CN111217920A

CN111217920A - 新冠病毒n-s优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒

Info

Publication number: CN111217920A
Application number: CN202010163749.3A
Authority: CN
Inventors: 陈庆全; 李丽满
Original assignee: Hebei Jingshuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Jingshuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: WO2021179371A1; CN111217920B

Abstract

本发明公开了一种新冠病毒N‑S优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒，属于基因工程技术领域。其中新型冠状病毒N‑S优势表位融合蛋白为新型冠状病毒N蛋白和S蛋白的优势表位融合蛋白，首先由新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段抗原与N蛋白优势表位区段抗原构建成一个融合表达抗原；然后通过基因优化去除稀有密码子获得优化后基因序列，最终获得高效表达的可溶性高活性抗原。本发明的新型冠状病毒N‑S优势表位融合蛋白为可溶性表达、产量高、纯度高、活性好，适用于新型冠状病毒患者的确诊检测。

Description

新冠病毒N-S优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种融合蛋白的制备及应用，具体地说是一种新冠病毒N-S优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。2020年1月31日，世界卫生组织建议将2019年出现的新型冠状病毒肺炎暂命名为“2019-nCoV acute respiratory disease”，把病毒暂命名为“2019-nCoV”（ 2019代表首次出现的年份，n表示novel( 新) ，CoV表示coronavirus( 冠状病毒)）。2月7日，中国国家卫健委发出通知，决定将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”，英文名称为“novel coronavirus pneumonia”，简称“NCP”。2月11日，世界卫生组织发布了新型冠状病毒感染引起的疾病的正式名称“COVID-19”，其中“CO”代表“corona( 冠状物) ”，“VI”代表“virus( 病毒) ”，“D”代表“disease(疾病) ”。同日，国际病毒分类委员会( ICTV) 将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，并强调了新病毒与SARS病毒的相似性。

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。而新型冠状病毒则属于β属的冠状病毒，其具有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。虽然其感染后的临床症状与SARS病毒相似，其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。目前研究显示新型冠状病毒与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85％以上。新型冠状病毒基因组的两端分别包含一个非翻译区，分别为5'-UTR、3'-UTR，其中5'端约3/4包含2个大的重叠的开放读框ORF1a和ORF1b，主要用于编码与病毒复制转录有关的酶类等非结构蛋白，而3'端约1/4的基因用于编码表面棘突（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、小包膜（small envelope membrane，E）蛋白及核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白等主要结构蛋白。

目前临床上，对于病毒感染者的检测包括针对病毒基因的核酸检测，以及针对机体产生的病毒特异性抗体的免疫检测。在临床实验室检测过程中，如果在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列，应提示该患者可能被新型冠状病毒感染，目前对于新冠病毒感染的检测采用的均是核苷检测。但是由于核酸检测受到取样困难、操作复杂、检测时间长等不利因素的限制，会造成部分感染者漏检（例如，我国利用核苷检测对新冠肺炎疑似患者检测的过程中出现了多例核苷检测呈阴性，但后期患者确诊的例子，对疫情的控制造成了一定的影响）。相对核酸检测而言，机体在感染病毒后, 能够产生针对病毒多种抗原成分的特异性抗体, 因此特异性抗体检测是病毒性传染病诊断和流行病学调查的重要指标。此外，由于免疫学检测具有操作简便、检测时间短、最短可在10分钟内完成检测、样本采集可以标准化等优点，而成为病毒感染核酸检测的重要补充，检出核酸检测阴性中的感染者，减少漏检。因此，研发出利用免疫检测法对新型冠状病毒患者的检测装置，能够加快对新冠病毒感染者的确诊，对于疫情的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种新冠病毒（即2019-nCoV）N-S优势表位融合蛋白，以利用上述融合蛋白进行免疫检测来加快新冠病毒感染者的确诊，同时降低漏检率；

本发明其它的发明目的，是要提供上述融合蛋白的制备方法、应用，相应表达蛋白、微生物、应用，试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，其氨基酸序列如下：PSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSP。

作为对本发明的限定：其核酸序列如下：CCGAGCGATTCTACCGGCTCCAACCAGAATGGTGAACGTTCGGGCGCGCGCAGCAAACAACGTCGCCCACAGGGTCTGCCGAACAATACGGCCAGTTGGTTTACTGCGTTGACCCAGCATGGCAAGGAGGACCTGAAATTCCCACGTGGTCAAGGCGTGCCGATTAACACTAATTCTTCGCCAGATGATCAGATCGGTTATTACCGCCGTGCAACGCGCCGTATTCGTGGCGGCGACGGTAAAATGAAGGATTTAAGCCCGCGCTGGTATTTTTACTATCTGGGCACCGGTCCAGAAGCTGGCCTTCCGTACGGTGCGAACAAAGACGGCATCATTTGGGTTGCCACTGAAGGTGCACTGAATACCCCGAAAGATCACATCGGCACCCGTAACCCAGCTAACAATGCGGCCATTGTGCTCCAGCTGCCGCAAGGCACGACTCTGCCAAAGGGTTTCTATGCGGAGGGCAGCCGCGGTGGCTCTCAGGCATCCTCGCGTAGCAGTTCTCGCTCGCGTAACAGCAGCCGCAATTCTACCCCGGGTTCCTCGGCTCCAGCGACTGTCTGCGGCCCGAAAAAAAGCACGAACTTGGTTAAGAATAAATGTGTAAACTTTAATTTCAACGGTCTGACCGGCACTGGCGTGTTAACCGAAAGTAACAAAAAGTTTCTGCCATTCCAGCAATTTGGTCGTGATATCGCCGATACCACGGACGCAGTTCGTGATCCGCAGACTCTTGAAATTCTGGATATTACCCCGTGCTCTTTTGGCGGTGTCTCGGTGATCACTCCAGGCACGAATACCAGCAACCAGGTTGCTGTGCTCTACCAAGACGTCAATTGCACTGAGGTTCCGGTAGCGATTCATGCCGATCAGCTGACCCCAACCTGGCGCGTGTATAGCACGGGTTCTAACGTTTTCCAGACTCGTGCGGGCTGTCTGATCGGTGCAGAACACGTCAATAACTCCTATGAATGCGACATTCCGATCGGCGCTGGCATTTGTGCGTCGTACCAAACCCAGACTAATAGCCCA。

本发明的第二个目的，是要提供上述融合蛋白的一种制备方法，首先将新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段抗原与N蛋白优势表位区段抗原构建成一个融合表达抗原；然后通过基因优化去除稀有密码子获得优化后基因序列，最终获得高效表达的可溶性高活性抗原。

作为对上述方法的限定：所述新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段抗原与N蛋白优势表位区段抗原分别通过表位分析预测进行筛选。

作为对上述方法的另一种限定：建成融合表达抗原的方法为：利用具有互补粘性末端的同尾酶法将N蛋白优势表位区段抗原和S蛋白优势表位区段抗原的编码基因连接在一起进行融合表达。

结构蛋白是冠状病毒血清学抗体检测的主要候选抗原，其中报道最多的是N和S蛋白，而M和E蛋白的报道较少。而N蛋白作为冠状病毒结构蛋白中含量最丰富和保守的蛋白质，常在感染早期病人血清中出现，诱导机体产生大量特异性IgG和IgM抗体，因此成为感染早期检测病毒抗体的首选抗原。与N蛋白相比，一方面，S蛋白特异性抗体滴度在患病前三周低于N蛋白，但是后期则与N蛋白IgG抗体的检出率接近，两者之间存在互补性，因此本发明中以N蛋白和S蛋白组合作为抗原用于SARS-CoV-2的抗体检测，可以比单独使用任何一种抗原进一步提高检测的灵敏度，减少漏检。

本发明的第三个目的，是提供一种表达载体或微生物或细胞，其中表达载体或微生物或细胞均通过表达新冠病毒N-S优势表位融合蛋白制得；所述表达的微生物为细菌，所述细菌为大肠杆菌。

本发明的第四个目的，是提供上述融合蛋白的一种应用，包括新冠病毒N-S优势表位融合蛋白、表达载体、微生物在制备检测新型冠状病毒感染试剂中和/或制备检测抗新型冠状病毒抗体试剂中的应用。

另外，本发明还有一个目的，是提供一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒或一种新型冠状病毒感染检测试剂盒，抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒或新型冠状病毒感染检测试剂盒的检测卡内均具有上述新冠病毒N-S优势表位融合蛋白。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果如下：

（1）本发明的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白以新型冠状病毒的N蛋白和S蛋白组合作为抗原用于SARS-CoV-2的抗体检测，可以比单独使用任何一种抗原检测的灵敏度高，降低了漏检率；

（2）本发明的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白同时涵盖了新型冠状病毒N蛋白的优势表位区段抗原和S蛋白的优势表位区段抗原，并且为可溶性表达，产量高、纯度高、活性好、特异性显著提高；本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒为总抗体检测试剂盒，检测包含IgG和IgM在内的总抗体，检测只需十分钟，检测灵敏度也显著提高。

本发明首先通过表位分析预测，分别筛选确定新型冠状病毒N蛋白优势表位区段抗原和S蛋白优势表位区段抗原；然后将难表达的S蛋白优势表位区段抗原与易表达的N蛋白优势表位区段抗原构建成一个融合表达抗原；通过基因优化去除稀有密码子获得优化后基因序列，最终获得高效表达的可溶性高活性抗原，灵敏度和特异性显著优于非可溶性表达抗原，该抗原适合用于研制血清学抗体检测试剂，用于新型冠状病毒感染患者的辅助诊断，以及与病人密切接触的高危人群及疑似病人的筛查。利用本发明的N-S优势表位融合蛋白在新型冠状病毒总抗体检测中，灵敏度和特异性均为100%。

本发明所提供的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白适用于新型冠状病毒患者的确诊检测。

附图说明

图1为表达的本发明实施例3中N-S优势表位融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明实施例4中乳胶法检测的结果模式图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。

现有技术中抗体检测可以采用裂解的病毒颗粒作为抗原，但是由于SARS-CoV-2培养必须在BSL3实验室中进行，且存在很高的感染危险，因此有必要采用人工表达的抗原代替全病毒作为检测用抗原。先前的文献报道显示N蛋白大小适中，不属于糖蛋白，易于进行高效表达，而由于S蛋白太大，且为糖蛋白，难以在细菌中高效表达全长S蛋白，因此，本发明中有必要选择选择敏感、特异、易表达的区段作为诊断用抗原。

实施例1 N蛋白优势表位区段抗原筛选确定

根据Genebank中公布的新型冠状病毒N蛋白全长氨基酸序列，用BIOSUN软件B-细胞表位分析和信号肽分析功能分析N蛋白氨基酸序列，根据疏水性的强弱及信号肽情况，分别选取抗原性好的20-220aa区段（记为N1）、230-300aa区段（记为N2）和335-419aa区段（记为N3）用作本实施例中筛选N蛋白优势表位的区段抗原。

其中N1至N3区段的基因序列分别为：

N1基因序列为：

PSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALA

N2基因序列为：

LESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKH

N3基因序列为：

GAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA

为了获得高效表达的目的蛋白，对N1-N3各区段的编码基因进行人工改造和优化，并按照常规分子生物学方法分别构建原核表达载体pET30-N1、pET30-N2和pET30-N3。N1-N3优化后的核酸序列分别为：

N1优化核酸序列为：

CCGAGCGATTCTACCGGCTCCAACCAGAATGGTGAACGTTCGGGCGCGCGCAGCAAACAACGTCGCCCACAGGGTCTGCCGAACAATACGGCCAGTTGGTTTACTGCGTTGACCCAGCATGGCAAGGAGGACCTGAAATTCCCACGTGGTCAAGGCGTGCCGATTAACACTAATTCTTCGCCAGATGATCAGATCGGTTATTACCGCCGTGCAACGCGCCGTATTCGTGGCGGCGACGGTAAAATGAAGGATTTAAGCCCGCGCTGGTATTTTTACTATCTGGGCACCGGTCCAGAAGCTGGCCTTCCGTACGGTGCGAACAAAGACGGCATCATTTGGGTTGCCACTGAAGGTGCACTGAATACCCCGAAAGATCACATCGGCACCCGTAACCCAGCTAACAATGCGGCCATTGTGCTCCAGCTGCCGCAAGGCACGACTCTGCCAAAGGGTTTCTATGCGGAGGGCAGCCGCGGTGGCTCTCAGGCATCCTCGCGTAGCAGTTCTCGCTCGCGTAACAGCAGCCGCAATTCTACCCCGGGT

N2优化核酸序列为：

CTGGAAAGCAAAATGTCTGGCAAGGGTCAGCAACAGCAGGGCCAAACCGTGACGAAAAAATCCGCGGCCGAGGCGTCGAAGAAACCGCGTCAGAAACGCACTGCAACCAAGGCTTATAACGTTACTCAGGCGTTTGGTCGTCGCGGCCCAGAACAAACGCAGGGTAATTTCGGCGATCAGGAATTGATTCGTCAAGGTACCGACTACAAACAT

N3优化核酸序列为：

GGCGCGATTAAACTGGATGACAAGGATCCGAACTTTAAAGATCAGGTGATCTTGCTGAATAAACATATTGACGCCTATAAGACCTTCCCACCGACGGAACCAAAAAAAGATAAGAAAAAAAAGGCGGACGAGACTCAAGCATTACCGCAGCGTCAGAAAAAACAACAGACCGTTACTCTGCTTCCAGCTGCGGATCTGGATGATTTTAGCAAGCAGCTCCAACAGTCTATGTCCTCGGCCGACAGCACGCAGGCA

按照顺序进行以下操作：

（1）将测序正确的重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，挑取单菌落于3 ml含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于250ml新鲜的LB液体培养基中，37℃、160r/min培养4h至对数生长期，加150μl 1M的IPTG诱导液，15℃诱导12-14h（本实施例诱导了12.5h）。

（2）4℃，6000r/min离心10min收集诱导后的菌体；用25mM Tris-HCl（PH8.5）重悬菌体，然后对菌体进行冰浴超声。

（3）冰浴超声后的菌体于4℃，12000r/min离心10min后收集上清，过滤得到备用样品。

（4）Ni柱纯化备用样品，平衡后，将处理好的样品缓慢上样，待吸光度值开始上升时，收集穿过液。再次平衡后，用含25 mM咪唑、25mM Tris-HCl(25mM Tris-HCl中含250mM咪唑，溶液的pH 为8.5)的溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析纯化产物，验证纯化后的目的蛋白在250mM咪唑洗脱液中。

将纯化后所获得的N蛋白优势表位区段抗原分别按常规进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别用封闭液稀释的10份新冠肺炎患者血清和10份健康献血员血清（血清与封闭液的体积比为1:50）于4℃孵育过夜。TBST室温洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜1 h。然后TBST室温洗膜3次，以ECL法显示阳性条带。

结果显示在10份新冠肺炎患者血清中，N1表位抗原与8份样本呈现特异性条带，N2表位抗原与6份样本呈现特异性条带，N3表位抗原与2份样本呈现特异性条带；在10份健康献血员血清中，N1和N3表位抗原未呈现非特异性条带，N2表位抗原与1份样本呈现非特异性条带。结果说明在所表达的三种N蛋白区段抗原中，N1优势表位区段抗原具有最佳的抗原活性和特异性。

实施例2 S蛋白优势表位区段抗原筛选确定

根据Genebank中公布的新型冠状病毒S蛋白全长氨基酸序列，采用BIOSUN软件B-细胞表位分析和信号肽分析功能分析S蛋白氨基酸序列，并结合功能结构域分布，分别选取抗原性好的65-290aa区段（记为S1）、340-510aa区段（记为S2）和520-681aa区段（记为S3）三个优势表位区段抗原用作本实施例中筛选S蛋白优势表位的区段抗原。

S1基因序列为：

fhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavd

S2基因序列为：

evfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrv

S3基因序列为

apatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsp

而为了获得高效表达的目的蛋白，对各区段的编码基因进行了人工改造和优化，并按照常规分子生物学方法构建原核表达载体pET30-S1、pET30-S2和pET30-S3，将测序正确的重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，按照实施例1的方法进行诱导表达和抗原纯化，获得纯化后抗原。S1-S3优化后的核酸序列如下：

S1优化核酸序列

TTTCATGCGATTCACGTGAGCGGCACCAACGGTACGAAACGTTTCGATAATCCGGTTCTGCCATTTAACGACGGCGTGTATTTCGCCTCTACTGAAAAGTCCAATATCATTCGCGGTTGGATCTTTGGCACCACTTTGGATTCGAAAACGCAGAGCCTGTTAATTGTCAACAATGCGACCAACGTTGTAATCAAAGTGTGCGAGTTCCAATTTTGTAATGATCCGTTCCTGGGTGTTTACTATCATAAGAACAACAAAAGTTGGATGGAATCTGAATTTCGTGTCTACTCGAGCGCAAATAACTGCACTTTTGAGTATGTGAGCCAGCCATTCCTTATGGACCTGGAAGGCAAACAGGGTAATTTTAAGAACCTCCGCGAATTCGTTTTTAAAAATATTGATGGCTACTTCAAAATCTATTCTAAGCACACCCCGATTAACCTGGTGCGTGACCTGCCACAAGGCTTTTCCGCTTTGGAGCCGCTGGTCGATTTACCAATTGGTATCAATATTACCCGCTTCCAGACGCTGCTTGCGCTGCATCGTTCGTACCTCACTCCGGGCGATAGCAGTTCTGGTTGGACCGCCGGCGCAGCTGCGTATTATGTTGGTTACCTGCAGCCGCGCACTTTTCTGTTGAAATATAACGAAAACGGCACGATCACCGATGCCGTAGAC

S2优化核酸序列

GAAGTGTTTAACGCGACCCGTTTCGCCAGCGTTTATGCGTGGAATCGCAAACGTATTTCTAACTGCGTGGCAGATTACTCCGTCCTGTATAATTCGGCTAGCTTTAGTACGTTCAAGTGTTACGGCGTTTCTCCGACTAAATTGAACGACCTGTGCTTTACCAATGTATATGCGGATTCGTTCGTGATCCGCGGTGATGAGGTTCGTCAGATTGCCCCAGGCCAAACTGGTAAAATCGCAGACTACAACTATAAGTTACCGGATGACTTTACGGGCTGCGTCATTGCTTGGAATAGCAACAACCTGGATAGCAAAGTGGGTGGCAATTACAACTATCTTTATCGCCTGTTCCGTAAATCTAATCTCAAGCCATTTGAACGCGATATCTCCACCGAAATTTACCAGGCGGGTTCGACTCCGTGTAACGGCGTTGAGGGCTTTAATTGCTATTTCCCACTGCAGAGCTACGGTTTTCAACCGACCAACGGCGTGGGTTATCAGCCATACCGTGTC

S3优化核酸序列

GCTCCAGCGACTGTCTGCGGCCCGAAAAAAAGCACGAACTTGGTTAAGAATAAATGTGTAAACTTTAATTTCAACGGTCTGACCGGCACTGGCGTGTTAACCGAAAGTAACAAAAAGTTTCTGCCATTCCAGCAATTTGGTCGTGATATCGCCGATACCACGGACGCAGTTCGTGATCCGCAGACTCTTGAAATTCTGGATATTACCCCGTGCTCTTTTGGCGGTGTCTCGGTGATCACTCCAGGCACGAATACCAGCAACCAGGTTGCTGTGCTCTACCAAGACGTCAATTGCACTGAGGTTCCGGTAGCGATTCATGCCGATCAGCTGACCCCAACCTGGCGCGTGTATAGCACGGGTTCTAACGTTTTCCAGACTCGTGCGGGCTGTCTGATCGGTGCAGAACACGTCAATAACTCCTATGAATGCGACATTCCGATCGGCGCTGGCATTTGTGCGTCGTACCAAACCCAGACTAATAGCCCA

然后，再按照实施例1的WB方法进行活性鉴定。结果显示在10份新冠肺炎患者血清中，S1表位抗原与5份样本呈现特异性条带，S2表位抗原与3份样本呈现特异性条带，S3表位抗原与7份样本呈现特异性条带；在10份健康献血员血清中，S1、S2和S3均未呈现非特异性条带。结果说明本实施例所表达的三种S蛋白区段抗原中，S3优势表位区段抗原具有最佳的抗原活性和特异性。

实施例3 新型冠状病毒的N-S优势表位融合蛋白的制备

本实施例中利用具有互补粘性末端的同尾酶法将N1优势表位区段抗原和S3优势表位区段抗原的编码基因连接在一起进行融合表达，得到新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，其氨基酸序列如下所示：

PSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSP

上述新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的核酸序列如下所示：

CCGAGCGATTCTACCGGCTCCAACCAGAATGGTGAACGTTCGGGCGCGCGCAGCAAACAACGTCGCCCACAGGGTCTGCCGAACAATACGGCCAGTTGGTTTACTGCGTTGACCCAGCATGGCAAGGAGGACCTGAAATTCCCACGTGGTCAAGGCGTGCCGATTAACACTAATTCTTCGCCAGATGATCAGATCGGTTATTACCGCCGTGCAACGCGCCGTATTCGTGGCGGCGACGGTAAAATGAAGGATTTAAGCCCGCGCTGGTATTTTTACTATCTGGGCACCGGTCCAGAAGCTGGCCTTCCGTACGGTGCGAACAAAGACGGCATCATTTGGGTTGCCACTGAAGGTGCACTGAATACCCCGAAAGATCACATCGGCACCCGTAACCCAGCTAACAATGCGGCCATTGTGCTCCAGCTGCCGCAAGGCACGACTCTGCCAAAGGGTTTCTATGCGGAGGGCAGCCGCGGTGGCTCTCAGGCATCCTCGCGTAGCAGTTCTCGCTCGCGTAACAGCAGCCGCAATTCTACCCCGGGTTCCTCGGCTCCAGCGACTGTCTGCGGCCCGAAAAAAAGCACGAACTTGGTTAAGAATAAATGTGTAAACTTTAATTTCAACGGTCTGACCGGCACTGGCGTGTTAACCGAAAGTAACAAAAAGTTTCTGCCATTCCAGCAATTTGGTCGTGATATCGCCGATACCACGGACGCAGTTCGTGATCCGCAGACTCTTGAAATTCTGGATATTACCCCGTGCTCTTTTGGCGGTGTCTCGGTGATCACTCCAGGCACGAATACCAGCAACCAGGTTGCTGTGCTCTACCAAGACGTCAATTGCACTGAGGTTCCGGTAGCGATTCATGCCGATCAGCTGACCCCAACCTGGCGCGTGTATAGCACGGGTTCTAACGTTTTCCAGACTCGTGCGGGCTGTCTGATCGGTGCAGAACACGTCAATAACTCCTATGAATGCGACATTCCGATCGGCGCTGGCATTTGTGCGTCGTACCAAACCCAGACTAATAGCCCA

然后按照常规分子生物学方法构建原核表达载体pET30-N-S，将测序正确的重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，按照实施例1的方法进行诱导表达和抗原纯化，获得纯化后抗原。结果显示N-S优势表位融合蛋白为可溶性表达抗原，纯化后抗原纯度高达99.1%。结果如图1所示。

然后，再按照实施例1的WB方法进行活性鉴定。结果显示本实施例与10份新冠肺炎患者血清均呈现特异性条带，而与10份健康献血员血清未呈现非特异性条带。结果说明N-S优势表位融合蛋白具有非常好的抗原活性和特异性。

实施例4 新型冠状病毒抗体检测试剂盒

一、采用荧光免疫层析法的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒

本实施例的试剂盒采用现有技术中的荧光免疫层析技术及免疫学法原理检测样本中新型冠状病毒IgM抗体的浓度，试剂盒的结构与现有技术中试剂盒的结构相同，均具有检测卡，同时本实施例的检测卡包被有实施例3的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白、鼠抗人IgM抗体和羊抗鼠IgG。具体检测原理为：检测时，将样本加入到试剂盒或检测卡的加样孔中，样本中抗新型冠状病毒IgM和荧光标记鼠抗人IgM抗体发生免疫反应而形成免疫结合物，结合物层析至检测卡T线时，被T线的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白捕获，样本层析至C线时，荧光标记鼠抗人IgM抗体被C线的羊抗鼠IgG捕获，作为质控线。T线处荧光信号强度与样品中抗新型冠状病毒IgM抗体浓度正相关，因此，用适用的干式荧光仪器便可检测出样本中抗新型冠状病毒IgM抗体的浓度。

本试剂盒需要在室温下水平使用，每盒中具有新型冠状病毒IgM抗体检测卡、每人份1支加样吸管、1瓶样品稀释液。加样时具有两种模式，分别为：

全血样品：用加样吸管往加样孔垂直滴加2滴全血，再加入1-2滴样品稀释液，稀释后10分钟，用适配仪器判断结果。

血清/血浆样品：用加样吸管往加样孔内垂直滴加1滴，再加入1-2滴样品稀释液，稀释后10分钟，用适配仪器判断结果。

无论上述哪种检测模式，在加样后，20分钟后观察的结果均为无效结果。

本检测卡对于50例新型冠状病毒感染核酸检测阳性患者的血清样本进行检测后，结果显示检测45出例为阳性，灵敏度为90%；50例健康对照血清样本中，50例检测为阴性，特异性为100%。

二、采用乳胶法的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒

试剂盒检测结果的解释

阳性：质控线(C线)和检测线(T线)各有一条红色线条出现。表明样本中存在新型冠状病毒抗体。

阴性：只有质控线(C线)有一条红色线条，而检测线(T线)无红色线条出现，表示样本中没有新型冠状病毒抗体或新型冠状病毒抗体低于检出水平。

无效：质控线(C线)无红色线条出现，表示失效。可能是由于操作不正确或试剂盒失效，应重试。

本试剂盒结构与现有技术中试剂盒的结构相同，均包括硝酸纤维素膜与彩色乳胶标记的抗人IgM抗体的释放垫及其他试剂。于硝酸纤维素膜上固定有实施例3中的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白。应用乳胶免疫层析技术，采用捕获法的原理检测人血清/血浆/全血中的新型冠状病毒IgM抗体。检测过程中，血液标本加到试剂盒的加样孔中，样品首先和释放垫上的彩色乳胶标记的抗人IgM混合，接着再往硝酸纤维素膜上层析。如果样本中含有新型冠状病毒IgM抗体，这些抗体首先与彩色乳胶标记的抗人IgM的结合，这样混合物往硝酸纤维膜上层析时，便会被固定有新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的检测线（T线）捕获而形成彩色乳胶标记抗人IgM-抗体-抗原的免疫复合物，因而在T线出现一条红色线条，为阳性结果。如果被检者血液中没有新型冠状病毒IgM抗体存在，则不会在检测线（T线）上形成红色线条，为阴性结果。在试剂卡上的质控线（C线）包被有羊抗鼠抗体，正常情况下在检测时质控线上都应有红色线条出现，以证明试剂卡工作正常。

本试剂盒需要在室温下水平使用，每盒中具有新型冠状病毒IgM检测卡、每人份1支加样吸管、1瓶样品稀释液。加样时具有两种模式，分别为：

全血样品：用加样吸管往加样孔垂直滴加2滴全血，再加入1-2滴样品稀释液，稀释后10分钟直接判断结果。。

血清/血浆样品：用加样吸管往加样孔内垂直滴加1滴，再加入1-2滴样品稀释液，稀释后10分钟后直接判断结果。。

本试剂盒在加样后10分钟内判断结果，20分钟后观察结果为无效结果。

乳胶法检测结果模式图如图2所示。

本检测卡对于50例新型冠状病毒感染核酸检测阳性患者的血清样本进行检测后，45例为阳性，灵敏度为90%；50例健康对照血清样本中，50例检测为阴性，特异性为100%。

三、采用荧光免疫层析法的新型冠状病毒IgM/IgG总抗体检测试剂盒

本试剂盒采用干式荧光免疫层析技术及双抗原夹心法原理检测样本中新型冠状病毒IgM/IgG总抗体的浓度。本试剂盒中的新型冠状病毒检测卡上具有实施例3的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白。检测时，将样本加入到检测卡的加样孔中，样本中新型冠状病毒IgM/IgG抗体和荧光标记鼠抗人新型冠状病毒抗原发生免疫反应而形成免疫结合物，结合物层析至检测卡T线时，被T线的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白捕获，样本层析至C线时，荧光标记鼠抗人新型冠状病毒抗原被C线的羊抗鼠IgG捕获，作为质控线。T线处荧光信号强度与样品中抗新型冠状病毒抗体浓度正相关，因此，用适用的干式荧光仪器便可检测出样本中抗新型冠状病毒IgM/IgG总抗体的浓度。

全血样品：用加样吸管往加样孔垂直滴加2滴全血，再加入1-2滴样品稀释液，加样后10分钟，用适配仪器判断结果。

血清/血浆样品：用加样吸管往加样孔内垂直滴加1滴，再加入1-2滴样品稀释液，加样后10分钟，用适配仪器判断结果。

本检测卡对于50例新型冠状病毒感染核酸检测阳性患者的血清样本检测后，显示50例为阳性，灵敏度为100%；50例健康对照血清样本中，50例检测为阴性，特异性为100%。

四、采用乳胶法的新型冠状病毒IgM/IgG总抗体检测试剂盒

检测结果的解释

阳性：质控线(C线)和检测线(T线)各有一条红色线条出现。表明样本中存在新型冠状病毒IgM/IgG总抗体。

阴性：只有质控线(C线)有一条红色线条，而检测线(T线)无红色线条出现。表示样本中没有新型冠状病毒IgM/IgG总抗体，或新型冠状病毒IgM/IgG总抗体低于检出水平。

本试剂盒由硝酸纤维素膜、彩色乳胶标记的抗人新型冠状病毒抗原的释放垫及其他试剂组成。其中硝酸纤维素膜上固定有新型冠状病毒特异性N-S优势表位融合蛋白。检测原理为：应用乳胶免疫层析技术，采用捕获法的原理检测人血清/血浆/全血中的新型冠状病毒IgM/IgG总抗体。检测过程中，血液标本加到试剂盒的加样孔中，样品首先和释放垫上的彩色乳胶标记的抗人新型冠状病毒抗原混合，接着再往硝酸纤维素膜上层析。如果样本中含有新型冠状病毒IgM/IgG总抗体，这些抗体首先与彩色乳胶标记的抗人新型冠状病毒抗原的结合，这样混合物往硝酸纤维膜上层析时，便会被固定有新型冠状病毒抗原的检测线（T线）捕获而形成彩色乳胶标记抗人抗原-抗体-抗原的免疫复合物，因而在T线出现一条红色线条，为阳性结果。如果被检者血液中没有新型冠状病毒IgM/IgG总抗体存在，则不会在检测线（T线）上形成红色线条，为阴性结果。在试剂卡上的质控线（C线）包被有羊抗鼠抗体，正常情况下在检测时质控线上都应有红色线条出现，以证明试剂卡工作正常。

本试剂盒需要在室温下水平使用，每盒中具有新型冠状病毒IgM/IgG总抗体检测试剂卡、每人份1支加样吸管、1瓶样品稀释液。加样时具有两种模式，分别为：

全血样品：用加样吸管往加样孔，垂直滴加2滴全血，再加入1-2滴样品稀释液，在加样后10分钟直接判断结果。

血清/血浆样品：用加样吸管往加样孔内垂直滴加1滴，再加入1-2滴样品稀释液，在加样后10分钟直接判断结果。

本试剂卡在20分钟后观察的结果均为无效结果。其本试剂卡检测结果的模式图仍为图2所示。

本试剂卡对于50例新型冠状病毒感染核酸检测阳性患者的血清样本检测后，结果显示50例为阳性，灵敏度为100%；50例健康对照血清样本中，50例检测为阴性，特异性为100%。

序列表

<110> 河北精硕生物科技有限公司

<120> 新冠病毒N-S优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒

<130> 20200310

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser

20 25 30

Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro

35 40 45

Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln

50 55 60

Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly

65 70 75 80

Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr

85 90 95

Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile

100 105 110

Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly

115 120 125

Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln

130 135 140

Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg

165 170 175

Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

180 185 190

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

195 200 205

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

210 215 220

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

225 230 235 240

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

245 250 255

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

260 265 270

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

275 280 285

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

290 295 300

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

305 310 315 320

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

325 330 335

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro

340 345

<210> 2

<211> 1035

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 2

ccgagcgatt ctaccggctc caaccagaat ggtgaacgtt cgggcgcgcg cagcaaacaa 60

cgtcgcccac agggtctgcc gaacaatacg gccagttggt ttactgcgtt gacccagcat 120

ggcaaggagg acctgaaatt cccacgtggt caaggcgtgc cgattaacac taattcttcg 180

ccagatgatc agatcggtta ttaccgccgt gcaacgcgcc gtattcgtgg cggcgacggt 240

aaaatgaagg atttaagccc gcgctggtat ttttactatc tgggcaccgg tccagaagct 300

ggccttccgt acggtgcgaa caaagacggc atcatttggg ttgccactga aggtgcactg 360

aataccccga aagatcacat cggcacccgt aacccagcta acaatgcggc cattgtgctc 420

cagctgccgc aaggcacgac tctgccaaag ggtttctatg cggagggcag ccgcggtggc 480

tctcaggcat cctcgcgtag cagttctcgc tcgcgtaaca gcagccgcaa ttctaccccg 540

ggttcctcgg ctccagcgac tgtctgcggc ccgaaaaaaa gcacgaactt ggttaagaat 600

aaatgtgtaa actttaattt caacggtctg accggcactg gcgtgttaac cgaaagtaac 660

aaaaagtttc tgccattcca gcaatttggt cgtgatatcg ccgataccac ggacgcagtt 720

cgtgatccgc agactcttga aattctggat attaccccgt gctcttttgg cggtgtctcg 780

gtgatcactc caggcacgaa taccagcaac caggttgctg tgctctacca agacgtcaat 840

tgcactgagg ttccggtagc gattcatgcc gatcagctga ccccaacctg gcgcgtgtat 900

agcacgggtt ctaacgtttt ccagactcgt gcgggctgtc tgatcggtgc agaacacgtc 960

aataactcct atgaatgcga cattccgatc ggcgctggca tttgtgcgtc gtaccaaacc 1020

cagactaata gccca 1035

<210> 3

<211> 201

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 3

Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser

20 25 30

Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro

35 40 45

Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln

50 55 60

Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly

65 70 75 80

Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr

85 90 95

Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile

100 105 110

Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly

115 120 125

Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln

130 135 140

Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg

165 170 175

Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala

180 185 190

Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala

195 200

<210> 4

<211> 543

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 4

ccgagcgatt ctaccggctc caaccagaat ggtgaacgtt cgggcgcgcg cagcaaacaa 60

cgtcgcccac agggtctgcc gaacaatacg gccagttggt ttactgcgtt gacccagcat 120

ggcaaggagg acctgaaatt cccacgtggt caaggcgtgc cgattaacac taattcttcg 180

ccagatgatc agatcggtta ttaccgccgt gcaacgcgcc gtattcgtgg cggcgacggt 240

aaaatgaagg atttaagccc gcgctggtat ttttactatc tgggcaccgg tccagaagct 300

ggccttccgt acggtgcgaa caaagacggc atcatttggg ttgccactga aggtgcactg 360

aataccccga aagatcacat cggcacccgt aacccagcta acaatgcggc cattgtgctc 420

cagctgccgc aaggcacgac tctgccaaag ggtttctatg cggagggcag ccgcggtggc 480

tctcaggcat cctcgcgtag cagttctcgc tcgcgtaaca gcagccgcaa ttctaccccg 540

ggt 543

<210> 5

<211> 71

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 5

Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys

20 25 30

Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg

35 40 45

Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg

50 55 60

Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His

65 70

<210> 6

<211> 213

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 6

ctggaaagca aaatgtctgg caagggtcag caacagcagg gccaaaccgt gacgaaaaaa 60

tccgcggccg aggcgtcgaa gaaaccgcgt cagaaacgca ctgcaaccaa ggcttataac 120

gttactcagg cgtttggtcg tcgcggccca gaacaaacgc agggtaattt cggcgatcag 180

gaattgattc gtcaaggtac cgactacaaa cat 213

<210> 7

<211> 85

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 7

Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val

1 5 10 15

Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr

20 25 30

Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu

35 40 45

Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala

50 55 60

Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala

65 70 75 80

Asp Ser Thr Gln Ala

85

<210> 8

<211> 255

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 8

ggcgcgatta aactggatga caaggatccg aactttaaag atcaggtgat cttgctgaat 60

aaacatattg acgcctataa gaccttccca ccgacggaac caaaaaaaga taagaaaaaa 120

aaggcggacg agactcaagc attaccgcag cgtcagaaaa aacaacagac cgttactctg 180

cttccagctg cggatctgga tgattttagc aagcagctcc aacagtctat gtcctcggcc 240

gacagcacgc aggca 255

<210> 9

<211> 226

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 9

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

1 5 10 15

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

20 25 30

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

35 40 45

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

50 55 60

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

65 70 75 80

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

85 90 95

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

100 105 110

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

115 120 125

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

130 135 140

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

145 150 155 160

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

165 170 175

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

180 185 190

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

195 200 205

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

210 215 220

Val Asp

225

<210> 10

<211> 678

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 10

tttcatgcga ttcacgtgag cggcaccaac ggtacgaaac gtttcgataa tccggttctg 60

ccatttaacg acggcgtgta tttcgcctct actgaaaagt ccaatatcat tcgcggttgg 120

atctttggca ccactttgga ttcgaaaacg cagagcctgt taattgtcaa caatgcgacc 180

aacgttgtaa tcaaagtgtg cgagttccaa ttttgtaatg atccgttcct gggtgtttac 240

tatcataaga acaacaaaag ttggatggaa tctgaatttc gtgtctactc gagcgcaaat 300

aactgcactt ttgagtatgt gagccagcca ttccttatgg acctggaagg caaacagggt 360

aattttaaga acctccgcga attcgttttt aaaaatattg atggctactt caaaatctat 420

tctaagcaca ccccgattaa cctggtgcgt gacctgccac aaggcttttc cgctttggag 480

ccgctggtcg atttaccaat tggtatcaat attacccgct tccagacgct gcttgcgctg 540

catcgttcgt acctcactcc gggcgatagc agttctggtt ggaccgccgg cgcagctgcg 600

tattatgttg gttacctgca gccgcgcact tttctgttga aatataacga aaacggcacg 660

atcaccgatg ccgtagac 678

<210> 11

<211> 171

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 11

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

1 5 10 15

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

20 25 30

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

35 40 45

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

50 55 60

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

85 90 95

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

100 105 110

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

115 120 125

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

130 135 140

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

145 150 155 160

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

165 170

<210> 12

<211> 513

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 12

gaagtgttta acgcgacccg tttcgccagc gtttatgcgt ggaatcgcaa acgtatttct 60

aactgcgtgg cagattactc cgtcctgtat aattcggcta gctttagtac gttcaagtgt 120

tacggcgttt ctccgactaa attgaacgac ctgtgcttta ccaatgtata tgcggattcg 180

ttcgtgatcc gcggtgatga ggttcgtcag attgccccag gccaaactgg taaaatcgca 240

gactacaact ataagttacc ggatgacttt acgggctgcg tcattgcttg gaatagcaac 300

aacctggata gcaaagtggg tggcaattac aactatcttt atcgcctgtt ccgtaaatct 360

aatctcaagc catttgaacg cgatatctcc accgaaattt accaggcggg ttcgactccg 420

tgtaacggcg ttgagggctt taattgctat ttcccactgc agagctacgg ttttcaaccg 480

accaacggcg tgggttatca gccataccgt gtc 513

<210> 13

<211> 162

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 13

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

1 5 10 15

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

20 25 30

Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg

35 40 45

Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

50 55 60

Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr

65 70 75 80

Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val

85 90 95

Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro

100 105 110

Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala

115 120 125

Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp

130 135 140

Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn

145 150 155 160

Ser Pro

<210> 14

<211> 486

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 14

gctccagcga ctgtctgcgg cccgaaaaaa agcacgaact tggttaagaa taaatgtgta 60

aactttaatt tcaacggtct gaccggcact ggcgtgttaa ccgaaagtaa caaaaagttt 120

ctgccattcc agcaatttgg tcgtgatatc gccgatacca cggacgcagt tcgtgatccg 180

cagactcttg aaattctgga tattaccccg tgctcttttg gcggtgtctc ggtgatcact 240

ccaggcacga ataccagcaa ccaggttgct gtgctctacc aagacgtcaa ttgcactgag 300

gttccggtag cgattcatgc cgatcagctg accccaacct ggcgcgtgta tagcacgggt 360

tctaacgttt tccagactcg tgcgggctgt ctgatcggtg cagaacacgt caataactcc 420

tatgaatgcg acattccgat cggcgctggc atttgtgcgt cgtaccaaac ccagactaat 480

agccca 486

Claims

1.一种新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白的氨基酸序列如下：PSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSP。

2.如权利要求1所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，其特征在于：其核酸序列如下：CCGAGCGATTCTACCGGCTCCAACCAGAATGGTGAACGTTCGGGCGCGCGCAGCAAACAACGTCGCCCACAGGGTCTGCCGAACAATACGGCCAGTTGGTTTACTGCGTTGACCCAGCATGGCAAGGAGGACCTGAAATTCCCACGTGGTCAAGGCGTGCCGATTAACACTAATTCTTCGCCAGATGATCAGATCGGTTATTACCGCCGTGCAACGCGCCGTATTCGTGGCGGCGACGGTAAAATGAAGGATTTAAGCCCGCGCTGGTATTTTTACTATCTGGGCACCGGTCCAGAAGCTGGCCTTCCGTACGGTGCGAACAAAGACGGCATCATTTGGGTTGCCACTGAAGGTGCACTGAATACCCCGAAAGATCACATCGGCACCCGTAACCCAGCTAACAATGCGGCCATTGTGCTCCAGCTGCCGCAAGGCACGACTCTGCCAAAGGGTTTCTATGCGGAGGGCAGCCGCGGTGGCTCTCAGGCATCCTCGCGTAGCAGTTCTCGCTCGCGTAACAGCAGCCGCAATTCTACCCCGGGTTCCTCGGCTCCAGCGACTGTCTGCGGCCCGAAAAAAAGCACGAACTTGGTTAAGAATAAATGTGTAAACTTTAATTTCAACGGTCTGACCGGCACTGGCGTGTTAACCGAAAGTAACAAAAAGTTTCTGCCATTCCAGCAATTTGGTCGTGATATCGCCGATACCACGGACGCAGTTCGTGATCCGCAGACTCTTGAAATTCTGGATATTACCCCGTGCTCTTTTGGCGGTGTCTCGGTGATCACTCCAGGCACGAATACCAGCAACCAGGTTGCTGTGCTCTACCAAGACGTCAATTGCACTGAGGTTCCGGTAGCGATTCATGCCGATCAGCTGACCCCAACCTGGCGCGTGTATAGCACGGGTTCTAACGTTTTCCAGACTCGTGCGGGCTGTCTGATCGGTGCAGAACACGTCAATAACTCCTATGAATGCGACATTCCGATCGGCGCTGGCATTTGTGCGTCGTACCAAACCCAGACTAATAGCCCA。

3.如权利要求1或2所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白一种应用，其特征在于它在制备检测新型冠状病毒感染试剂中和/或制备检测抗新型冠状病毒抗体试剂中的应用。

4.如权利要求1或2所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的一种制备方法，其特征在于：首先将新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段抗原与N蛋白优势表位区段抗原构建成一个融合表达抗原；然后通过基因优化去除稀有密码子获得优化后基因序列，最终获得高效表达的可溶性高活性抗原。

5.如权利要求4所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述新型冠状病毒的S蛋白优势表位区段抗原与N蛋白优势表位区段抗原分别通过表位分析预测进行筛选。

6.如权利要求4或5所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的制备方法，其特征在于：建成融合表达抗原的方法为：利用具有互补粘性末端的同尾酶法将N蛋白优势表位区段抗原和S蛋白优势表位区段抗原的编码基因连接在一起进行融合表达。

7.一种通过表达如权利要求1或2中所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的表达载体。

8.一种通过表达如权利要求1或2中所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白的微生物。

9.如权利要求8所述的微生物，其特征在于：所述微生物为细菌，所述细菌为大肠杆菌。

10.一种如权利要求7所述表达载体在制备检测新型冠状病毒感染试剂中和/或在制备检测抗新型冠状病毒抗体试剂中的应用。

11.一种如要求8或9所述的微生物在制备检测新型冠状病毒感染试剂中和/或在制备检测抗新型冠状病毒抗体试剂中的应用。

12.一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：其检测卡中具有如权利要求1或2所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，检测方法为荧光免疫层析法。

13.一种抗新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：其检测卡中具有如权利要求1或2所述的新冠病毒N-S优势表位融合蛋白，检测方法为乳胶法。