CN113563477A - 新冠病毒重组蛋白和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新冠病毒重组蛋白和人血管紧张素转换酶‑2重组蛋白及其制备方法和应用；新冠病毒S1‑NCTD重组蛋白具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人血管紧张素转换酶‑2重组蛋白具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还提供所述新冠病毒S1‑NCTD重组蛋白和人血管紧张素转换酶‑2重组蛋白在制备新冠病毒中和抗体的ELISA检测试剂盒上的应用。与现有技术相比，本发明利用基因工程技术在原核系统大肠杆菌中制备了该两种重组蛋白，均可以成功高效表达，且具有良好的抗原性，能很好地用以检测新冠病毒中和抗体，并在新冠疫苗接种后的免疫力评估中得到应用。相比较于其他传统方法更为安全高效，对于新冠病毒的基础研究以及临床检测具有积极意义。

Description

新冠病毒重组蛋白和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学和医学的基因工程技术领域，具体涉及新冠病毒重组蛋白(S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2(ACE2)重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

新冠病毒全球大流行，给人类产生了灾难性的影响，根据世界卫生组织(WHO)的报告，截止到2021年7月1日全球发病人数达1.8亿人，死亡人数超过394.5万人。

病原体被鉴定为2019-nCoV，随后被命名为SARS-CoV-2，属于SARS相关冠状病毒，与17年前SARS爆发的病原体相同。虽然分子检测技术，如聚合酶链反应(PCR)和下一代测序，在病毒基因变化的急性诊断和监测中发挥了重要作用，但迫切需要一种可靠和通用的血清或抗体检测方法。这种抗体检测方法用于回顾性接触追踪，调查无症状感染率，准确确定病死率，评估恢复患者和候选疫苗接受者的群体免疫和体液保护性免疫，寻找天然储层和中间宿主。全世界的研究实验室和制药公司正在竞相生产具有足够特异性和敏感性抗体测试，以检测COVID-19感染并评估疫苗的保护作用。

有两种抗体测试可以瞄准。第一种是传统的病毒中和试验，检测患者血液中的中和抗体，因为新冠病毒具有高传染性和高致病性，这种方法需要在专门的生物安全3级(BSL3)实验室进行，在遏制设施中处理活的新冠病毒，需要2-4天才能完成，因此这种检测方法操作复杂，费时费力，难以普及。另一种，是基于假病毒进行中和抗体的检测，可以在BSL2实验室中进行，但仍然需要使用活病毒和细胞培养。目前所有其他检测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流分析(LFA)快速试验，代表第二种检测类型，检测总结合抗体，一般无法分出来总结合抗体和中和抗体。

新冠病毒感染人类机体是通过病毒表面S蛋白的“受体结合结构域”(Receptor-binding domain,简称RBD)与机体细胞表面一种叫做血管紧张素转换酶2(Angiotensinconverting enzyme 2，简称ACE2)的受体蛋白结合后进入细胞，病毒在细胞内大量复制增殖引起一系列的病理改变，最后导致新冠肺炎。新冠病毒的中和抗体可以特异性地与病毒RBD结合，从而能够阻断RBD与细胞ACE2的结合，使病毒不能进入细胞，病毒就失去感染性，机体就得到保护。因此建立一种简单易行、基于这种RBD-ACE2相互作用特定中和抗体的中和行(即阻断)、不用活病毒、在普通非高级别生物安全实验室就可以开展的中和抗体检测替代方法，其必要性和迫切性凸显。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种方便、多效、低成本、并具有良好抗原性的新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)及其制备方法和应用

本发明的第一个目的是分别提供抗原性的新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)。

本发明的第二个目的是一种重组质粒。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌株。

本发明的第四个目的是分别提供抗原性的新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的制备方法。

本发明的第五个目的是提供抗原性的新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的应用。

本发明的第六个目的是提供一种新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：

本发明提供一种新冠病毒S1-NCTD重组蛋白，记为GST-S1-NCTD，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)，记为GST-ACE2，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种重组质粒，包含所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白(GST-S1-NCTD)的核苷酸序列，记为pGEX-4T2-S1-NCTD。

本发明还提供一种重组质粒，包含所述人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的核苷酸序列，记为pGEX-4T2-ACE2。

本发明还提供一种基因工程菌株，包含有所述重组质粒pGEX-4T2-S1-NCTD。

本发明还提供一种基因工程菌株，包含有所述重组质粒pGEX-4T2-ACE2。

在本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌株为大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株。

本发明还提供一种新冠病毒S1-NCTD重组蛋白(GST-S1-NCTD)的制备方法，包括以下步骤：

1)从新冠病毒S基因(YP_009724390.1)选了编码S1-NCTD片段(aa25-588)的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.5由公司合成，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得S1-NCTD的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-S1-NCTD；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-S1-NCTD重组蛋白。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白的方法为：挑取阳性的单菌落重组工程菌，液体培养基培养至OD₆₀₀＝0.8～1，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达，继续培养6小时，离心取沉淀；

在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基为新鲜配置的，含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基。

在本发明的一个实施方式中，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达时，用终浓度为0.2-0.5mM的IPTG进行目的蛋白的诱导表达。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白，并进行培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩，获得目的蛋白。

在本发明的一个实施方式中，培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩的方法如下：

用pH为7.5～8.5的含有0.2mg/ml溶菌酶和0.05mg/ml DNase的裂解缓冲液(100mMNaH₂PO₄、10mM Tris·Cl)重悬沉淀，冻融破碎，离心取沉淀；

8～10倍体积的包涵体洗涤缓冲液(pH＝8.4～8.6含有2M尿素的裂解缓冲液)重悬沉淀，离心取沉淀，重复4次；

1：20滴状稀释溶解的包涵体液在复性缓冲液中(pH～8 100mM Tris·Cl、0.4mML-arginine、20mM GSH、2mMGSSH、10％甘油、1M尿素)，在4度搅拌过夜；

使用超滤离心管浓缩，并用pH＝9.4碳酸氢盐缓冲液换缓冲溶液。

在本发明的一个实施方式中，表达产物用12％的SDS-PAGE进行分析、鉴定。

本发明还提供一种人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的制备方法，包括以下步骤：

1)从人血管紧张素转换酶-2基因(NM_021804)选了编码ACE2 aa19-615片段的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.6由公司合成，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得ACE2的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-ACE2；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-ACE2重组蛋白。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白的方法为：挑取阳性的单菌落重组工程菌，液体培养基培养至OD₆₀₀＝0.8～1，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达，继续培养6小时，离心取沉淀；

在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基为新鲜配置的，含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基。

在本发明的一个实施方式中，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达时，用终浓度为0.2-0.5mM的IPTG进行目的蛋白的诱导表达。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白，并进行培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩，获得目的蛋白。

在本发明的一个实施方式中，培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩的方法如下：

用pH为7.5～8.5的含有0.2mg/ml溶菌酶和0.05mg/ml DNase的裂解缓冲液(100mMNaH₂PO₄、10mM Tris·Cl)重悬沉淀，冻融破碎，离心取沉淀；

8～10倍体积的包涵体洗涤缓冲液(pH＝8.4～8.6含有2M尿素的裂解缓冲液)重悬沉淀，离心取沉淀，重复4次；

1：20滴状稀释溶解的包涵体液在复性缓冲液中(pH～8 100mM Tris·Cl、0.4mML-arginine、20mM GSH、2mMGSSH、10％甘油、1M尿素)，在4度搅拌过夜；

使用超滤离心管浓缩，并用pH＝9.4碳酸氢盐缓冲液换缓冲溶液。

在本发明的一个实施方式中，获得GST-ACE2重组蛋白后，使用活化了的HRP制备HRP-GST-ACE2的标记复合物。

本发明还提供新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的应用，所述新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)在制备新冠病毒中和抗体的ELISA检测试剂盒上的应用。

在本发明的一个实施方式中，以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗。

在本发明的一个实施方式中，包被抗原GST-S1-NCTD的浓度为不少于4μg/mL。

在本发明的一个实施方式中，以HRP-GST-ACE2作为酶标二抗。其中，以活化了的HRP和GST-ACE2重组蛋白制备HRP-GST-ACE2。

本发明还提供所述重组菌或重组载体任一在制备新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒上的应用。

本发明还提供新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，包括包被抗原和酶标二抗，其中，以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗。

在本发明的一个实施方式中，包被抗原GST-S1-NCTD的浓度为不少于4μg/mL。

本发明还提供新冠病毒中和抗体ELISA检测方法，包括以下步骤：

以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗；包被抗原的方法为GST-S1-NCTD的4μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗涤液(PBS含有0.05％Tween 20)振荡洗涤3次，1min/每次。

与现有技术相比，本发明的积极效果体现在以下方面：

本发明采用基因工程技术成功在大肠杆菌表达出新冠病毒S1-NCTD重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)，均可以成功高效表达，且具有良好的抗原性，能很好地用以检测新冠病毒中和抗体，并在新冠疫苗接种后的免疫力评估中得到应用。相比较于其他传统方法更为安全高效，成本低，对于新冠病毒的基础研究以及临床检测具有积极意义。

附图说明

图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；

其中图1A为PCR扩增S1-NCTD和ACE2基因；

图1B为大肠杆菌菌落PCR扩增GST-S1-NCTD和GST-ACE2基因，作为转化后的克隆筛选。

图2为构建的表达质粒pGEX-4T2-S1-NCTD和pGEX-4T2-ACE2图。

图3为GST-S1-NCTD和GST-ACE2重组蛋白的制备，

其中图3A为SDS-PAGE分析GST-S1-NCTD和GST-ACE2重组蛋白IPTG诱导前后表达和可溶性情况；M:蛋白marker；P：沉淀；S：上清；(-)：IPTG诱导前；

图3B为SDS-PAGE分析GST-S1-NCTD和GST-ACE2重组蛋白变性、复性、浓缩后的纯度情况。

图4为GST-S1-NCTD和GST-ACE2重组蛋白的活性分析，

其中图4A为GST-S1-NCTD蛋白与新冠病毒中和抗体的反应情况，

图4B为酶标的GST-ACE2蛋白(HRP-GST-ACE2)与GST-S1-NCTD的反应情况。

具体实施方式

本发明提供一种新冠病毒S1-NCTD重组蛋白，记为GST-S1-NCTD，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，信息如下：

NAME:Glutathione S-transferase-tagged S1-NCTD(GST-S1-NCTD)

DESCRIPTION:The N-and C-terminal domains(aa25-588)of the S1 subunitof the Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)spikeprotein with an N-terminal GST tag.

GENE ORIGIN:YP_009724390.1(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2).

其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)，记为GST-ACE2，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其信息如下：

NAME:Glutathione S-transferase-tagged Angiotensin converting enzyme 2(GST-ACE2)

DESCRIPTION:The exopeptidase domain(aa19-615)of the human Angiotensinconverting enzyme 2with an N-terminal GST tag

GENE ORIGIN:NM_021804(Homo sapiens).

其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种重组质粒，包含所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白(GST-S1-NCTD)的核苷酸序列，记为pGEX-4T2-S1-NCTD。

本发明还提供一种重组质粒，包含所述人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的核苷酸序列，记为pGEX-4T2-ACE2。

本发明还提供一种基因工程菌株，包含有所述重组质粒pGEX-4T2-S1-NCTD。

本发明还提供一种基因工程菌株，包含有所述重组质粒pGEX-4T2-ACE2。

在本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌株为大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株。

本发明还提供一种新冠病毒S1-NCTD重组蛋白(GST-S1-NCTD)的制备方法，包括以下步骤：

1)从新冠病毒S基因(YP_009724390.1)选了编码S1-NCTD片段(aa25-588)的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.5由公司合成，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得S1-NCTD的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-S1-NCTD；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-S1-NCTD重组蛋白。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白的方法为：挑取阳性的单菌落重组工程菌，液体培养基培养至OD₆₀₀＝0.8～1，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达，继续培养6小时，离心取沉淀；

在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基为新鲜配置的，含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基。

在本发明的一个实施方式中，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达时，用终浓度为0.2-0.5mM的IPTG进行目的蛋白的诱导表达。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白，并进行培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩，获得目的蛋白。

在本发明的一个实施方式中，培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩的方法如下：

用pH为7.5～8.5的含有0.2mg/ml溶菌酶和0.05mg/ml DNase的裂解缓冲液(100mMNaH₂PO₄、10mM Tris·Cl)重悬沉淀，冻融破碎，离心取沉淀；

8～10倍体积的包涵体洗涤缓冲液(pH＝8.4～8.6含有2M尿素的裂解缓冲液)重悬沉淀，离心取沉淀，重复4次；

1：20滴状稀释溶解的包涵体液在复性缓冲液中(pH～8 100mM Tris·Cl、0.4mML-arginine、20mM GSH、2mMGSSH、10％甘油、1M尿素)，在4度搅拌过夜；

使用超滤离心管浓缩，并用pH＝9.4碳酸氢盐缓冲液换缓冲溶液。

在本发明的一个实施方式中，表达产物用12％的SDS-PAGE进行分析、鉴定。

本发明还提供一种人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的制备方法，包括以下步骤：

1)从人血管紧张素转换酶-2基因(NM_021804)选了编码ACE2 aa19-615片段的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.6由公司合成，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得ACE2的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-ACE2；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-ACE2重组蛋白。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白的方法为：挑取阳性的单菌落重组工程菌，液体培养基培养至OD₆₀₀＝0.8～1，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达，继续培养6小时，离心取沉淀；

在本发明的一个实施方式中，所述液体培养基为新鲜配置的，含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基。

在本发明的一个实施方式中，加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达时，用终浓度为0.2-0.5mM的IPTG进行目的蛋白的诱导表达。

在本发明的一个实施方式中，将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白，并进行培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩，获得目的蛋白。

在本发明的一个实施方式中，培养液离心、细菌的溶解、包涵体洗涤、包涵体溶解、目的蛋白的滴状稀释复性和浓缩的方法如下：

用pH为7.5～8.5的含有0.2mg/ml溶菌酶和0.05mg/ml DNase的裂解缓冲液(100mMNaH₂PO₄、10mM Tris·Cl)重悬沉淀，冻融破碎，离心取沉淀；

8～10倍体积的包涵体洗涤缓冲液(pH＝8.4～8.6含有2M尿素的裂解缓冲液)重悬沉淀，离心取沉淀，重复4次；

1：20滴状稀释溶解的包涵体液在复性缓冲液中(pH～8 100mM Tris·Cl、0.4mML-arginine、20mM GSH、2mMGSSH、10％甘油、1M尿素)，在4度搅拌过夜；

使用超滤离心管浓缩，并用pH＝9.4碳酸氢盐缓冲液换缓冲溶液。

在本发明的一个实施方式中，获得GST-ACE2重组蛋白后，使用活化了的HRP制备HRP-GST-ACE2的标记复合物。

本发明还提供新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)的应用，所述新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)在制备新冠病毒中和抗体的ELISA检测试剂盒上的应用。

在本发明的一个实施方式中，以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗。

在本发明的一个实施方式中，包被抗原GST-S1-NCTD的浓度为不少于4μg/mL。

在本发明的一个实施方式中，以HRP-GST-ACE2作为酶标二抗。其中，以活化了的HRP和GST-ACE2重组蛋白制备HRP-GST-ACE2。

本发明还提供所述重组菌或重组载体任一在制备新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒上的应用。

本发明还提供新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，包括包被抗原和酶标二抗，其中，以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗。

在本发明的一个实施方式中，包被抗原GST-S1-NCTD的浓度为不少于4μg/mL。

本发明还提供新冠病毒中和抗体ELISA检测方法，包括以下步骤：

以新冠病毒(S1-NCTD)重组蛋白(GST-S1-NCTD)作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)标记后作为酶标二抗；包被抗原的方法为GST-S1-NCTD的4μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗涤液(PBS含有0.05％Tween 20)振荡洗涤3次，1min/每次。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

1、目的基因的获得：

根据GenBank登录的新冠病毒S基因序列(YP_009724390.1)选了编码S1-NCTD片段(aa25-588)的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.5；根据GenBank登录的人血管紧张素转换酶-2基因(NM_021804)选了编码ACE2aa19-615片段的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.6。由武汉金开瑞生物工程有限公司合成这两种基因。合成的基因以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得S1-NCTD的目的基因；人血管紧张素转换酶-2基因(NM_021804)选了编码ACE2 aa19-615片段的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.6由公司合成，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得ACE2的目的基因。以此合成基因序列为模板，设计上游引物和下游引物(见表1)，然后经过PCR扩增获得含有BamHI和NotI酶切位点的S1-NCTD和ACE2目的基因，结果见图1A。

PCR反应体系如下：

PCR程序为94℃预加热10分钟，在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到58℃保持30秒钟，在72℃保持2分钟，重复这样的循环34次，最后，在72℃保持10min，使产物延伸完整，4℃保存。

表1：

2、重组质粒和重组菌的构建：

本实施例中，琼脂糖凝胶回收纯化均是使用Qiagen公司的QIAprep○R SpinMiniprep Kit(250)胶回收试剂盒进行胶回收DNA，按照说明书操作即可。用FastDigestBamHI和FastDigest NotI(Thermo Scientific)双酶切pGEX-4T2质粒和纯化的PCR产物，37℃30min，再经琼脂糖凝胶回收纯化。然后，将酶切纯化的PCR片段和质粒pGEX-4T2按3:1比例混匀，在T4 DNA连接酶(Rapid DNA Ligation Kit，Thermo Scientific)作用下进行连接，22℃1小时。最后把连接产物转化到大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)感受态细胞，在含有100μg/ml氨苄西林的固体培养基中筛选阳性克隆。转化过程如下：取50μl感受态细菌，加入连接产物5μl，充分混匀后，冰浴30min；42℃水浴90s，立即冰浴2min；加至500μl37℃预热的LB液体培养基中，混匀后37℃、100rpm轻摇1小时；取100μl涂布于含抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。同时设感受态细菌对照、阳性对照(未切开的质粒载体)、阴性对照(切开的质粒载体)。筛选目的克隆的方法为：首先挑取平皿上若干个单克隆，用pGEX-4T2的引物(见表1)进行PCR扩增筛选，经过筛选出阳性目的克隆。结果见图1B和2。

3、目的蛋白的表达分析：

挑取经鉴定为阳性的单菌落培养至OD₆₀₀＝0.8～1时向培养基中加入IPTG使其终浓度为0.5mM，继续培养6小时，12000r/min离心15分钟收取沉淀；用含有0.2mg/ml溶菌酶和0.05mg/ml DNase的裂解缓冲液(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris·Cl，pH＝8)重悬沉淀，冻融破碎，离心取沉淀；以空载体pGEX-4T2作为对照进行相同的诱导，分别取诱导后的pGEX-4T2-S1-NCTD和pGEX-4T2-ACE2的沉淀，经PBS稀释或重悬后每20μL使用20μL的2×蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10分钟后离心去除底部大的团块后上样10μL进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和考马斯亮蓝染色分析，结果见图3A。

4、GST-S1-NCTD和GST-ACE2蛋白的获得：

用10倍体积4℃预冷的的包涵体洗涤缓冲液(pH＝8.4，含有2M尿素的裂解缓冲液)重悬沉淀，室温放置5分钟，4℃12000r/min离心15分钟收取沉淀，重复4次，加入10倍体积的包涵体溶解缓冲液(含有8M尿素的裂解缓冲液，pH＝8.4)重悬沉淀，室温放置1小时，4℃12000r/min离心15分钟取上清；按1：20滴状稀释溶解的包涵体液在复性缓冲液中(100mMTris·Cl、0.4mM L-arginine、20mM GSH、2mMGSSH、10％甘油、1M尿素，pH＝8)，在4度搅拌过夜。第二天，使用Amicon Ultra-15超滤离心管浓缩，并用pH＝9.4碳酸氢盐缓冲液换缓冲溶液，依据厂家说明。结果见图3B。使用SureLINK^TMHRP Conjugation Kit进行GST-ACE2的辣根过氧化物酶标记，依据厂家说明。

新冠病毒S1-NCTD重组蛋白，记为GST-S1-NCTD，其具有的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。人血管紧张素转换酶-2重组蛋白(GST-ACE2)，记为GST-ACE2，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5、GST-S1-NCTD和HRP-GST-ACE2原反应性检测：

试剂配制：

PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，加去离子水定容至1000ml，调节至pH 7.4，室温保存。

包被液(0.5mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液)：碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g，溶于100mL双蒸水中，用HCl调pH至9.6。4℃保存，两周内使用。使用时稀释10倍。

抗体稀释液：1％Casein PBS(1g casein溶解于100ml PBS缓冲液中，4℃保存)。

洗涤液(PBST)：1000mL PBS缓冲液加0.5mLTween-20，室温保存。

底物液A(TMB-过氧化氢尿素溶液)：取Na₂HPO₄.12H2O 9.205g、柠檬酸2.55g、过氧化氢尿素0.3g，加去离子水至500ml，充分溶解后4℃避光保存；

底物液B：取TMB 0.1g溶于5ml无水乙醇中；取EDTA-Na₂ 0.073g、柠檬酸0.525g溶于400ml去离子水中，加热至90℃充分溶解，待冷后逐滴加入TMB乙醇溶液，定容至500ml，4℃避光保存；

终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：浓硫酸100mL缓慢滴加到600mL去离子水中并不断搅拌，加去离子水定容至900mL，室温保存。

A)利用间接ELISA法检测GST-S1-NCTD的抗原性特征：

首先用GST-S1-NCTD作为包板抗原，用包被液稀释到4μg/mL，加入酶标板中100μL/孔，4度放置过夜，用洗涤液洗3次；用新冠病毒中和抗体6D11F2(GenScript)作为一抗，从1：500稀释度开始，用抗体稀释液稀释，37度放置45分钟，用洗液洗3次；用抗体稀释液按1:5000倍浓度稀释酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃作用45分钟，同上洗涤步骤；每孔加入底物液A和B各50μL，37度反应20分钟；每孔加入50mL终止液终止反应；用双波长测定各孔吸光度值(其中OD450nm为实际波长，OD630nm为参考波长)。结果见图4A。

B)利用直接ELISA法检测HRP-GST-ACE2和GST-S1-NCTD反应性：

首先用GST-S1-NCTD作为包板抗原，用包被液稀释到4μg/mL，加入酶标板中100μL/孔，4度放置过夜，用洗涤液洗3次；用HRP-GST-ACE2作为酶标二抗，用抗体稀释液按1:200倍浓度稀释开始，100μL/孔，37℃作用60分钟，同上洗涤步骤；每孔加入底物液A和B各50μL，37度反应20分钟；每孔加入50mL终止液终止反应；用双波长测定各孔吸光度值(其中OD450nm为实际波长，OD630nm为参考波长)。结果见图4B。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海健康医学院

<120> 新冠病毒重组蛋白和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 790

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu

245 250 255

Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val

260 265 270

Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe

275 280 285

Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg

290 295 300

Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu

305 310 315 320

Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln

325 330 335

Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys

340 345 350

Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys

355 360 365

Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys

370 375 380

Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp

385 390 395 400

Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg

405 410 415

Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro

420 425 430

Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg

435 440 445

Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala

450 455 460

Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys

465 470 475 480

Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp

485 490 495

Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys

500 505 510

Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

515 520 525

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

530 535 540

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

545 550 555 560

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

565 570 575

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

580 585 590

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

595 600 605

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

610 615 620

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

625 630 635 640

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

645 650 655

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

660 665 670

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

675 680 685

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

690 695 700

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

705 710 715 720

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

725 730 735

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly

740 745 750

Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly

755 760 765

Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu

770 775 780

Glu Ile Leu Asp Ile Thr

785 790

<210> 2

<211> 840

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr

225 230 235 240

Ala Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys

245 250 255

Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser

260 265 270

Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn

275 280 285

Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu

290 295 300

Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu

305 310 315 320

Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp

325 330 335

Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr

340 345 350

Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu

355 360 365

Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn

370 375 380

Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln

385 390 395 400

Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala

405 410 415

Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr

420 425 430

Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile

435 440 445

Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His

450 455 460

Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr

465 470 475 480

Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp

485 490 495

Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln

500 505 510

Lys Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp

515 520 525

Ala Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly

530 535 540

Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp

545 550 555 560

Pro Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu

565 570 575

Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp

580 585 590

Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met

595 600 605

Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly

610 615 620

Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro

625 630 635 640

Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp

645 650 655

Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val

660 665 670

Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val

675 680 685

Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu

690 695 700

Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu

705 710 715 720

Thr Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser

725 730 735

Phe Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu

740 745 750

Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp

755 760 765

Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg

770 775 780

Leu Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly

785 790 795 800

Ala Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu

805 810 815

Phe Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser

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Thr Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp

835 840

<210> 3

<211> 2373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggttccgc gtggatcccc gccagcctat actaactcct tcactcgtgg tgtttactat 720

ccggataaag ttttccgctc ctccgtactg cacagcaccc aggatctgtt tctgccgttc 780

ttctctaacg tgacctggtt ccacgcaatc catgtttctg gcaccaacgg tactaaacgt 840

ttcgacaatc ctgtgctgcc gttcaacgac ggtgtatact ttgcctctac tgaaaaatct 900

aacatcattc gtggttggat cttcggcacc accctggact ctaaaaccca gtctctgctg 960

atcgttaaca atgcaactaa cgtagtaatc aaggtctgcg aatttcagtt ctgcaacgat 1020

ccgttcctgg gcgtttatta ccacaaaaac aacaaaagct ggatggaaag cgagttccgt 1080

gtgtactcta gcgctaacaa ttgcaccttc gaatatgtat ctcagccgtt cctgatggac 1140

ctggaaggca aacagggcaa cttcaaaaac ctgcgtgagt tcgtgtttaa gaacattgat 1200

ggttacttca aaatctactc taagcacacc ccgatcaacc tggttcgtga tctgccacag 1260

ggttttagcg ctctggaacc gctggtggat ctgcctattg gcattaatat tacccgtttt 1320

caaacgctgc tggcactgca ccgttcttat ctgaccccgg gtgactcttc tagcggttgg 1380

actgcaggcg ctgcagcata ctacgtgggt tatctgcagc cgcgcacgtt cctgctgaaa 1440

tacaacgaga acggcaccat caccgatgct gtggattgcg ccctggaccc tctgtccgaa 1500

accaaatgca ctctgaaatc tttcaccgtt gaaaagggca tttaccagac ctctaacttc 1560

cgtgttcagc ctactgaatc tatcgtacgt ttcccgaaca tcaccaacct gtgcccgttc 1620

ggcgaagtat tcaacgccac ccgctttgct agcgtttacg catggaaccg taaacgcatt 1680

agcaactgtg tggcggacta cagcgtgctg tacaactctg ccagcttttc caccttcaaa 1740

tgctacggcg tgtctccgac caaactgaac gatctgtgct ttaccaatgt ttatgcggac 1800

tccttcgtca tccgtggtga tgaagtgcgt cagattgctc cgggccagac tggcaaaatt 1860

gcagactaca actataaact gccggacgac ttcaccggtt gtgttattgc gtggaacagc 1920

aataacctgg attctaaagt aggtggcaac tataactacc tgtaccgcct gttccgcaaa 1980

agcaacctga aaccgttcga acgtgatatt agcaccgaaa tctatcaggc gggttctact 2040

ccgtgcaacg gtgtcgaagg tttcaactgt tattttccgc tgcagtctta cggctttcag 2100

ccgactaacg gcgtaggtta ccagccatac cgtgtagttg tactgtcctt cgaactgctg 2160

cacgctccag caaccgtatg cggtccgaag aaatccacga acctggttaa gaacaagtgt 2220

gttaacttca atttcaacgg tctgaccggt acgggtgtgc tgactgaaag caacaaaaaa 2280

ttcctgccgt ttcagcagtt tggtcgtgac atcgccgaca ctactgatgc cgtgcgtgat 2340

ccgcagactc tggaaatcct ggatattacc tga 2373

<210> 4

<211> 2523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggttccgc gtggatcctc ttctagttct tggctacttc tgtccttagt tgctgttact 720

gctgctcagt ccacaattga agaacaggct aaaactttct tagataagtt caaccacgag 780

gcagaggatt tgttctatca atccagtctt gcttcttgga actataatac taacattact 840

gaagaaaatg tacaaaatat gaataatgcc ggagataaat ggtccgcttt tctgaaagaa 900

cagtctacat tagctcaaat gtaccctcta caagagattc agaaccttac tgtcaagtta 960

caattgcagg ctcttcaaca aaacggcagt tctgtattat cagaggacaa atctaagaga 1020

ctaaatacaa tcttgaacac aatgagtact atttactcta ctggaaaagt ttgtaaccca 1080

gacaatcctc aggaatgttt attgttggag ccaggactta acgaaataat ggctaatagt 1140

cttgattata acgaaagact gtgggcttgg gaatcatggc gttctgaagt tggtaaacaa 1200

ttaagacctt tgtacgagga gtacgttgtg cttaagaacg aaatggctag ggctaatcat 1260

tatgaggatt acggcgatta ctggaggggt gactacgaag ttaatggtgt cgacggatat 1320

gattattcaa gaggccaatt gattgaagac gttgaacata cttttgagga aattaaacct 1380

ttatacgaac atctacacgc ttacgttaga gctaagctga tgaacgctta tccatcctat 1440

atctccccta ttggctgctt acctgctcac ctattgggag atatgtgggg aaggttttgg 1500

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gctatggtgg accaggcttg ggatgcccag aggattttca aggaggctga aaagtttttt 1620

gttagtgtag gtttaccaaa catgacgcaa ggtttttggg aaaattcaat gttaactgac 1680

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ttccgtatcc ttatgtgtac caaggtcact atggatgatt tcctaacagc tcatcatgaa 1800

atgggtcata ttcaatacga tatggcatac gctgcacagc cattcctgct gcgtaatgga 1860

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aaacacttga agtccattgg cctattgtct cctgactttc aggaagataa tgagacagaa 1980

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tga 2523

<210> 5

<211> 1695

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccagcct atactaactc cttcactcgt ggtgtttact atccggataa agttttccgc 60

tcctccgtac tgcacagcac ccaggatctg tttctgccgt tcttctctaa cgtgacctgg 120

ttccacgcaa tccatgtttc tggcaccaac ggtactaaac gtttcgacaa tcctgtgctg 180

ccgttcaacg acggtgtata ctttgcctct actgaaaaat ctaacatcat tcgtggttgg 240

atcttcggca ccaccctgga ctctaaaacc cagtctctgc tgatcgttaa caatgcaact 300

aacgtagtaa tcaaggtctg cgaatttcag ttctgcaacg atccgttcct gggcgtttat 360

taccacaaaa acaacaaaag ctggatggaa agcgagttcc gtgtgtactc tagcgctaac 420

aattgcacct tcgaatatgt atctcagccg ttcctgatgg acctggaagg caaacagggc 480

aacttcaaaa acctgcgtga gttcgtgttt aagaacattg atggttactt caaaatctac 540

tctaagcaca ccccgatcaa cctggttcgt gatctgccac agggttttag cgctctggaa 600

ccgctggtgg atctgcctat tggcattaat attacccgtt ttcaaacgct gctggcactg 660

caccgttctt atctgacccc gggtgactct tctagcggtt ggactgcagg cgctgcagca 720

tactacgtgg gttatctgca gccgcgcacg ttcctgctga aatacaacga gaacggcacc 780

atcaccgatg ctgtggattg cgccctggac cctctgtccg aaaccaaatg cactctgaaa 840

tctttcaccg ttgaaaaggg catttaccag acctctaact tccgtgttca gcctactgaa 900

tctatcgtac gtttcccgaa catcaccaac ctgtgcccgt tcggcgaagt attcaacgcc 960

acccgctttg ctagcgttta cgcatggaac cgtaaacgca ttagcaactg tgtggcggac 1020

tacagcgtgc tgtacaactc tgccagcttt tccaccttca aatgctacgg cgtgtctccg 1080

accaaactga acgatctgtg ctttaccaat gtttatgcgg actccttcgt catccgtggt 1140

gatgaagtgc gtcagattgc tccgggccag actggcaaaa ttgcagacta caactataaa 1200

ctgccggacg acttcaccgg ttgtgttatt gcgtggaaca gcaataacct ggattctaaa 1260

gtaggtggca actataacta cctgtaccgc ctgttccgca aaagcaacct gaaaccgttc 1320

gaacgtgata ttagcaccga aatctatcag gcgggttcta ctccgtgcaa cggtgtcgaa 1380

ggtttcaact gttattttcc gctgcagtct tacggctttc agccgactaa cggcgtaggt 1440

taccagccat accgtgtagt tgtactgtcc ttcgaactgc tgcacgctcc agcaaccgta 1500

tgcggtccga agaaatccac gaacctggtt aagaacaagt gtgttaactt caatttcaac 1560

ggtctgaccg gtacgggtgt gctgactgaa agcaacaaaa aattcctgcc gtttcagcag 1620

tttggtcgtg acatcgccga cactactgat gccgtgcgtg atccgcagac tctggaaatc 1680

ctggatatta cctga 1695

<210> 6

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcttctagtt cttggctact tctgtcctta gttgctgtta ctgctgctca gtccacaatt 60

gaagaacagg ctaaaacttt cttagataag ttcaaccacg aggcagagga tttgttctat 120

caatccagtc ttgcttcttg gaactataat actaacatta ctgaagaaaa tgtacaaaat 180

atgaataatg ccggagataa atggtccgct tttctgaaag aacagtctac attagctcaa 240

atgtaccctc tacaagagat tcagaacctt actgtcaagt tacaattgca ggctcttcaa 300

caaaacggca gttctgtatt atcagaggac aaatctaaga gactaaatac aatcttgaac 360

acaatgagta ctatttactc tactggaaaa gtttgtaacc cagacaatcc tcaggaatgt 420

ttattgttgg agccaggact taacgaaata atggctaata gtcttgatta taacgaaaga 480

ctgtgggctt gggaatcatg gcgttctgaa gttggtaaac aattaagacc tttgtacgag 540

gagtacgttg tgcttaagaa cgaaatggct agggctaatc attatgagga ttacggcgat 600

tactggaggg gtgactacga agttaatggt gtcgacggat atgattattc aagaggccaa 660

ttgattgaag acgttgaaca tacttttgag gaaattaaac ctttatacga acatctacac 720

gcttacgtta gagctaagct gatgaacgct tatccatcct atatctcccc tattggctgc 780

ttacctgctc acctattggg agatatgtgg ggaaggtttt ggacgaatct atattctttg 840

accgtgccat tcggacaaaa gccaaacatt gacgttactg atgctatggt ggaccaggct 900

tgggatgccc agaggatttt caaggaggct gaaaagtttt ttgttagtgt aggtttacca 960

aacatgacgc aaggtttttg ggaaaattca atgttaactg acccaggcaa cgttcagaag 1020

gctgtctgtc accctactgc ttgggatctt ggaaaaggcg acttccgtat ccttatgtgt 1080

accaaggtca ctatggatga tttcctaaca gctcatcatg aaatgggtca tattcaatac 1140

gatatggcat acgctgcaca gccattcctg ctgcgtaatg gagccaatga gggatttcat 1200

gaagctgttg gtgaaatcat gtcccttagt gctgcaaccc ccaaacactt gaagtccatt 1260

ggcctattgt ctcctgactt tcaggaagat aatgagacag aaataaattt cctgttaaag 1320

caggctctga caattgttgg aacactgcct ttcacttata tgttagagaa atggagatgg 1380

atggttttta aaggtgaaat ccctaaggac cagtggatga agaagtggtg ggaaatgaaa 1440

cgtgaaatcg tgggtgttgt ggaaccagtg cctcatgacg agacatactg cgacccagca 1500

tctttatttc atgtcagtaa tgattactcc tttatccgtt actacaccag aactctatat 1560

caattccagt tccaagaggc cttatgccag gcagccaagc acgaaggacc acttcataag 1620

tgtgacattt ctaatagtac agaagctgga cagaagctgt tcaacatgct tagattagga 1680

aagagtgaac cttggacttt ggcattggaa aacgttgttg gtgctaagaa catgaacgtt 1740

agacctttgt tgaattattt cgaaccctta tttacctggc ttaaagatca aaacaagaac 1800

tcttttgtgg gctggtccac cgattggtct ccttatgccg attga 1845

Claims (10)

1.一种新冠病毒S1-NCTD重组蛋白，其特征在于，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种人血管紧张素转换酶-2重组蛋白，其特征在于，其具有的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求1所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白的核苷酸序列，或，包含权利要求2所述人血管紧张素转换酶-2重组蛋白的核苷酸序列。

4.一种基因工程菌株，其特征在于，包含权利要求3所述重组质粒。

5.根据权利要求4所述一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株。

6.一种如权利要求1所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从新冠病毒S基因(YP_009724390.1)选了编码S1-NCTD片段(aa25-588)的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.5，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得S1-NCTD的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-S1-NCTD；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-S1-NCTD重组蛋白。

7.一种如权利要求2所述人血管紧张素转换酶-2重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从人血管紧张素转换酶-2基因(NM_021804)选了编码ACE2 aa19-615片段的核苷酸序列，相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.6，并以此为模板，设计上游引物和下游引物，然后经过PCR扩增获得ACE2的目的基因；

2)经BamHI和NotI双酶切后，插入到表达质粒pGEX-4T2，构建重组质粒pGEX-4T2-ACE2；将重组质粒转化至大肠杆菌Chaperone pG-KJE8/BL21(DE3)菌株获得重组工程菌；将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白并通过包涵体处理获得目的蛋白，表达产物用SDS-PAGE鉴定，最终获得GST-ACE2重组蛋白。

8.权利要求1所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白和权利要求2所述人血管紧张素转换酶-2重组蛋白的应用，其特征在于，所述新冠病毒S1-NCTD重组蛋白和人血管紧张素转换酶-2重组蛋白在制备新冠病毒中和抗体的ELISA检测试剂盒上的应用。

9.权利要求3所述重组菌或权利要求4所述重组载体任一在制备新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒上的应用。

10.一种新冠病毒中和抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被抗原和酶标二抗，其中，以新冠病毒S1-NCTD重组蛋白作为新冠病毒包被抗原，以人血管紧张素转换酶-2重组蛋白标记后作为酶标二抗。

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