制备的胶体金检测试纸条相比，该重组融合蛋白制备的胶体金检测试纸条具有更高的灵敏度和更低的漏检率。此外，本发明提供的新冠病毒重组融合蛋白可广泛应用于不同平台技术的新冠抗体检测试剂盒开发，如胶体金、荧光免疫层析、化学发光和酶联免疫等。

Description

新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒，即“SARS-CoV-2 (2019-nCoV)”，于2019年首次被发现，与2002年的SARS冠状病毒和2012年的MERS冠状病毒同属于β冠状病毒属，是目前已知的第七种能感染人的冠状病毒。新型冠状病毒肺炎的传染性强、传播速度快、致死率较高，给世界公共卫生安全带来巨大威胁。

新型冠状病毒由四种结构蛋白（棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白）以及RNA核酸链组成。其中棘突蛋白（Spike Glycoprotein，S蛋白）位于新冠病毒膜表面，能够结合人的血管紧张素转换酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2），促进病毒包膜和宿主细胞膜的融合，进而介导病毒感染人的呼吸道上皮细胞，是新冠病毒最重要的表面膜蛋白，也是新冠疫苗及中和抗体设计与开发的热门靶点。S蛋白胞外域由S1和S2两个亚基组成，S1亚基主要包含有受体结合区（Receptor Binding Domain，RBD），负责识别宿主细胞的受体ACE2，S2亚基含有膜融合过程所需的基本元件，能够促进病毒与宿主细胞膜的融合。核衣壳蛋白（Nucleocapsid Protein，N蛋白）是冠状病毒中含量最丰富且序列最保守的结构蛋白，具有较强的免疫原性。

核酸检测是目前新冠肺炎确诊的“金标准”，但核酸检测有很大的局限性，例如当前普遍应用的鼻咽拭子采样有时难以采集到病毒，再加上试剂本身的敏感度问题，核酸检测可能会出现漏检。机体在感染新冠病毒后能够产生针对病毒抗原的特异性抗体，因此可通过检测抗体来确诊病毒性传染病以及进行流行病学调查。新冠病毒抗体检测作为新冠肺炎确诊的重要辅助方式，具有实验环境要求低、操作简便、检测时间短等优点，可与核酸检测相互补充以提高诊断准确率，有助于国家对疫情整体形势进行判断和追踪。因此，研制高灵敏度、高特异性的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对于疫情的防控和溯源具有重要意义。

针对新冠肺炎产生的特异性IgM抗体主要为S蛋白，而IgG抗体可以是N蛋白和S蛋白，目前商业化的抗体检测试剂盒主要以N蛋白或S蛋白为抗原检测样本中的新冠病毒抗体。相较于单一抗原，通过基因工程技术将S蛋白和N蛋白的优势表位进行整合，将重组表达出融合蛋白进行新冠抗体检测试剂盒的开发，可提高检测试剂盒的灵敏度，降低漏检率，进一步提升抗体检测试剂盒的准确率。

发明内容

本发明的目的是提供一种新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种新冠病毒重组融合蛋白，其为：

i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供编码所述重组融合蛋白的核酸分子。

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供所述重组融合蛋白的制备方法，包括：构建含有编码所述重组融合蛋白的核酸分子的重组表达载体，转染HEK293细胞后对细胞进行体外培养，从细胞培养液中分离纯化目的蛋白。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为pCAGGS。

第五方面，本发明提供一种新冠病毒抗体检测试剂，所述检测试剂中含有所述的重组融合蛋白。

第六方面，本发明提供新冠病毒抗体胶体金检测试纸条，所述试纸条由样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2±0.5mm。

所述金标垫上包被有重组融合蛋白-胶体金复合物；NC膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有抗人二抗，所述质控线包被有羊抗鼠二抗。

优选地，所述样品垫为玻璃纤维素材质。

进一步地，所述金标垫的制备方法包括：向每1000微升的胶体金溶液中加入16±0.5微升0.2M K₂CO₃溶液，然后加入20±0.5微克所述重组融合蛋白，室温密闭混匀反应30±5min，加入100微升10%BSA，封闭反应30±5min；然后于4℃ 10000转/分离心20min，弃上清，收集胶体金颗粒沉淀，用30微升PB缓冲液复溶，得到金标溶液；然后按照2μL/cm喷量，将金标溶液均匀喷到金标垫上，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4±0.5h；其中，所述胶体金溶液的浓度为0.01%，胶体金颗粒粒径大小为40nm；所述PB缓冲液中含有1% BSA、0.5%PEG20000、2%海藻糖和0.5% Triton X-100。

优选地，所述检测线和质控线上包被的抗体浓度为1mg/mL。

优选地，所述背板为PVC板。

上述胶体金检测试纸条的检测原理为：利用捕获法原理，对抗原进行胶体金标记，并在NC膜上包被抗人二抗，当加入新冠病毒抗体时，抗体和标记的抗原结合后，层析迁移到NC膜上，并和抗人二抗结合，形成复合物，产生肉眼可见颜色反应，也可以通过胶体金分析仪检测到。

第七方面，本发明提供所述重组融合蛋白在制备新冠病毒抗体检测试剂、试纸条或试剂盒中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明采用人源HEK293细胞表达系统，获得具有完整翻译后修饰的重组融合蛋白。

（二）与单独使用S蛋白或N蛋白制备的胶体金检测试纸条相比，该重组融合蛋白制备的胶体金检测试纸条具有更高的灵敏度，大大降低了漏检率。

（三）本发明提供的新冠病毒重组融合蛋白可广泛应用于不同平台技术的新冠抗体检测试剂盒开发，如胶体金、荧光免疫层析、化学发光和酶联免疫等。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中新冠病毒重组融合蛋白电泳图。其中，M为蛋白Marker，R为还原条件（加入DTT），NR为非还原条件（不加DTT）。

图2为本发明较佳实施例中新冠病毒重组融合蛋白HPLC图。

图3为本发明较佳实施例中单独使用S蛋白的胶体金试纸条（A）、单独使用N蛋白的胶体金试纸条（B）和使用新冠病毒重组融合蛋白的胶体金试纸条（C）用于新冠病毒阳性血清样品检测的结果。图中Neg代表健康人阴性血清、No.1~No.9代表9例新冠确诊患者的阳性血清。

具体实施方式

本发明提供一种具有更高灵敏度，方便用于新冠抗体检测试剂盒开发的重组融合蛋白，该重组融合蛋白比单独的S蛋白抗原或N蛋白抗原具有更高的灵敏度，降低了漏检率。

本发明首先对新冠病毒S和N重组融合蛋白的基因序列进行设计，选择最优的片段进行整合，再通过人源HEK293细胞系统重组表达融合蛋白，经过纯化后对融合蛋白的分子量、纯度进行检测。最后利用融合蛋白制成抗体检测试剂盒，并与单独使用S蛋白或N蛋白的抗体检测试剂盒进行比较。

本发明还提供新冠病毒重组融合蛋白的制备方法，首先将新型冠状病毒的S蛋白和N蛋白的优势表位区段构建成一个融合表达抗原；然后通过密码子优化去除稀有密码子、提高密码子偏好性、调整GC含量，获得优化后基因序列，最终获得高效表达的重组可溶性融合蛋白。

本发明采用人源HEK293细胞表达系统，对融合抗原蛋白进行表达。

为了获得纯度高的抗原蛋白，本发明利用分子筛系统对人源293细胞表达的重组融合蛋白进行纯化，并鉴定纯化后重组融合蛋白的分子量和纯度。其中，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）进行分子量的检测，通过高效液相色谱技术（HPLC）分析蛋白的纯度。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW，MolecularCloning: a Laboratory Manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中S蛋白抗原在NCBI上的参考序列编号为P0DTC2，N蛋白抗原在NCBI上的参考序列编号为P0DTC9。

载体pCAGGS购自MiaoLingPlasmid。

实施例1 新冠病毒重组融合蛋白的基因序列设计与合成

首先将新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段(R319-H519)和N蛋白优势表位区段（M1-R209）串联构建成一个融合表达抗原；然后通过密码子优化去除稀有密码子、提高密码子偏好性、调整GC含量，获得优化后基因序列，最终获得高效表达的重组可溶性融合蛋白（SEQID NO:1）。

新型冠状病毒S蛋白优势表位区段的基因序列如SEQ ID NO:3所示，新型冠状病毒N蛋白优势表位区段的基因序列如SEQ ID NO:4所示。通过基因合成的方法将SARS-CoV-2 S和N蛋白优势表位的核苷酸序列进行拼接，在S蛋白优势表位序列的5’端加上编码MERS-S蛋白信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES)的核苷酸序列。新冠病毒重组融合蛋白的核酸序列如SEQID NO:2所示。

实施例2利用人源293细胞表达系统制备新冠病毒重组融合蛋白

1、构建表达载体：合成编码串联SARS-CoV-2 S蛋白中RBD氨基酸序列(R319-H519)和N蛋白N端氨基酸序列（M1-R209）的核苷酸序列，3’端加上编码6个组氨酸的核苷酸序列后，再在3’端加上终止密码子，所得核苷酸序列插入到pCAGGS载体EcoRI和XhoI酶切位点之间，其起始密码子上游含有Kozak序列gccacc。

2、将测序正确的重组表达质粒转化入人源293细胞进行表达：在37℃、120rpm和5%CO₂的培养环境中，1L转瓶中种子细胞以1×10⁶个细胞/ ml至300ml，加入含有300微克过滤灭菌的DNA的转染混合液，培养48h后收获细胞。

实施例3 新冠病毒重组融合蛋白的纯化

1、HEK293T细胞培养特定时间后收获上清，细胞上清通过0 .22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片。

2、将细胞培养上清液循环流穿镍亲和柱 (Histrap)，4℃过夜。用缓冲液A( 50mMTris，150mM NaCl，pH8.0)洗涤树脂，以除去非特异结合蛋白。最后用缓冲液B(50mM Tris,150mM NaCl，pH 8.0，250mM咪唑)将目的蛋白从树脂上洗脱下来，并以30K截留(30Kcutoff)浓缩管将洗脱液浓缩至5ml以内。

3、将浓缩后的目的蛋白通过Superdex200 Hiload 16/60柱子(GE)，进行分子筛层析，进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0。经过分子筛层析，只在洗脱体积80mL附近有1个主峰。收集主峰组分进行后续分析。

新冠病毒重组融合蛋白的分子量确定：

（1）配制样品处理液（加样缓冲液）：还原型加样缓冲液(125mM Tris，50% Glycerin，2mM EDTA，4% SDS，0.3mM Bromophenol Blue，pH7.5，200mM DTT)和非还原型加样缓冲液（125mM Tris，50% Glycerin，2mM EDTA，4% SDS，0.3mM Bromophenol Blue，pH7.5）；配制1×运行缓冲液（NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer）。

（2）在蛋白样品中按照1:1体积比加入加样缓冲液。加入还原型加样缓冲液的样品，在100℃高温密封加热10min，加入非还原型加样缓冲液的样品，不需要进行加热，混匀后直接上样即可。

（3）使用12%浓度的聚丙烯酰胺凝胶（NuPAGE™ 12% Bis-Tris Protein Gels，1.0mm，10-well）和标准分子量蛋白Maker：Pierce™ Unstained Protein MW Marker，将凝胶按照正确的方向组装到电泳槽，加入1×运行缓冲液，小心拔出样品孔的梳子。

（4）将处理好的样品按照顺序加入到凝胶的样品孔中，盖上电泳槽盖，接上电源，设置运行电压和时间，进行电泳。

（5）跑完电泳后拆下凝胶，进行考马斯亮蓝染色，并扫描电泳结果，结果见图1。

新冠病毒重组融合蛋白的纯度鉴定：

(1)仪器：安捷伦1260；

(2)柱子：分子筛柱，TSKgel G2000SW（TOSOH，Cat. No. 008540）；

(3)流动相：0.2M Na₂HPO₄，1% IPA，pH 7.0，0.05% NaN₃；

(4)流速：0.5 mL/min（柱压约46 Bar）；

(5)平衡柱子：用流动相在0.5 mL/min下对柱子平衡1h以上，检查基线和噪音，确保基线平稳，才可以进样。

(6)进样：将蛋白样品加入到样品瓶中，放入到样品盘设定好的指定位置，设定进样程序和对应的进样体积，运行。

(7)样品通过进样器进入到柱子，由于分子筛原理，根据分子量大小差异，样品中不同分子量大小的组分则在不同时间出峰，根据峰面积，计算蛋白中组分的纯度，结果见图2。

实施例4 新冠病毒重组融合蛋白的胶体金检测

1、胶体金试纸条的组成：试纸条由样品垫，金标垫，NC膜，吸水垫和PVC板组成，与常规胶体金检测卡组成一致，试纸条宽度为3mm，长度6cm。

2、样品垫预处理：所用样品垫为玻璃纤维材质，需要选择一个合适的缓冲液体系，并加入保护剂以及表面活性剂和防腐剂等，实验中选择PBS缓冲液体系，加入0.5%牛血清白蛋白、0.2%Triton X-100和0.1%PC-300，浸泡样品垫后，过夜烘干备用。

3、金标垫预处理：若采用冻金工艺，则无需处理金标垫。本发明选择采用喷金工艺，需要对金标垫进行预处理，实验中选择PB缓冲液体系，加入0.5%牛血清白蛋白、0.2%Triton X-100和0.1%PC-300，再加入0.5%大分子骨架蛋白PVA-124，浸泡垫子后，过夜烘干备用。

4、金标垫的制备方法如下（新冠病毒重组融合蛋白的标金）：向每1000微升的胶体金溶液中加入16微升0.2M K₂CO₃溶液，然后加入20微克实施例3制备的重组融合蛋白，室温密闭混匀反应30min，加入100微升10%BSA，封闭反应30min；然后于4℃ 10000转/分离心20min，弃上清，收集胶体金颗粒沉淀，用30微升PB缓冲液复溶，得到金标溶液；然后按照2μL/cm喷量，将金标溶液均匀喷到金标垫上，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4h。

其中，胶体金溶液的浓度为0.01%，胶体金颗粒粒径大小为40nm。

PB缓冲液中含有0.5% BSA、0.5% PEG20000、2%海藻糖和0.2% Triton X-100。

5、质控线对应小鼠IgG的标金：与新冠病毒重组融合蛋白的标金条件相似，区别在于加入的0.2M K₂CO₃溶液的体积不同，向1毫升浓度为0.01%的胶体金溶液中加入10微升0.2M K₂CO₃溶液，其他条件一致。6、喷金和烘干：将复溶后的金标溶液，用上海金标生物科技有限公司的喷金仪，设定2μL/cm喷量，将金溶液均匀喷到金标垫上，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4h。

7、划膜包被：NC膜上检测线T线包被检测抗人二抗（购自长沙博优生物科技有限公司），质控线包被羊抗鼠二抗，用PB溶液将二抗稀释到包被浓度1mg/mL，按1μL/cm速度进行划膜，划好的膜，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4h。

8、组装试纸条，将试纸条按照从上到下为吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫的顺序正确对齐粘贴到PVC板上，用斩切机切成3mm宽的试纸条，并嵌合到卡壳中，压好外壳保证密合。

新冠病毒抗体样品的检测：

本实施例中检测的样品为新冠患者血清样品，每个试纸条加入10μL待测样品，再加入70μL样品稀释液，反应15min，观察颜色反应，并记录结果，结果如图3所示。从图3可以看出，2号血清样本在单独使用S蛋白的胶体金试纸条上IgG漏检（图3，A中No.2），在单独使用N蛋白的胶体金试纸条上IgG和IgM检测条带弱（图3，B中No.2），在使用融合蛋白的胶体金试纸条上则可以检出（图3，C中No.2）。7号和8号样本在单独使用S蛋白的胶体金试纸条上IgG漏检（图3，A中No.7和8），在使用融合蛋白的胶体金试纸条上则可以检出（图3，C中No.7和8）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司

<120> 新冠病毒重组融合蛋白、其制备方法和应用

<130> KHP201119753.9YS

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

20 25 30

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

35 40 45

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

50 55 60

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

85 90 95

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

100 105 110

Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

115 120 125

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

130 135 140

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

145 150 155 160

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

165 170 175

Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

180 185 190

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

195 200 205

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Met Ser Asp Asn Gly Pro

210 215 220

Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp

225 230 235 240

Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys

245 250 255

Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr

260 265 270

Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln

275 280 285

Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr

290 295 300

Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys

305 310 315 320

Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu

325 330 335

Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala

340 345 350

Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn

355 360 365

Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr

370 375 380

Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala

385 390 395 400

Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr

405 410 415

Pro Gly Ser Ser Lys Arg Thr Ser Pro Ala Arg

420 425

<210> 2

<211> 1281

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgattcact ctgtgttcct cctgatgttt ctgctcactc caaccgaatc aagggtgcaa 60

ccaacagaga gcatcgtgag atttccaaac attaccaatc tgtgcccttt cggtgaagtg 120

ttcaatgcga cacgattcgc ttcagtctac gcttggaata gaaaaagaat ttctaattgt 180

gtggcagact atagtgtgtt gtataacagt gcatcttttt caacctttaa atgttacggg 240

gtcagcccaa ccaaacttaa cgacctgtgc tttaccaacg tgtatgccga ctcttttgtt 300

attcgcggag acgaggtccg acaaatagca cctggtcaga ccggaaagat cgcggactat 360

aattataagc ttcctgacga ctttaccggt tgcgttattg catggaactc taacaatctc 420

gactcaaagg tgggcgggaa ctacaattac ctgtaccgac tgttcagaaa gtccaacctc 480

aaacctttcg agcgcgatat ttccaccgag atctatcagg cgggaagcac tccttgcaat 540

ggggtcgagg ggttcaattg ctactttccg ctccaatcat atgggttcca acccaccaac 600

ggagtgggtt accagcccta cagggttgtg gtgctgtctt tcgagctcct gcatatgagc 660

gacaacggtc ctcagaatca gaggaatgcc cctcggatca cctttggcgg tccttctgat 720

tccacgggga gcaatcagaa cggtgaaaga agcggcgctc gctctaagca gagaaggcca 780

caggggcttc ccaataatac tgcctcctgg tttacagccc tgacacagca tggtaaggag 840

gacctgaagt tcccaagggg gcagggcgtc cctatcaaca caaacagctc ccctgacgat 900

cagattgggt actataggcg agccactaga agaattagag gcggcgacgg gaagatgaaa 960

gatctgtctc ctcgatggta cttttactac ttgggtacag gacccgaggc cggtttgcca 1020

tacggtgcta ataaggatgg gatcatttgg gttgccaccg agggcgcttt gaacactccc 1080

aaggaccaca taggcacccg gaatccggct aataatgctg ctatcgtatt gcagttgccc 1140

cagggaacta cattgccgaa gggattctat gctgagggct caaggggagg ctctcaggca 1200

agttccagat cctctagcag atctcgcaat agctccagaa attctactcc cggatcatcc 1260

aaaaggacaa gccccgctag a 1281

<210> 3

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agggtgcaac caacagagag catcgtgaga tttccaaaca ttaccaatct gtgccctttc 60

ggtgaagtgt tcaatgcgac acgattcgct tcagtctacg cttggaatag aaaaagaatt 120

tctaattgtg tggcagacta tagtgtgttg tataacagtg catctttttc aacctttaaa 180

tgttacgggg tcagcccaac caaacttaac gacctgtgct ttaccaacgt gtatgccgac 240

tcttttgtta ttcgcggaga cgaggtccga caaatagcac ctggtcagac cggaaagatc 300

gcggactata attataagct tcctgacgac tttaccggtt gcgttattgc atggaactct 360

aacaatctcg actcaaaggt gggcgggaac tacaattacc tgtaccgact gttcagaaag 420

tccaacctca aacctttcga gcgcgatatt tccaccgaga tctatcaggc gggaagcact 480

ccttgcaatg gggtcgaggg gttcaattgc tactttccgc tccaatcata tgggttccaa 540

cccaccaacg gagtgggtta ccagccctac agggttgtgg tgctgtcttt cgagctcctg 600

cat 603

<210> 4

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgaca acggtcctca gaatcagagg aatgcccctc ggatcacctt tggcggtcct 60

tctgattcca cggggagcaa tcagaacggt gaaagaagcg gcgctcgctc taagcagaga 120

aggccacagg ggcttcccaa taatactgcc tcctggttta cagccctgac acagcatggt 180

aaggaggacc tgaagttccc aagggggcag ggcgtcccta tcaacacaaa cagctcccct 240

gacgatcaga ttgggtacta taggcgagcc actagaagaa ttagaggcgg cgacgggaag 300

atgaaagatc tgtctcctcg atggtacttt tactacttgg gtacaggacc cgaggccggt 360

ttgccatacg gtgctaataa ggatgggatc atttgggttg ccaccgaggg cgctttgaac 420

actcccaagg accacatagg cacccggaat ccggctaata atgctgctat cgtattgcag 480

ttgccccagg gaactacatt gccgaaggga ttctatgctg agggctcaag gggaggctct 540

caggcaagtt ccagatcctc tagcagatct cgcaatagct ccagaaattc tactcccgga 600

tcatccaaaa ggacaagccc cgctaga 627

Claims

1.新冠病毒重组融合蛋白，其特征在于，其为：

i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述重组融合蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

5.权利要求1所述重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：构建含有编码权利要求1所述重组融合蛋白的核酸分子的重组表达载体，转染HEK293细胞后对细胞进行体外培养，从细胞培养液中分离纯化目的蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为pCAGGS。

7.新冠病毒抗体检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1所述的重组融合蛋白。

8.新冠病毒抗体胶体金检测试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2±0.5mm；

所述金标垫上包被有重组融合蛋白-胶体金复合物；NC膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有抗人二抗，所述质控线包被有羊抗鼠二抗；

其中，所述重组融合蛋白为权利要求1所述的重组融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素材质；和/或

所述金标垫的制备方法包括：每1000微升的胶体金溶液中加入16±0.5微升0.2M K₂CO₃溶液，然后加入20±0.5微克所述重组融合蛋白，室温密闭混匀反应30±5min，加入100微升10%BSA，封闭反应30±5min；然后于4℃ 10000转/分离心20min，弃上清，收集胶体金颗粒沉淀，用30微升PB缓冲液复溶，得到金标溶液；然后按照2μL/cm喷量，将金标溶液均匀喷到金标垫上，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4±0.5h；其中，所述胶体金溶液的浓度为0.01%，胶体金颗粒粒径大小为40±5nm；所述PB缓冲液中含有1% BSA、0.5% PEG20000、2%海藻糖和0.5% Triton X-100；和/或

所述检测线和质控线上包被的抗体浓度为1mg/mL；和/或

所述背板为PVC板。

10.权利要求1所述重组融合蛋白在制备新冠病毒抗体检测试剂、试纸条或试剂盒中的应用。