CN111647054B

CN111647054B - 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的试剂及其应用

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Publication number: CN111647054B
Application number: CN202010533738.XA
Authority: CN
Inventors: 赵文祥; 刘明耀; 魏海涛; 褚敏; 晁瑞华; 尚玉栓; 王平; 李亚男; 夏永洋
Original assignee: Zhejiang Xiangyao Biomedical Co ltd; Shanghai Xiangyao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Xiangyao Biomedical Co ltd; Shanghai Xiangyao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111647054A

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2抗体的试剂及其应用，其具体涉及一种多肽，其序列包括对应于如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2 S蛋白序列和/或N蛋白序列的部分氨基酸位点中的一种或多种，且上述多肽具有S蛋白抗原性和/或N蛋白抗原性；还具体涉及用于合成上述多肽的引物组合物，上述多肽的制备方法，上述多肽在制备检测或诊断新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的试剂中的应用，具体可用于制备胶体金试剂条及其试剂盒。本发明所设计的特异性引物能够成功合成具有优异结合活性的S蛋白/N蛋白抗原肽，且由其制备的胶体金层析试剂条，能够快速有效检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2 S蛋白抗体/N蛋白抗体，并避免假阴性结果的产生，检测效率高，有利于及早预防疫情扩散。

Description

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的试剂及其应用

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2抗体的试剂及其应用，具体地为检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 刺突蛋白Spike和/或N蛋白的IgM与IgG抗体的试剂，更具体地为制备新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原肽以采用胶体金侧向层析法进行抗体检测。

背景技术

2019年年底出现的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）以来，世界各国的研究者们正在研究快速而准确的新型冠状病毒检测方法，目前主要方法有分子检测，抗体检测以及细胞培养。

（1）分子测试（PCR法）：操作繁琐、耗时长、需要集中送检等限制，还不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者等排查诊断的检测需求；同时受咽拭子取样的限制等影响，阳性率只有30%-50%；

（2）抗体检测，其包括ELISA法、IFA 法和胶体金层析法：

ELISA法（酶联免疫吸附反应）：ELISA法要求抗原纯度高，特异性好，否则会出现非特异反应，操作程序较复杂，需反复洗涤，若洗涤次数不够或过多易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，实验时间较长，需两小时以上得出检测结果。该法必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便；

IFA 法（荧光免疫）：灵敏度高，但必须具备荧光免疫显微镜和暗室条件，为获得良好荧光观察效果必须配备合适的滤光片，实验时间需两小时，结果检测于荧光免疫显微镜下进行，必须由有经验的专业技术人员判定检测结果；

胶体金层析法：胶体金免疫层析技术是近年来发展迅速的一种简便、快速的免疫学检测方法，其采用检测病毒抗体的试剂，可应用于医院、机场、海关、家庭等场所，能够在几分钟内判断结果，从而及早预防疫情扩散；血液检测解决咽拭子取样不尽准确的问题。但目前适用于新型冠状病毒抗体检测的胶体金层析法的研究较少，且其准确度及灵敏度有待进一步提高。

（3）细胞培养：细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件（无菌操作间、超净工作台、操作间等），需要大量仪器设备（培养箱、离心机、显微镜、离心机等），需要大量专业实验器材（多种培养器皿），实验技术复杂，需要有经验的专业技术人员操作，且实验周期很长（需数月），不适宜疾病的快速检测。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的缺陷，本发明提供一种检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2抗体的试剂及其应用，具体为检测刺突蛋白Spike抗体和/或N蛋白抗体的试剂，可应用于医院、机场、海关、家庭等场所，能够在几分钟内判断结果，从而及早预防疫情扩散。

本发明上述试剂的工作原理如下：病毒在进入人体后会诱导免疫系统产生相应的抗体，本发明所述的试剂可以同时检测IgM和IgG两种抗体。其中IgM是在病毒感染早期产生的，可以用于评价病毒的早期感染；IgG在感染的后期逐渐增加，主要发挥彻底清除病毒的作用，可用于评价患者体内免疫应答情况或疫苗免疫效果。本发明所述的试剂是从免疫应答的角度检测病毒的感染，与目前通用的病毒核酸检测试剂盒恰好形成互补，可有效避免假阴性结果的产生。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种多肽，其序列为对应于如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白序列中的部分氨基酸位点和/或对应于如SEQ ID NO.2所示的新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白序列中的部分氨基酸位点中的一种或多种。

进一步地，所述多肽的序列具体包括表1和表2中所示的多肽氨基酸序列。

进一步地，所述多肽具有新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白抗原性和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白抗原性；其中，所述具有新型冠状病毒 SARS-CoV-2Spike蛋白抗原性的多肽序列为：对应SEQ ID NO.1所示序列的 24-38位、64-78位、104-118位、144-158位、184-198位、224-238位、254-268 位、294-308位、334-348位、374-388位、414-428位、454-468位、494-508位、 534-548位、574-588位、614-628位、654-668位、694-708位、1004-1018位、 1044-1058位、1084-1098位、1124-1138位、1164-1178位、1204-1218位、1264-1273位中的一种或多种；其中，所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白抗原性的多肽序列为：对应SEQ ID NO.2所示序列的31-45位、191-205位、231-245位、 271-285位、311-325位、351-365位、391-405位中的一种或多种。

更进一步地，所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白抗原性的多肽序列为：对应SEQ ID NO.1所示序列的224-238位、254-268位、294-308位中的一种或多种；所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白抗原性的多肽序列为：对应SEQ ID NO.2所示序列的31-45位、231-245位。

本发明的第二个方面是提供一种用于合成任一上述的多肽的引物组合物。

进一步地，所述引物组合物为选自SEQ ID NO.3～338所示序列的引物中的一组或多组。

进一步地，各所述引物带有粘性末端。

进一步地，合成的所述多肽及其对应的引物序列如表1和表2中所示。

上述Spike蛋白和N蛋白全长序列如下所示：

上述多肽序列及其对应的引物序列如下所示：

表1-对应Spike蛋白的多肽序列及其引物序列

注：上表中引物序列中小写英文形式的为引物的粘性末端。

表2-对应N蛋白的多肽序列及其引物序列

注：上表引物序列中小写英文形式的为引物的粘性末端。

本发明的第三个方面是提供一种任一项上述的多肽的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)根据所需合成的多肽序列设计引物对，将所述引物对进行PCR退火处理，形成具有粘性末端的多肽核苷酸片段；

步骤2)将经过酶切预处理的质粒载体与所述步骤1)中的多肽核苷酸片段进行连接，使用感受态细胞进行转化，测序获得多肽展示质粒；

步骤3)利用所述多肽展示质粒制备噬菌体展示抗原肽库，并采用抗体筛选阳性克隆以获得具有结合活性的抗原肽。

进一步地，所述制备方法中，PCR退火处理的反应条件及其反应体系具体如下：95℃变性5min；72℃10min；25℃60min，产物可4℃短暂保存；

PCR反应体系：

	体积(μL)
		上游引物(2μM)	5
下游引物(2μM)	5
		2X Annealing Buffer	40
总体积	50

其中，2X Annealing Buffer：20mM Tris pH 8.0，2mM EDTA，100mM NaCl。

进一步地，所述制备方法中，所述质粒载体的酶切预处理步骤及其反应体系具体如下：其采用的为pXY载体，37℃水浴酶切5h，酶切结束后进行胶回收；

酶切体系：

pXY	50μg
		Not I-HF	5μL
Nco I-HF	5μL
		CutSmart 10×	20μL
ddH<sub>2</sub>O	up 200μL
		total	200μL

进一步地，所述制备方法中，质粒载体与多肽核苷酸片段的连接条件及其体系如下：16℃连接30min；

连接体系：

	体积(μL)
		pXY(NcoI/NotI)	0.5
多肽核酸片段	8
		T4 Ligase	0.5
T4 Ligase Buffer	1
		总体积	10

进一步地，所述制备方法中，所述步骤3)具体包括：对测序正确的侵染大肠杆菌的单克隆进行接种培养，过夜培养后转接至新的培养基中，培养至对数生长期后加入辅助噬菌体，静止侵染，离心，使用培养基过夜培养；离心取噬菌体上清进行ELISA鉴定克隆；用Spike抗体或N抗体包被酶标板，封闭过夜，加入噬菌体上清孵育；洗去未结合的噬菌体后加入抗体(HRP)孵育；洗涤后加入显色液显色，终止反应，用酶标仪于450nm读数，OD450>三倍基线，即 OD450>0.5的判定为阳性克隆，上述阳性克隆均具结合活性；进一步地，上述步骤还可对结合活性最高的S蛋白或N蛋白特异性肽段进行合成。

本发明的第四个方面是提供一种含有上述制备方法中的所述多肽核苷酸片段的载体，包括但不限于质粒、大肠杆菌、噬菌体等。

本发明的第五个方面是提供一种任一上述的多肽在制备检测或诊断新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂中的应用，所述试剂能够特异性地与新型冠状病毒 SARS-CoV-2Spike蛋白的抗体结合和/或与新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白的抗体结合。进一步地，所述抗体为IgM抗体和/或IgG抗体。

本发明的第六个方面是提供一种含有任一上述多肽的产品，所述产品用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白的抗体和/或新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体。

进一步地，所述抗体为IgM抗体和/或IgG抗体。

进一步地，所述产品为胶体金试剂条以及含有所述试剂条的试剂盒。

进一步地，所述胶体金试剂条包括NC膜和金标垫，所述NC膜上分别包被抗人IgG抗体和抗人IgM抗体，所述金标垫上包被具有新型冠状病毒 SARS-CoV-2Spike蛋白抗原性的多肽和/或具有新型冠状病毒SARS-CoV-2N蛋白抗原性的多肽中的一种或几种。

本发明的第七个方面是提供一种胶体金试剂条的制备方法，其包括下述步骤：

(1)制备任一上述的具有抗原性的多肽；

(2)制备包被膜：稀释抗体，将预定浓度的鼠抗人IgG抗体喷到NC膜上，记为G线；将预定浓度的鼠抗人IgM抗体喷到NC膜上，记为M线；将预定浓度的山羊抗鼠IgG抗体喷到NC膜上，记为C线；

(3)制备金标表位肽：调节胶体金pH值至7～8，按照预定浓度加入等比例预先混合的步骤(1)制备的多肽，同时加入预定浓度的小鼠IgG抗体，充分混匀，静置，离心，弃上清，沉淀用金标洗涤液洗涤，最后一次弃上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解；将标记好的胶体金均匀的铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，封袋，4℃保存；

(4)进行试剂条的装配：吸水纸、NC膜、金标垫以及样品垫，依次交叠粘贴在胶板上，切条组装，生成成品检测条。

进一步地，在上述制备金标表位肽过程使用的试剂包括：

金标洗涤液：1％BSA，0.01mol/L PBS，PH 10.55；

金标抗体保存液：1％BSA，0.5％PEG20000，2％蔗糖，0.05％NaN₃的0.01 mol/LPBS，PH 10.55；

金标结合垫封闭液：0.01M PBS，1％BSA，1％Tween-20，pH 7.4。

本发明的第七个方面是提供一种基于非诊断目的的检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2的方法，其中，所述方法利用任一上述的具有抗原性的多肽采用胶体金层析法进行Spike蛋白的抗体和/或N蛋白的抗体的检测。

进一步地，在上述检测方法中，其检测灵敏度为：可肉眼观察检测50ng/ml S 蛋白IgM抗体、10ng/ml S蛋白IgG抗体、10ng/ml N蛋白IgM抗体、10ng/ml 的IgG抗体。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：

本发明通过特异性的引物合成对应S蛋白/N蛋白部分氨基酸位点的多肽，并构建了抗原肽质粒展示库和噬菌体展示抗原肽库，以筛选出阳性克隆从而获得具有优异结合活性的抗原肽。本发明采用胶体金免疫层析技术，将上述筛选的抗原肽(纯化的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S蛋白抗原肽或N蛋白抗原肽)作为固相物，利用间接法检测血清中是否含有人抗新型冠状病毒抗体。当待检样本中含有人抗新型冠状病毒抗体时，抗体先和金标记的抗原结合，由于层析作用，反应复合物沿包被膜向前移动，当遇到包被抗抗体时，形成抗体--金标抗原--抗抗体复合物而富集在包被线上形成红色沉淀线，为阳性结果，从而快速诊断样本中是否含有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的IgM/IgG抗体，其与目前通用的病毒核酸检测试剂盒形成互补，可有效避免假阴性结果的产生，且上述检测试剂及检测方法可应用于医院、机场、海关、家庭等场所，能够在几分钟内判断结果，从而及早预防疫情扩散。

附图说明

图1为本发明一实施例中ELISA检测抗原肽与Spike蛋白抗体的结合活性的示意图；

图2为本发明一实施例中ELISA检测抗原肽与N蛋白抗体的结合活性的示意图；

图3为本发明一实施例中胶体金检测条的组装示意图；

图4为本发明一实施例中胶体金检测条的检测结果判读示意图；

图5为本发明一实施例中基于S蛋白多肽的检测试剂灵敏度检测结果示意图；

图6为本发明一实施例中基于S蛋白多肽的检测试剂的康复病人血清检测结果示意图；

图7为本发明一实施例中基于S蛋白多肽的检测试剂的健康人血清检测结果示意图；

图8为本发明一实施例中基于N蛋白多肽的检测试剂灵敏度检测结果示意图；

图9为本发明一实施例中基于N蛋白多肽的检测试剂的康复病人血清检测结果示意图；

图10为本发明一实施例中基于N蛋白多肽的检测试剂的健康人血清检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择；下述实施例中相关试剂及生物材料均为市售产品。

实施例1-S蛋白抗原肽展示库的构建以及抗原肽展示库Phage的制备及筛选S蛋白(Spike蛋白)是膜蛋白，其构成病毒的包颗粒，是病毒感染宿主细胞的主要成分。新型冠状病毒要感染细胞，首先要将其遗传物质RNA导入到宿主细胞中，这一过程主要是通过S蛋白来完成的。S蛋白的突起是其与受体相互作用和膜融合的关键部位。合成S蛋白抗原肽的实验步骤包括：

一、S蛋白抗原肽展示库的构建；

(1)根据上述如SEQ ID NO.1所示的Spike蛋白全长序列以及所需合成的多肽序列设计其相应的引物对，所需合成的多肽编号为S1～S126，其对应于Spike 蛋白的部分氨基酸位点，其对应的引物编号为S1F/S1R～S126F/S126R(SEQ ID NO.3～254)，各引物均带有粘性末端。多肽序列、其对应的氨基酸位点及其设计的特异性引物如上表1所示。

(3)分别将合成的带有粘性末端的上游引物和下游引物在PCR仪中进行退火处理，形成具有粘性末端的多肽核苷酸片段，其原理为上游引物与下游引物二者反向互补，即S1F与S1R、S2F与S2R…分别为一组。

反应体系如下：

	体积(uL)
		上游引物(2μM)	5
下游引物(2μM)	5
		2X Annealing Buffer	40
总体积	50

按上表将反应溶液加入到PCR管中，混合均匀。将PCR反应管置于PCR 仪中，设置反应条件：95℃变性5min；72℃10min；25℃60min；产物可4℃ 短暂保存，用于后续实验。

2X Annealing Buffer：20mM Tris pH 8.0，2mM EDTA，100mM NaCl。

(3)多肽展示质粒的构建；

(A)pXY载体的预处理：

酶切体系如下：

37℃，水浴酶切5h，酶切结束后进行胶回收。

纯化水清洗电泳槽，更换新的1×TAE buffer。酶切后的体系每管加100μL 10×loading buffer，混匀，点样，每孔点样50μL，150V电泳30min。凝胶成像仪拍胶保存图片。

在切胶仪上将约4000bp左右的目的片段切下来，转移至预先称重的5mL 离心管中，称重，得到胶块的重量，使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。

用Nano-300测定DNA浓度，稀释至浓度为50ng/uL。

(B)载体与多肽核酸片段连接

连接体系如下：

按照上述连接体系进行连接反应，16℃连接30min，使用大肠杆菌TG1感受态进行转化涂板，第二天挑菌送测。比对测序结果，获得正确序列的多肽展示质粒，进行后续试验。

二、抗原肽展示库Phage的制备及筛选

对1-126号测序正确的侵染大肠杆菌TGl的单克隆，接种于96孔板中，培养基为2YT/2％glucose/(100μg/ml Ampicilline)。37℃/250rpm过夜培养后转接至新的培养基中，培养至对数生长期后加入M13K07辅助噬菌体，37℃静止侵染1h。4000rpm离心15min，使用2YT/(100μg/ml Ampicilline)/(70μg/ml Kanamycin)培养基30℃过夜培养。离心取噬菌体上清进行ELISA鉴定克隆。用1μg/ml的Spike抗体包被Costar-9018酶标板，3％BSA 4℃封闭过夜，加入噬菌体上清4℃孵育2h。洗去未结合的噬菌体后加入Ml3 Bacteriophage抗体 (HRP)，4℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应，用酶标仪于450nm读数，OD450>三倍基线，即OD450>0.5的判定为阳性克隆，共25个阳性克隆，分别为S2、S6、S10、S14、S18、S22、S25、S29、S33、S37、 S41、S45、S49、S53、S57、S61、S65、S69、S100、S104、S108、S112、S116、S120以及S126，结果如图1所示。最终对结合活性最高的SARS-CoV-2S蛋白特异的三条肽段S22、S25以及S29进行合成。

实施例2-采用S蛋白抗原肽制备胶体金检测试剂条及其效果验证

本实施例采用实施例1中筛选的SARS-CoV-2刺突蛋白Spike的优势表位肽作为固相物，利用间接法原理检测血清中是否含有抗新型冠状病毒的抗体，胶体金检测试剂条的制备步骤包括：

(1)按照实施例1中的步骤合成优势表位肽S22、S25以及S29；

(2)包被膜的制备：0.01mol/L PBS稀释抗体，鼠抗人IgG抗体浓度为 1.0mg/mL喷到NC膜上，记为G线；鼠抗人IgM抗体浓度为1.0mg/mL喷到NC 膜上，记为M线；山羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/mL，喷到NC膜上，记为C 线；

(3)金标表位肽的制备：0.1M的K₂CO₃溶液调节胶体金pH值至7.5，按照15μg/mL加入等比例预先混合的表位肽S22、S25以及S29，同时加入15μg/mL 小鼠IgG抗体，充分混匀，静置30分钟，13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用金标洗涤液洗涤两次，最后一次弃上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解。将标记好的胶体金均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4平方厘米，冷冻干燥，封袋，4℃保存；

在该步骤中，涉及的试剂包括：

金标洗涤液：1％BSA，0.01mol/L PBS，PH 10.55；

金标结合垫封闭液：0.01M PBS，1％BSA，1％Tween-20，pH 7.4；

(4)试剂条的装配：吸水纸、NC膜、金标垫以及样品垫，依次交叠粘贴在胶板上，切条组装，生成成品检测条，检测条的组装如图3所示，该检测条可用于制备检测试剂盒，试剂盒包含内置检测条的样品盒，可选地，试剂盒还可包含一次性采血器、血液稀释液等。

(5)检测试剂盒使用方法及结果判定

检测条准备：从样品盒中取出适当数量的检测条并平衡到室温。撕开箔袋，取出检测条。将检测条水平放置。

采血：采血前尽量使双手温暖红润，血液充盈，轻轻揉压要采血手指指尖 1-2分钟，用医用酒精棉球对采血手指进行消毒，约半分钟后待酒精完全挥发后，使用一次性采血器进行采血。取下采血器保护帽，按住待采血手指，并暴露出采血部位，把采血针端面放在选定的采血部位，然后按压到底，当听到“咔擦”一声时表示已经完成扎针。轻轻挤压一次性毛细管头部，再缓慢释放，在负压作用下指尖血被采集入毛细管中，取样时应避免气泡产生。

血样检测：垂直滴加1滴(大约30μL)血样到样品孔中(S)，然后加入稀释液3滴(大约120μL)到样品孔中。

读取结果：加入样本后十分钟之后半小时之内读取结果。视窗C为控制线， G为IgG线，M为IgM线。

上述检测条的判定结果如图4所示：

IgG阳性结果：控制线和IgG线在测试条上可见。检测结果为IgG抗体阳性。这表示病人处于感染的恢复期。

IgM阳性结果：控制线C线和IgM线在测试条上可见。IgM抗体检测呈阳性，表明患者处于感染的急性期。

IgM/IgG双阳性结果：控制线、IgM线、IgG线在测试条上清晰可见。检测 IgM和IgG抗体阳性。表明患者处于感染的急性晚期。

阴性结果：控制线是检测条中唯一可见的线。未检测到IgG或IgM抗体。结果并不排除感染。如果症状持续存在，应在3-5天内从患者身上提取新的样本，然后重新进行测试。

无效结果：如果控制线没有出现在测试条中，那么无论测试条中是否存在其它可见线，测试结果都是无效的。需更换检测条重新测试。

(6)试剂盒灵敏度检测

使用不同浓度S蛋白IgM与IgG抗体作为样品，IgM浓度分别为0.5μg/ml、 0.05μg/ml与0.005μg/ml，IgG浓度分别为0.01μg/ml、0.001μg/ml与0.0001μg/ml，检测试剂条的灵敏度，其检测结果如图5所示。本实施例所述的试剂条可以达到肉眼观察检测50ng/ml S蛋白IgM抗体与10ng/ml S蛋白IgG抗体的灵敏度。

(7)试剂盒特异性检测

检测SARS-CoV-2 3例经PCR鉴定阳性的恢复期样本以及10例健康人的血样，检测试剂条特异性，其结果如图6和图7所示。经检测条检测，3例PCR 鉴定阳性血清在胶体金检测中均呈阳性，10例健康人血样检测结果均呈阴性。

使用正式生产的第一批S蛋白多肽的样品，使用恢复期样品及健康人样品测试，检测试剂条准确度，实验结果为：100例经PCR鉴定阳性的样本，95例抗体检测结果呈阳性，检出概率为95％，30例阴性样品为核酸检测等为确定的患者或则健康人的血样，经抗体检测试剂检测后，结果均呈阴性，符合率100％。

实施例3-N蛋白抗原肽展示库的构建以及抗原肽展示库Phage的制备及筛选

N蛋白是冠状病毒中一种重要的结构蛋白，N蛋白处于病毒颗粒的核心部分，以与基因组RNA结合的形式存。合成N蛋白抗原肽的实验步骤包括：

一、N蛋白抗原肽展示库的构建；

(1)根据上述如SEQ ID NO.2所示的N蛋白全长序列以及所需合成的多肽序列设计其相应的引物对，所需合成的多肽编号为N1～N42，其对应于N蛋白的部分氨基酸位点，其对应的引物编号为N1F/N1R～N42F/N42R(SEQ ID NO. 255～338)，各引物均带有粘性末端。多肽序列、其对应的氨基酸位点及其设计的特异性引物如上表2所示。

(2)采用与实施例1中的相同步骤形成具有粘性末端的多肽核苷酸片段，并构建多肽展示质粒；

(3)采用与实施例1中的相同步骤制备抗原肽展示库Phage并筛选，其结果为获得共7个阳性克隆，分别为N4、N20、N24、N28、N32、N36以及N40，结果如图2所示。最终对结合活性最高的两条特异肽段N4、N24进行合成。

实施例4-采用N蛋白抗原肽制备胶体金检测试剂条及效果验证

本实施例采用实施例3中筛选的SARS-CoV-2N蛋白的优势表位肽N4、N24 的混合物作为固相物，利用间接法原理检测血清中是否含有抗新型冠状病毒的抗体，其胶体金检测试剂条的制备步骤与实施例2相同，并将制备的检测条制成试剂盒。

试剂盒灵敏度检测：使用不同浓度N蛋白IgM与IgG抗体作为样品，抗体浓度分别为0.01μg/ml、0.001μg/ml与0.0001μg/ml，检测试剂条的灵敏度，其结果如图8所示。本实施例所述的试剂条可以达到肉眼观察检测10ng/ml N蛋白IgM抗体与10ng/ml的IgG抗体的灵敏度。

试剂盒特异性检测：检测SARS-CoV-2 3例经PCR鉴定阳性的恢复期样本以及10例健康人的血样，检测试剂条特异性，其结果如图9和图10所示。经检测条检测，3例PCR鉴定阳性血清在胶体金检测中均呈阳性，10例健康人血样检测结果均呈阴性。

使用正式生产的第一批N蛋白多肽的样品，测试恢复期样品及健康人样品，检测试剂条准确度，实验结果为：100例经PCR鉴定阳性的样本，94例抗体检测结果呈阳性，检出概率为94％，30例阴性样品为核酸检测等为确定的患者或则健康人的血样，经抗体检测试剂检测后，结果均呈阴性，符合率100％。

由上述实施例可知，本发明所设计的特异性的引物能够成功合成具有优异结合活性的对应S蛋白/N蛋白部分氨基酸位点的抗原肽，且由该抗原肽制备的胶体金层析试剂条，能够在几分钟内有效检测新型冠状病毒SARS-CoV-2刺突蛋白 Spike抗体/N蛋白抗体，且能有效避免假阴性结果的产生，检测效率高，特异性强，这有利于及早预防疫情扩散。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海祥耀生物科技有限责任公司

浙江祥耀生物医药有限公司

<120> 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗体的试剂及其应用

<160> 338

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> Spike 蛋白(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

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His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

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Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

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Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

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Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

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Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

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Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

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Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

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Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> N蛋白(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

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225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

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275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

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Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S1F(Artificial Sequence)

<400> 3

catggcccag tgcgtgaacc tgaccacccg cacccagctg ccgccggcgt atgc 54

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S1R(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccgcatac gccggcggca gctgggtgcg ggtggtcagg ttcacgcact gggc 54

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S2F(Artificial Sequence)

<400> 5

catggccctg ccgccggcgt ataccaacag ctttacccgc ggcgtgtatt atgc 54

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S2R(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccgcataa tacacgccgc gggtaaagct gttggtatac gccggcggca gggc 54

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S3F(Artificial Sequence)

<400> 7

catggcccgc ggcgtgtatt atccggataa agtgtttcgc agcagcgtgc tggc 54

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S3R(Artificial Sequence)

<400> 8

ggccgccagc acgctgctgc gaaacacttt atccggataa tacacgccgc gggc 54

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S4F(Artificial Sequence)

<400> 9

catggcccgc agcagcgtgc tgcatagcac ccaggatctg tttctgccgt ttgc 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S4R(Artificial Sequence)

<400> 10

ggccgcaaac ggcagaaaca gatcctgggt gctatgcagc acgctgctgc gggc 54

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S5F(Artificial Sequence)

<400> 11

catggccctg tttctgccgt tttttagcaa cgtgacctgg tttcatgcga ttgc 54

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S5R(Artificial Sequence)

<400> 12

ggccgcaatc gcatgaaacc aggtcacgtt gctaaaaaac ggcagaaaca gggc 54

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S6F(Artificial Sequence)

<400> 13

catggcctgg tttcatgcga ttcatgtgag cggcaccaac ggcaccaaac gcgc 54

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S6R(Artificial Sequence)

<400> 14

ggccgcgcgt ttggtgccgt tggtgccgct cacatgaatc gcatgaaacc aggc 54

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S7F(Artificial Sequence)

<400> 15

catggccaac ggcaccaaac gctttgataa cccggtgctg ccgtttaacg atgc 54

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S7R(Artificial Sequence)

<400> 16

ggccgcatcg ttaaacggca gcaccgggtt atcaaagcgt ttggtgccgt tggc 54

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S8F(Artificial Sequence)

<400> 17

catggccctg ccgtttaacg atggcgtgta ttttgcgagc accgaaaaaa gcgc 54

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S8R(Artificial Sequence)

<400> 18

ggccgcgctt ttttcggtgc tcgcaaaata cacgccatcg ttaaacggca gggc 54

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S9F(Artificial Sequence)

<400> 19

catggccagc accgaaaaaa gcaacattat tcgcggctgg atttttggca ccgc 54

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S9R(Artificial Sequence)

<400> 20

ggccgcggtg ccaaaaatcc agccgcgaat aatgttgctt ttttcggtgc tggc 54

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S10F(Artificial Sequence)

<400> 21

catggcctgg atttttggca ccaccctgga tagcaaaacc cagagcctgc tggc 54

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S10R(Artificial Sequence)

<400> 22

ggccgccagc aggctctggg ttttgctatc cagggtggtg ccaaaaatcc aggc 54

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S11F(Artificial Sequence)

<400> 23

catggccacc cagagcctgc tgattgtgaa caacgcgacc aacgtggtga ttgc 54

<210> 24

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S11R(Artificial Sequence)

<400> 24

ggccgcaatc accacgttgg tcgcgttgtt cacaatcagc aggctctggg tggc 54

<210> 25

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S12F(Artificial Sequence)

<400> 25

catggccacc aacgtggtga ttaaagtgtg cgaatttcag ttttgcaacg atgc 54

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S12R(Artificial Sequence)

<400> 26

ggccgcatcg ttgcaaaact gaaattcgca cactttaatc accacgttgg tggc 54

<210> 27

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S13F(Artificial Sequence)

<400> 27

catggcccag ttttgcaacg atccgtttct gggcgtgtat tatcataaaa acgc 54

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S13R(Artificial Sequence)

<400> 28

ggccgcgttt ttatgataat acacgcccag aaacggatcg ttgcaaaact gggc 54

<210> 29

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S14F(Artificial Sequence)

<400> 29

catggcctat tatcataaaa acaacaaaag ctggatggaa agcgaatttc gcgc 54

<210> 30

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S14R(Artificial Sequence)

<400> 30

ggccgcgcga aattcgcttt ccatccagct tttgttgttt ttatgataat aggc 54

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S15F(Artificial Sequence)

<400> 31

catggccgaa agcgaatttc gcgtgtatag cagcgcgaac aactgcacct ttgc 54

<210> 32

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S15R(Artificial Sequence)

<400> 32

ggccgcaaag gtgcagttgt tcgcgctgct atacacgcga aattcgcttt cggc 54

<210> 33

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S16F(Artificial Sequence)

<400> 33

catggccaac aactgcacct ttgaatatgt gagccagccg tttctgatgg atgc 54

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S16R(Artificial Sequence)

<400> 34

ggccgcatcc atcagaaacg gctggctcac atattcaaag gtgcagttgt tggc 54

<210> 35

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S17F(Artificial Sequence)

<400> 35

catggccccg tttctgatgg atctggaagg caaacagggc aactttaaaa acgc 54

<210> 36

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S17R(Artificial Sequence)

<400> 36

ggccgcgttt ttaaagttgc cctgtttgcc ttccagatcc atcagaaacg gggc 54

<210> 37

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S18F(Artificial Sequence)

<400> 37

catggccggc aactttaaaa acctgcgcga atttgtgttt aaaaacattg atgc 54

<210> 38

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S18R(Artificial Sequence)

<400> 38

ggccgcatca atgtttttaa acacaaattc gcgcaggttt ttaaagttgc cggc 54

<210> 39

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S19F(Artificial Sequence)

<400> 39

catggccttt aaaaacattg atggctattt taaaatttat agcaaacata ccgc 54

<210> 40

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S19R(Artificial Sequence)

<400> 40

ggccgcggta tgtttgctat aaattttaaa atagccatca atgtttttaa aggc 54

<210> 41

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S20F(Artificial Sequence)

<400> 41

catggcctat agcaaacata ccccgattaa cctggtgcgc gatctgccgc aggc 54

<210> 42

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S20R(Artificial Sequence)

<400> 42

ggccgcctgc ggcagatcgc gcaccaggtt aatcggggta tgtttgctat aggc 54

<210> 43

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S21F(Artificial Sequence)

<400> 43

catggcccgc gatctgccgc agggctttag cgcgctggaa ccgctggtgg atgc 54

<210> 44

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S21R(Artificial Sequence)

<400> 44

ggccgcatcc accagcggtt ccagcgcgct aaagccctgc ggcagatcgc gggc 54

<210> 45

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S22F(Artificial Sequence)

<400> 45

catggccgaa ccgctggtgg atctgccgat tggcattaac attacccgct ttgc 54

<210> 46

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S22R(Artificial Sequence)

<400> 46

ggccgcaaag cgggtaatgt taatgccaat cggcagatcc accagcggtt cggc 54

<210> 47

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S23F(Artificial Sequence)

<400> 47

catggccaac attacccgct ttcagaccct gctggcgctg catcgcagct atgc 54

<210> 48

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S23R(Artificial Sequence)

<400> 48

ggccgcatag ctgcgatgca gcgccagcag ggtctgaaag cgggtaatgt tggc 54

<210> 49

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S24F(Artificial Sequence)

<400> 49

catggccctg catcgcagct atctgacccc gggcgatagc agcagcggct gggc 54

<210> 50

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S24R(Artificial Sequence)

<400> 50

ggccgcccag ccgctgctgc tatcgcccgg ggtcagatag ctgcgatgca gggc 54

<210> 51

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S25F(Artificial Sequence)

<400> 51

catggccagc agcagcggct ggaccgcggg cgcggcggcg tattatgtgg gcgc 54

<210> 52

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S25R(Artificial Sequence)

<400> 52

ggccgcgccc acataatacg ccgccgcgcc cgcggtccag ccgctgctgc tggc 54

<210> 53

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S26F(Artificial Sequence)

<400> 53

catggccgcg tattatgtgg gctatctgca gccgcgcacc tttctgctga aagc 54

<210> 54

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S26R(Artificial Sequence)

<400> 54

ggccgctttc agcagaaagg tgcgcggctg cagatagccc acataatacg cggc 54

<210> 55

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S27F(Artificial Sequence)

<400> 55

catggccacc tttctgctga aatataacga aaacggcacc attaccgatg cggc 54

<210> 56

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S27R(Artificial Sequence)

<400> 56

ggccgccgca tcggtaatgg tgccgttttc gttatatttc agcagaaagg tggc 54

<210> 57

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S28F(Artificial Sequence)

<400> 57

catggccacc attaccgatg cggtggattg cgcgctggat ccgctgagcg aagc 54

<210> 58

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S28R(Artificial Sequence)

<400> 58

ggccgcttcg ctcagcggat ccagcgcgca atccaccgca tcggtaatgg tggc 54

<210> 59

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S29F(Artificial Sequence)

<400> 59

catggccgat ccgctgagcg aaaccaaatg caccctgaaa agctttaccg tggc 54

<210> 60

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S29R(Artificial Sequence)

<400> 60

ggccgccacg gtaaagcttt tcagggtgca tttggtttcg ctcagcggat cggc 54

<210> 61

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S30F(Artificial Sequence)

<400> 61

catggccaaa agctttaccg tggaaaaagg catttatcag accagcaact ttgc 54

<210> 62

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S30R(Artificial Sequence)

<400> 62

ggccgcaaag ttgctggtct gataaatgcc tttttccacg gtaaagcttt tggc 54

<210> 63

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S31F(Artificial Sequence)

<400> 63

catggcccag accagcaact ttcgcgtgca gccgaccgaa agcattgtgc gcgc 54

<210> 64

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S31R(Artificial Sequence)

<400> 64

ggccgcgcgc acaatgcttt cggtcggctg cacgcgaaag ttgctggtct gggc 54

<210> 65

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S32F(Artificial Sequence)

<400> 65

catggccgaa agcattgtgc gctttccgaa cattaccaac ctgtgcccgt ttgc 54

<210> 66

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S32R(Artificial Sequence)

<400> 66

ggccgcaaac gggcacaggt tggtaatgtt cggaaagcgc acaatgcttt cggc 54

<210> 67

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S33F(Artificial Sequence)

<400> 67

catggccaac ctgtgcccgt ttggcgaagt gtttaacgcg acccgctttg cggc 54

<210> 68

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S33R(Artificial Sequence)

<400> 68

ggccgccgca aagcgggtcg cgttaaacac ttcgccaaac gggcacaggt tggc 54

<210> 69

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S34F(Artificial Sequence)

<400> 69

catggccgcg acccgctttg cgagcgtgta tgcgtggaac cgcaaacgca ttgc 54

<210> 70

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S34R(Artificial Sequence)

<400> 70

ggccgcaatg cgtttgcggt tccacgcata cacgctcgca aagcgggtcg cggc 54

<210> 71

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S35F(Artificial Sequence)

<400> 71

catggccaac cgcaaacgca ttagcaactg cgtggcggat tatagcgtgc tggc 54

<210> 72

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S35R(Artificial Sequence)

<400> 72

ggccgccagc acgctataat ccgccacgca gttgctaatg cgtttgcggt tggc 54

<210> 73

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S36F(Artificial Sequence)

<400> 73

catggccgat tatagcgtgc tgtataacag cgcgagcttt agcaccttta aagc 54

<210> 74

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S36R(Artificial Sequence)

<400> 74

ggccgcttta aaggtgctaa agctcgcgct gttatacagc acgctataat cggc 54

<210> 75

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S37F(Artificial Sequence)

<400> 75

catggccttt agcaccttta aatgctatgg cgtgagcccg accaaactga acgc 54

<210> 76

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S37R(Artificial Sequence)

<400> 76

ggccgcgttc agtttggtcg ggctcacgcc atagcattta aaggtgctaa aggc 54

<210> 77

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S38F(Artificial Sequence)

<400> 77

catggccccg accaaactga acgatctgtg ctttaccaac gtgtatgcgg atgc 54

<210> 78

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S38R(Artificial Sequence)

<400> 78

ggccgcatcc gcatacacgt tggtaaagca cagatcgttc agtttggtcg gggc 54

<210> 79

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S39F(Artificial Sequence)

<400> 79

catggccaac gtgtatgcgg atagctttgt gattcgcggc gatgaagtgc gcgc 54

<210> 80

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S39R(Artificial Sequence)

<400> 80

ggccgcgcgc acttcatcgc cgcgaatcac aaagctatcc gcatacacgt tggc 54

<210> 81

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S40F(Artificial Sequence)

<400> 81

catggccggc gatgaagtgc gccagattgc gccgggccag accggcaaaa ttgc 54

<210> 82

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S40R(Artificial Sequence)

<400> 82

ggccgcaatt ttgccggtct ggcccggcgc aatctggcgc acttcatcgc cggc 54

<210> 83

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S41F(Artificial Sequence)

<400> 83

catggcccag accggcaaaa ttgcggatta taactataaa ctgccggatg atgc 54

<210> 84

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S41R(Artificial Sequence)

<400> 84

ggccgcatca tccggcagtt tatagttata atccgcaatt ttgccggtct gggc 54

<210> 85

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S42F(Artificial Sequence)

<400> 85

catggccaaa ctgccggatg attttaccgg ctgcgtgatt gcgtggaaca gcgc 54

<210> 86

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S42R(Artificial Sequence)

<400> 86

ggccgcgctg ttccacgcaa tcacgcagcc ggtaaaatca tccggcagtt tggc 54

<210> 88

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S43F(Artificial Sequence)

<400> 88

catggccatt gcgtggaaca gcaacaacct ggatagcaaa gtgggcggca acgc 54

<210> 90

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S43R(Artificial Sequence)

<400> 90

ggccgcgttg ccgcccactt tgctatccag gttgttgctg ttccacgcaa tggc 54

<210> 89

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S44F(Artificial Sequence)

<400> 89

catggccaaa gtgggcggca actataacta tctgtatcgc ctgtttcgca aagc 54

<210> 90

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S44R(Artificial Sequence)

<400> 90

ggccgctttg cgaaacaggc gatacagata gttatagttg ccgcccactt tggc 54

<210> 91

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S45F(Artificial Sequence)

<400> 91

catggcccgc ctgtttcgca aaagcaacct gaaaccgttt gaacgcgata ttgc 54

<210> 92

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S45R(Artificial Sequence)

<400> 92

ggccgcaata tcgcgttcaa acggtttcag gttgcttttg cgaaacaggc gggc 54

<210> 93

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S46F(Artificial Sequence)

<400> 93

catggccttt gaacgcgata ttagcaccga aatttatcag gcgggcagca ccgc 54

<210> 94

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S46R(Artificial Sequence)

<400> 94

ggccgcggtg ctgcccgcct gataaatttc ggtgctaata tcgcgttcaa aggc 54

<210> 95

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S47F(Artificial Sequence)

<400> 95

catggcccag gcgggcagca ccccgtgcaa cggcgtggaa ggctttaact gcgc 54

<210> 96

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S47R(Artificial Sequence)

<400> 96

ggccgcgcag ttaaagcctt ccacgccgtt gcacggggtg ctgcccgcct gggc 54

<210> 97

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S48F(Artificial Sequence)

<400> 97

catggccgaa ggctttaact gctattttcc gctgcagagc tatggctttc aggc 54

<210> 98

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S48R(Artificial Sequence)

<400> 98

ggccgcctga aagccatagc tctgcagcgg aaaatagcag ttaaagcctt cggc 54

<210> 99

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S49F(Artificial Sequence)

<400> 99

catggccagc tatggctttc agccgaccaa cggcgtgggc tatcagccgt atgc 54

<210> 100

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S49R(Artificial Sequence)

<400> 100

ggccgcatac ggctgatagc ccacgccgtt ggtcggctga aagccatagc tggc 54

<210> 101

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S50F(Artificial Sequence)

<400> 101

catggccggc tatcagccgt atcgcgtggt ggtgctgagc tttgaactgc tggc 54

<210> 102

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S50R(Artificial Sequence)

<400> 102

ggccgccagc agttcaaagc tcagcaccac cacgcgatac ggctgatagc cggc 54

<210> 103

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S51F(Artificial Sequence)

<400> 103

catggccagc tttgaactgc tgcatgcgcc ggcgaccgtg tgcggcccga aagc 54

<210> 104

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S51R(Artificial Sequence)

<400> 104

ggccgctttc gggccgcaca cggtcgccgg cgcatgcagc agttcaaagc tggc 54

<210> 105

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S52F(Artificial Sequence)

<400> 105

catggccgtg tgcggcccga aaaaaagcac caacctggtg aaaaacaaat gcgc 54

<210> 106

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S52R(Artificial Sequence)

<400> 106

ggccgcgcat ttgtttttca ccaggttggt gctttttttc gggccgcaca cggc 54

<210> 107

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S53F(Artificial Sequence)

<400> 107

catggccgtg aaaaacaaat gcgtgaactt taactttaac ggcctgaccg gcgc 54

<210> 108

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S53R(Artificial Sequence)

<400> 108

ggccgcgccg gtcaggccgt taaagttaaa gttcacgcat ttgtttttca cggc 54

<210> 109

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S54F(Artificial Sequence)

<400> 109

catggccaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgaccgaa agcaacaaaa aagc 54

<210> 110

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S54R(Artificial Sequence)

<400> 110

ggccgctttt ttgttgcttt cggtcagcac gccggtgccg gtcaggccgt tggc 54

<210> 111

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S55F(Artificial Sequence)

<400> 111

catggccgaa agcaacaaaa aatttctgcc gtttcagcag tttggccgcg atgc 54

<210> 112

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S55R(Artificial Sequence)

<400> 112

ggccgcatcg cggccaaact gctgaaacgg cagaaatttt ttgttgcttt cggc 54

<210> 113

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S56F(Artificial Sequence)

<400> 113

catggcccag tttggccgcg atattgcgga taccaccgat gcggtgcgcg atgc 54

<210> 114

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S56R(Artificial Sequence)

<400> 114

ggccgcatcg cgcaccgcat cggtggtatc cgcaatatcg cggccaaact gggc 54

<210> 115

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S57F(Artificial Sequence)

<400> 115

catggccgat gcggtgcgcg atccgcagac cctggaaatt ctggatatta ccgc 54

<210> 116

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S57R(Artificial Sequence)

<400> 116

ggccgcggta atatccagaa tttccagggt ctgcggatcg cgcaccgcat cggc 54

<210> 117

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S58F(Artificial Sequence)

<400> 117

catggccatt ctggatatta ccccgtgcag ctttggcggc gtgagcgtga ttgc 54

<210> 118

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S58R(Artificial Sequence)

<400> 118

ggccgcaatc acgctcacgc cgccaaagct gcacggggta atatccagaa tggc 54

<210> 120

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S59F(Artificial Sequence)

<400> 120

catggccggc gtgagcgtga ttaccccggg caccaacacc agcaaccagg tggc 54

<210> 120

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S59R(Artificial Sequence)

<400> 120

ggccgccacc tggttgctgg tgttggtgcc cggggtaatc acgctcacgc cggc 54

<210> 121

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S60F(Artificial Sequence)

<400> 121

catggccacc agcaaccagg tggcggtgct gtatcaggat gtgaactgca ccgc 54

<210> 122

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S60R(Artificial Sequence)

<400> 122

ggccgcggtg cagttcacat cctgatacag caccgccacc tggttgctgg tggc 54

<210> 123

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S61F(Artificial Sequence)

<400> 123

catggccgat gtgaactgca ccgaagtgcc ggtggcgatt catgcggatc aggc 54

<210> 124

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S61R(Artificial Sequence)

<400> 124

ggccgcctga tccgcatgaa tcgccaccgg cacttcggtg cagttcacat cggc 54

<210> 125

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S62F(Artificial Sequence)

<400> 125

catggccatt catgcggatc agctgacccc gacctggcgc gtgtatagca ccgc 54

<210> 126

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S62R(Artificial Sequence)

<400> 126

ggccgcggtg ctatacacgc gccaggtcgg ggtcagctga tccgcatgaa tggc 54

<210> 127

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S63F(Artificial Sequence)

<400> 127

catggcccgc gtgtatagca ccggcagcaa cgtgtttcag acccgcgcgg gcgc 54

<210> 128

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S63R(Artificial Sequence)

<400> 128

ggccgcgccc gcgcgggtct gaaacacgtt gctgccggtg ctatacacgc gggc 54

<210> 130

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S64F(Artificial Sequence)

<400> 130

catggcccag acccgcgcgg gctgcctgat tggcgcggaa catgtgaaca acgc 54

<210> 131

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S64R(Artificial Sequence)

<400> 131

ggccgcgttg ttcacatgtt ccgcgccaat caggcagccc gcgcgggtct gggc 54

<210> 131

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S65F(Artificial Sequence)

<400> 131

catggccgaa catgtgaaca acagctatga atgcgatatt ccgattggcg cggc 54

<210> 132

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S65R(Artificial Sequence)

<400> 132

ggccgccgcg ccaatcggaa tatcgcattc atagctgttg ttcacatgtt cggc 54

<210> 133

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S66F(Artificial Sequence)

<400> 133

catggccatt ccgattggcg cgggcatttg cgcgagctat cagacccaga ccgc 54

<210> 134

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S66R(Artificial Sequence)

<400> 134

ggccgcggtc tgggtctgat agctcgcgca aatgcccgcg ccaatcggaa tggc 54

<210> 136

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S67F(Artificial Sequence)

<400> 136

catggcctat cagacccaga ccaacagccc gcgccgcgcg cgcagcgtgg cggc 54

<210> 138

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S67R(Artificial Sequence)

<400> 138

ggccgccgcc acgctgcgcg cgcggcgcgg gctgttggtc tgggtctgat aggc 54

<210> 137

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S68F(Artificial Sequence)

<400> 137

catggccgcg cgcagcgtgg cgagccagag cattattgcg tataccatga gcgc 54

<210> 138

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S68R(Artificial Sequence)

<400> 138

ggccgcgctc atggtatacg caataatgct ctggctcgcc acgctgcgcg cggc 54

<210> 139

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S69F(Artificial Sequence)

<400> 139

catggccgcg tataccatga gcctgggcgc ggaaaacagc gtggcgtata gcgc 54

<210> 140

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S69R(Artificial Sequence)

<400> 140

ggccgcgcta tacgccacgc tgttttccgc gcccaggctc atggtatacg cggc 54

<210> 142

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S70F(Artificial Sequence)

<400> 142

catggccagc gtggcgtata gcaacaacag cattgcgatt ccgaccaact ttgc 54

<210> 143

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S70R(Artificial Sequence)

<400> 143

ggccgcaaag ttggtcggaa tcgcaatgct gttgttgcta tacgccacgc tggc 54

<210> 144

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S71F(Artificial Sequence)

<400> 144

catggccatt ccgaccaact ttaccattag cgtgaccacc gaaattctgc cggc 54

<210> 145

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S71R(Artificial Sequence)

<400> 145

ggccgccggc agaatttcgg tggtcacgct aatggtaaag ttggtcggaa tggc 54

<210> 146

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S72F(Artificial Sequence)

<400> 146

catggccacc gaaattctgc cggtgagcat gaccaaaacc agcgtggatt gcgc 54

<210> 146

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S72R(Artificial Sequence)

<400> 146

ggccgcgcaa tccacgctgg ttttggtcat gctcaccggc agaatttcgg tggc 54

<210> 147

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S73F(Artificial Sequence)

<400> 147

catggccacc agcgtggatt gcaccatgta tatttgcggc gatagcaccg aagc 54

<210> 148

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S73R(Artificial Sequence)

<400> 148

ggccgcttcg gtgctatcgc cgcaaatata catggtgcaa tccacgctgg tggc 54

<210> 149

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S74F(Artificial Sequence)

<400> 149

catggccggc gatagcaccg aatgcagcaa cctgctgctg cagtatggca gcgc 54

<210> 150

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S74R(Artificial Sequence)

<400> 150

ggccgcgctg ccatactgca gcagcaggtt gctgcattcg gtgctatcgc cggc 54

<210> 151

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S75F(Artificial Sequence)

<400> 151

catggccctg cagtatggca gcttttgcac ccagctgaac cgcgcgctga ccgc 54

<210> 152

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S75R(Artificial Sequence)

<400> 152

ggccgcggtc agcgcgcggt tcagctgggt gcaaaagctg ccatactgca gggc 54

<210> 153

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S76F(Artificial Sequence)

<400> 153

catggccaac cgcgcgctga ccggcattgc ggtggaacag gataaaaaca ccgc 54

<210> 154

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S76R(Artificial Sequence)

<400> 154

ggccgcggtg tttttatcct gttccaccgc aatgccggtc agcgcgcggt tggc 54

<210> 155

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S77F(Artificial Sequence)

<400> 155

catggcccag gataaaaaca cccaggaagt gtttgcgcag gtgaaacaga ttgc 54

<210> 156

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S77R(Artificial Sequence)

<400> 156

ggccgcaatc tgtttcacct gcgcaaacac ttcctgggtg tttttatcct gggc 54

<210> 157

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S78F(Artificial Sequence)

<400> 157

catggcccag gtgaaacaga tttataaaac cccgccgatt aaagattttg gcgc 54

<210> 158

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S78R(Artificial Sequence)

<400> 158

ggccgcgcca aaatctttaa tcggcggggt tttataaatc tgtttcacct gggc 54

<210> 159

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S79F(Artificial Sequence)

<400> 159

catggccatt aaagattttg gcggctttaa ctttagccag attctgccgg atgc 54

<210> 160

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S79R(Artificial Sequence)

<400> 160

ggccgcatcc ggcagaatct ggctaaagtt aaagccgcca aaatctttaa tggc 54

<210> 161

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S80F(Artificial Sequence)

<400> 161

catggcccag attctgccgg atccgagcaa accgagcaaa cgcagcttta ttgc 54

<210> 162

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S80R(Artificial Sequence)

<400> 162

ggccgcaata aagctgcgtt tgctcggttt gctcggatcc ggcagaatct gggc 54

<210> 163

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S81F(Artificial Sequence)

<400> 163

catggccaaa cgcagcttta ttgaagatct gctgtttaac aaagtgaccc tggc 54

<210> 164

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S81R(Artificial Sequence)

<400> 164

ggccgccagg gtcactttgt taaacagcag atcttcaata aagctgcgtt tggc 54

<210> 165

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S82F(Artificial Sequence)

<400> 165

catggccaac aaagtgaccc tggcggatgc gggctttatt aaacagtatg gcgc 54

<210> 166

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S82R(Artificial Sequence)

<400> 166

ggccgcgcca tactgtttaa taaagcccgc atccgccagg gtcactttgt tggc 54

<210> 167

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S83F(Artificial Sequence)

<400> 167

catggccatt aaacagtatg gcgattgcct gggcgatatt gcggcgcgcg atgc 54

<210> 168

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S83R(Artificial Sequence)

<400> 168

ggccgcatcg cgcgccgcaa tatcgcccag gcaatcgcca tactgtttaa tggc 54

<210> 169

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S84F(Artificial Sequence)

<400> 169

catggccatt gcggcgcgcg atctgatttg cgcgcagaaa tttaacggcc tggc 54

<210> 170

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S84R(Artificial Sequence)

<400> 170

ggccgccagg ccgttaaatt tctgcgcgca aatcagatcg cgcgccgcaa tggc 54

<210> 171

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S85F(Artificial Sequence)

<400> 171

catggccaaa tttaacggcc tgaccgtgct gccgccgctg ctgaccgatg aagc 54

<210> 172

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S85R(Artificial Sequence)

<400> 172

ggccgcttca tcggtcagca gcggcggcag cacggtcagg ccgttaaatt tggc 54

<210> 173

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S86F(Artificial Sequence)

<400> 173

catggccctg ctgaccgatg aaatgattgc gcagtatacc agcgcgctgc tggc 54

<210> 174

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S86R(Artificial Sequence)

<400> 174

ggccgccagc agcgcgctgg tatactgcgc aatcatttca tcggtcagca gggc 54

<210> 175

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S87F(Artificial Sequence)

<400> 175

catggccacc agcgcgctgc tggcgggcac cattaccagc ggctggacct ttgc 54

<210> 176

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S87R(Artificial Sequence)

<400> 176

ggccgcaaag gtccagccgc tggtaatggt gcccgccagc agcgcgctgg tggc 54

<210> 177

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S88F(Artificial Sequence)

<400> 177

catggccagc ggctggacct ttggcgcggg cgcggcgctg cagattccgt ttgc 54

<210> 178

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S88R(Artificial Sequence)

<400> 178

ggccgcaaac ggaatctgca gcgccgcgcc cgcgccaaag gtccagccgc tggc 54

<210> 179

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S89F(Artificial Sequence)

<400> 179

catggccctg cagattccgt ttgcgatgca gatggcgtat cgctttaacg gcgc 54

<210> 180

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S89R(Artificial Sequence)

<400> 180

ggccgcgccg ttaaagcgat acgccatctg catcgcaaac ggaatctgca gggc 54

<210> 181

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S90F(Artificial Sequence)

<400> 181

catggcctat cgctttaacg gcattggcgt gacccagaac gtgctgtatg aagc 54

<210> 182

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S90R(Artificial Sequence)

<400> 182

ggccgcttca tacagcacgt tctgggtcac gccaatgccg ttaaagcgat aggc 54

<210> 183

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S91F(Artificial Sequence)

<400> 183

catggccaac gtgctgtatg aaaaccagaa actgattgcg aaccagttta acgc 54

<210> 184

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S91R(Artificial Sequence)

<400> 184

ggccgcgtta aactggttcg caatcagttt ctggttttca tacagcacgt tggc 54

<210> 185

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S92F(Artificial Sequence)

<400> 185

catggccgcg aaccagttta acagcgcgat tggcaaaatt caggatagcc tggc 54

<210> 186

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S92R(Artificial Sequence)

<400> 186

ggccgccagg ctatcctgaa ttttgccaat cgcgctgtta aactggttcg cggc 54

<210> 187

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S93F(Artificial Sequence)

<400> 187

catggccatt caggatagcc tgagcagcac cgcgagcgcg ctgggcaaac tggc 54

<210> 188

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S93R(Artificial Sequence)

<400> 188

ggccgccagt ttgcccagcg cgctcgcggt gctgctcagg ctatcctgaa tggc 54

<210> 189

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S94F(Artificial Sequence)

<400> 189

catggccgcg ctgggcaaac tgcaggatgt ggtgaaccag aacgcgcagg cggc 54

<210> 190

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S94R(Artificial Sequence)

<400> 190

ggccgccgcc tgcgcgttct ggttcaccac atcctgcagt ttgcccagcg cggc 54

<210> 191

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S95F(Artificial Sequence)

<400> 191

catggcccag aacgcgcagg cgctgaacac cctggtgaaa cagctgagca gcgc 54

<210> 192

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S95R(Artificial Sequence)

<400> 192

ggccgcgctg ctcagctgtt tcaccagggt gttcagcgcc tgcgcgttct gggc 54

<210> 193

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S96F(Artificial Sequence)

<400> 193

catggccaaa cagctgagca gcaactttgg cgcgattagc agcgtgctga acgc 54

<210> 194

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S96R(Artificial Sequence)

<400> 194

ggccgcgttc agcacgctgc taatcgcgcc aaagttgctg ctcagctgtt tggc 54

<210> 195

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S97F(Artificial Sequence)

<400> 195

catggccagc agcgtgctga acgatattct gagccgcctg gataaagtgg aagc 54

<210> 196

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S97R(Artificial Sequence)

<400> 196

ggccgcttcc actttatcca ggcggctcag aatatcgttc agcacgctgc tggc 54

<210> 197

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S98F(Artificial Sequence)

<400> 197

catggccctg gataaagtgg aagcggaagt gcagattgat cgcctgatta ccgc 54

<210> 198

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S98R(Artificial Sequence)

<400> 198

ggccgcggta atcaggcgat caatctgcac ttccgcttcc actttatcca gggc 54

<210> 199

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S99F(Artificial Sequence)

<400> 199

catggccgat cgcctgatta ccggccgcct gcagagcctg cagacctatg tggc 54

<210> 200

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S99R(Artificial Sequence)

<400> 200

ggccgccaca taggtctgca ggctctgcag gcggccggta atcaggcgat cggc 54

<210> 201

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S100F(Artificial Sequence)

<400> 201

catggccctg cagacctatg tgacccagca gctgattcgc gcggcggaaa ttgc 54

<210> 202

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S100R(Artificial Sequence)

<400> 202

ggccgcaatt tccgccgcgc gaatcagctg ctgggtcaca taggtctgca gggc 54

<210> 203

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S101F(Artificial Sequence)

<400> 203

catggcccgc gcggcggaaa ttcgcgcgag cgcgaacctg gcggcgacca aagc 54

<210> 204

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S101R(Artificial Sequence)

<400> 204

ggccgctttg gtcgccgcca ggttcgcgct cgcgcgaatt tccgccgcgc gggc 54

<210> 205

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S102F(Artificial Sequence)

<400> 205

catggccctg gcggcgacca aaatgagcga atgcgtgctg ggccagagca aagc 54

<210> 206

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S102R(Artificial Sequence)

<400> 206

ggccgctttg ctctggccca gcacgcattc gctcattttg gtcgccgcca gggc 54

<210> 207

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S103F(Artificial Sequence)

<400> 207

catggccctg ggccagagca aacgcgtgga tttttgcggc aaaggctatc atgc 54

<210> 208

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S103R(Artificial Sequence)

<400> 208

ggccgcatga tagcctttgc cgcaaaaatc cacgcgtttg ctctggccca gggc 54

<210> 209

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S104F(Artificial Sequence)

<400> 209

catggccggc aaaggctatc atctgatgag ctttccgcag agcgcgccgc atgc 54

<210> 210

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S104R(Artificial Sequence)

<400> 210

ggccgcatgc ggcgcgctct gcggaaagct catcagatga tagcctttgc cggc 54

<210> 211

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S105F(Artificial Sequence)

<400> 211

catggcccag agcgcgccgc atggcgtggt gtttctgcat gtgacctatg tggc 54

<210> 212

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S105R(Artificial Sequence)

<400> 212

ggccgccaca taggtcacat gcagaaacac cacgccatgc ggcgcgctct gggc 54

<210> 213

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S106F(Artificial Sequence)

<400> 213

catggcccat gtgacctatg tgccggcgca ggaaaaaaac tttaccaccg cggc 54

<210> 214

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S106R(Artificial Sequence)

<400> 214

ggccgccgcg gtggtaaagt ttttttcctg cgccggcaca taggtcacat gggc 54

<210> 215

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S107F(Artificial Sequence)

<400> 215

catggccaac tttaccaccg cgccggcgat ttgccatgat ggcaaagcgc atgc 54

<210> 216

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S107R(Artificial Sequence)

<400> 216

ggccgcatgc gctttgccat catggcaaat cgccggcgcg gtggtaaagt tggc 54

<210> 217

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S108F(Artificial Sequence)

<400> 217

catggccgat ggcaaagcgc attttccgcg cgaaggcgtg tttgtgagca acgc 54

<210> 218

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S108R(Artificial Sequence)

<400> 218

ggccgcgttg ctcacaaaca cgccttcgcg cggaaaatgc gctttgccat cggc 54

<210> 219

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S109F(Artificial Sequence)

<400> 219

catggccgtg tttgtgagca acggcaccca ttggtttgtg acccagcgca acgc 54

<210> 220

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S109R(Artificial Sequence)

<400> 220

ggccgcgttg cgctgggtca caaaccaatg ggtgccgttg ctcacaaaca cggc 54

<210> 221

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S110F(Artificial Sequence)

<400> 221

catggccgtg acccagcgca acttttatga accgcagatt attaccaccg atgc 54

<210> 222

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S110R(Artificial Sequence)

<400> 222

ggccgcatcg gtggtaataa tctgcggttc ataaaagttg cgctgggtca cggc 54

<210> 223

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S111F(Artificial Sequence)

<400> 223

catggccatt attaccaccg ataacacctt tgtgagcggc aactgcgatg tggc 54

<210> 224

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S111R(Artificial Sequence)

<400> 224

ggccgccaca tcgcagttgc cgctcacaaa ggtgttatcg gtggtaataa tggc 54

<210> 225

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S112F(Artificial Sequence)

<400> 225

catggccggc aactgcgatg tggtgattgg cattgtgaac aacaccgtgt atgc 54

<210> 226

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S112R(Artificial Sequence)

<400> 226

ggccgcatac acggtgttgt tcacaatgcc aatcaccaca tcgcagttgc cggc 54

<210> 227

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S113F(Artificial Sequence)

<400> 227

catggccaac aacaccgtgt atgatccgct gcagccggaa ctggatagct ttgc 54

<210> 228

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S113R(Artificial Sequence)

<400> 228

ggccgcaaag ctatccagtt ccggctgcag cggatcatac acggtgttgt tggc 54

<210> 229

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S114F(Artificial Sequence)

<400> 229

catggccgaa ctggatagct ttaaagaaga actggataaa tattttaaaa acgc 54

<210> 230

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S114R(Artificial Sequence)

<400> 230

ggccgcgttt ttaaaatatt tatccagttc ttctttaaag ctatccagtt cggc 54

<210> 231

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S115F(Artificial Sequence)

<400> 231

catggccaaa tattttaaaa accataccag cccggatgtg gatctgggcg atgc 54

<210> 232

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S115R(Artificial Sequence)

<400> 232

ggccgcatcg cccagatcca catccgggct ggtatggttt ttaaaatatt tggc 54

<210> 233

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S116F(Artificial Sequence)

<400> 233

catggccgtg gatctgggcg atattagcgg cattaacgcg agcgtggtga acgc 54

<210> 234

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S116R(Artificial Sequence)

<400> 234

ggccgcgttc accacgctcg cgttaatgcc gctaatatcg cccagatcca cggc 54

<210> 235

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S117F(Artificial Sequence)

<400> 235

catggccgcg agcgtggtga acattcagaa agaaattgat cgcctgaacg aagc 54

<210> 236

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S117R(Artificial Sequence)

<400> 236

ggccgcttcg ttcaggcgat caatttcttt ctgaatgttc accacgctcg cggc 54

<210> 237

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S118F(Artificial Sequence)

<400> 237

catggccgat cgcctgaacg aagtggcgaa aaacctgaac gaaagcctga ttgc 54

<210> 238

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S118R(Artificial Sequence)

<400> 238

ggccgcaatc aggctttcgt tcaggttttt cgccacttcg ttcaggcgat cggc 54

<210> 239

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S119F(Artificial Sequence)

<400> 239

catggccaac gaaagcctga ttgatctgca ggaactgggc aaatatgaac aggc 54

<210> 240

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S119R(Artificial Sequence)

<400> 240

ggccgcctgt tcatatttgc ccagttcctg cagatcaatc aggctttcgt tggc 54

<210> 241

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S120F(Artificial Sequence)

<400> 241

catggccggc aaatatgaac agtatattaa atggccgtgg tatatttggc tggc 54

<210> 242

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S120R(Artificial Sequence)

<400> 242

ggccgccagc caaatatacc acggccattt aatatactgt tcatatttgc cggc 54

<210> 243

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S121F(Artificial Sequence)

<400> 243

catggcctgg tatatttggc tgggctttat tgcgggcctg attgcgattg tggc 54

<210> 244

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S121R(Artificial Sequence)

<400> 244

ggccgccaca atcgcaatca ggcccgcaat aaagcccagc caaatatacc aggc 54

<210> 245

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S122F(Artificial Sequence)

<400> 245

catggccctg attgcgattg tgatggtgac cattatgctg tgctgcatga ccgc 54

<210> 246

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S122R(Artificial Sequence)

<400> 246

ggccgcggtc atgcagcaca gcataatggt caccatcaca atcgcaatca gggc 54

<210> 247

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S123F(Artificial Sequence)

<400> 247

catggccctg tgctgcatga ccagctgctg cagctgcctg aaaggctgct gcgc 54

<210> 248

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S123R(Artificial Sequence)

<400> 248

ggccgcgcag cagcctttca ggcagctgca gcagctggtc atgcagcaca gggc 54

<210> 249

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S124F(Artificial Sequence)

<400> 249

catggccctg aaaggctgct gcagctgcgg cagctgctgc aaatttgatg aagc 54

<210> 250

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S124R(Artificial Sequence)

<400> 250

ggccgcttca tcaaatttgc agcagctgcc gcagctgcag cagcctttca gggc 54

<210> 251

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S125F(Artificial Sequence)

<400> 251

catggcctgc aaatttgatg aagatgatag cgaaccggtg ctgaaaggcg tggc 54

<210> 252

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物S125R(Artificial Sequence)

<400> 252

ggccgccacg cctttcagca ccggttcgct atcatcttca tcaaatttgc aggc 54

<210> 253

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物S126F(Artificial Sequence)

<400> 253

catggccgtg ctgaaaggcg tgaaactgca ttataccgc 39

<210> 254

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物S126R(Artificial Sequence)

<400> 254

ggccgcggta taatgcagtt tcacgccttt cagcacggc 39

<210> 255

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N1F(Artificial Sequence)

<400> 255

catggccatg agcgataacg gcccgcagaa ccagcgcaac gcgccgcgca ttgc 54

<210> 256

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N1R(Artificial Sequence)

<400> 256

ggccgcaatg cgcggcgcgt tgcgctggtt ctgcgggccg ttatcgctca tggc 54

<210> 257

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N2F(Artificial Sequence)

<400> 257

catggccaac gcgccgcgca ttacctttgg cggcccgagc gatagcaccg gcgc 54

<210> 258

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N2R(Artificial Sequence)

<400> 258

ggccgcgccg gtgctatcgc tcgggccgcc aaaggtaatg cgcggcgcgt tggc 54

<210> 259

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N3F(Artificial Sequence)

<400> 259

catggccagc gatagcaccg gcagcaacca gaacggcgaa cgcagcggcg cggc 54

<210> 260

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N3R(Artificial Sequence)

<400> 260

ggccgccgcg ccgctgcgtt cgccgttctg gttgctgccg gtgctatcgc tggc 54

<210> 261

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N4F(Artificial Sequence)

<400> 261

catggccgaa cgcagcggcg cgcgcagcaa acagcgccgc ccgcagggcc tggc 54

<210> 262

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N4R(Artificial Sequence)

<400> 262

ggccgccagg ccctgcgggc ggcgctgttt gctgcgcgcg ccgctgcgtt cggc 54

<210> 263

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N5F(Artificial Sequence)

<400> 263

catggcccgc ccgcagggcc tgccgaacaa caccgcgagc tggtttaccg cggc 54

<210> 264

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N5R(Artificial Sequence)

<400> 264

ggccgccgcg gtaaaccagc tcgcggtgtt gttcggcagg ccctgcgggc gggc 54

<210> 265

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N6F(Artificial Sequence)

<400> 265

catggccagc tggtttaccg cgctgaccca gcatggcaaa gaagatctga aagc 54

<210> 266

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N6R(Artificial Sequence)

<400> 266

ggccgctttc agatcttctt tgccatgctg ggtcagcgcg gtaaaccagc tggc 54

<210> 267

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N7F(Artificial Sequence)

<400> 267

catggccaaa gaagatctga aatttccgcg cggccagggc gtgccgatta acgc 54

<210> 268

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N7R(Artificial Sequence)

<400> 268

ggccgcgtta atcggcacgc cctggccgcg cggaaatttc agatcttctt tggc 54

<210> 269

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N8F(Artificial Sequence)

<400> 269

catggccggc gtgccgatta acaccaacag cagcccggat gatcagattg gcgc 54

<210> 270

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N8R(Artificial Sequence)

<400> 270

ggccgcgcca atctgatcat ccgggctgct gttggtgtta atcggcacgc cggc 54

<210> 271

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N9F(Artificial Sequence)

<400> 271

catggccgat gatcagattg gctattatcg ccgcgcgacc cgccgcattc gcgc 54

<210> 272

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N9R(Artificial Sequence)

<400> 272

ggccgcgcga atgcggcggg tcgcgcggcg ataatagcca atctgatcat cggc 54

<210> 273

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N10F(Artificial Sequence)

<400> 273

catggccacc cgccgcattc gcggcggcga tggcaaaatg aaagatctga gcgc 54

<210> 274

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N10R(Artificial Sequence)

<400> 274

ggccgcgctc agatctttca ttttgccatc gccgccgcga atgcggcggg tggc 54

<210> 275

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N11F(Artificial Sequence)

<400> 275

catggccatg aaagatctga gcccgcgctg gtatttttat tatctgggca ccgc 54

<210> 276

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N11R(Artificial Sequence)

<400> 276

ggccgcggtg cccagataat aaaaatacca gcgcgggctc agatctttca tggc 54

<210> 277

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N12F(Artificial Sequence)

<400> 277

catggcctat tatctgggca ccggcccgga agcgggcctg ccgtatggcg cggc 54

<210> 278

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N12R(Artificial Sequence)

<400> 278

ggccgccgcg ccatacggca ggcccgcttc cgggccggtg cccagataat aggc 54

<210> 279

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N13F(Artificial Sequence)

<400> 279

catggccctg ccgtatggcg cgaacaaaga tggcattatt tgggtggcga ccgc 54

<210> 280

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N13R(Artificial Sequence)

<400> 280

ggccgcggtc gccacccaaa taatgccatc tttgttcgcg ccatacggca gggc 54

<210> 281

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N14F(Artificial Sequence)

<400> 281

catggccatt tgggtggcga ccgaaggcgc gctgaacacc ccgaaagatc atgc 54

<210> 282

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N14R(Artificial Sequence)

<400> 282

ggccgcatga tctttcgggg tgttcagcgc gccttcggtc gccacccaaa tggc 54

<210> 283

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N15F(Artificial Sequence)

<400> 283

catggccacc ccgaaagatc atattggcac ccgcaacccg gcgaacaacg cggc 54

<210> 284

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N15R(Artificial Sequence)

<400> 284

ggccgccgcg ttgttcgccg ggttgcgggt gccaatatga tctttcgggg tggc 54

<210> 285

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N16F(Artificial Sequence)

<400> 285

catggccccg gcgaacaacg cggcgattgt gctgcagctg ccgcagggca ccgc 54

<210> 286

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N16R(Artificial Sequence)

<400> 286

ggccgcggtg ccctgcggca gctgcagcac aatcgccgcg ttgttcgccg gggc 54

<210> 287

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N17F(Artificial Sequence)

<400> 287

catggccctg ccgcagggca ccaccctgcc gaaaggcttt tatgcggaag gcgc 54

<210> 288

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N17R(Artificial Sequence)

<400> 288

ggccgcgcct tccgcataaa agcctttcgg cagggtggtg ccctgcggca gggc 54

<210> 289

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N18F(Artificial Sequence)

<400> 289

catggccttt tatgcggaag gcagccgcgg cggcagccag gcgagcagcc gcgc 54

<210> 290

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N18R(Artificial Sequence)

<400> 290

ggccgcgcgg ctgctcgcct ggctgccgcc gcggctgcct tccgcataaa aggc 54

<210> 291

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N19F(Artificial Sequence)

<400> 291

catggcccag gcgagcagcc gcagcagcag ccgcagccgc aacagcagcc gcgc 54

<210> 292

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N19R(Artificial Sequence)

<400> 292

ggccgcgcgg ctgctgttgc ggctgcggct gctgctgcgg ctgctcgcct gggc 54

<210> 293

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N20F(Artificial Sequence)

<400> 293

catggcccgc aacagcagcc gcaacagcac cccgggcagc agccgcggca ccgc 54

<210> 294

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N20R(Artificial Sequence)

<400> 294

ggccgcggtg ccgcggctgc tgcccggggt gctgttgcgg ctgctgttgc gggc 54

<210> 295

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N21F(Artificial Sequence)

<400> 295

catggccagc agccgcggca ccagcccggc gcgcatggcg ggcaacggcg gcgc 54

<210> 296

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N21R(Artificial Sequence)

<400> 296

ggccgcgccg ccgttgcccg ccatgcgcgc cgggctggtg ccgcggctgc tggc 54

<210> 297

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N22F(Artificial Sequence)

<400> 297

catggccgcg ggcaacggcg gcgatgcggc gctggcgctg ctgctgctgg atgc 54

<210> 298

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N22R(Artificial Sequence)

<400> 298

ggccgcatcc agcagcagca gcgccagcgc cgcatcgccg ccgttgcccg cggc 54

<210> 299

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N23F(Artificial Sequence)

<400> 299

catggccctg ctgctgctgg atcgcctgaa ccagctggaa agcaaaatga gcgc 54

<210> 300

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N23R(Artificial Sequence)

<400> 300

ggccgcgctc attttgcttt ccagctggtt caggcgatcc agcagcagca gggc 54

<210> 301

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N24F(Artificial Sequence)

<400> 301

catggccgaa agcaaaatga gcggcaaagg ccagcagcag cagggccaga ccgc 54

<210> 302

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N24R(Artificial Sequence)

<400> 302

ggccgcggtc tggccctgct gctgctggcc tttgccgctc attttgcttt cggc 54

<210> 303

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N25F(Artificial Sequence)

<400> 303

catggcccag cagggccaga ccgtgaccaa aaaaagcgcg gcggaagcga gcgc 54

<210> 304

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N25R(Artificial Sequence)

<400> 304

ggccgcgctc gcttccgccg cgcttttttt ggtcacggtc tggccctgct gggc 54

<210> 305

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N26F(Artificial Sequence)

<400> 305

catggccgcg gcggaagcga gcaaaaaacc gcgccagaaa cgcaccgcga ccgc 54

<210> 306

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N26R(Artificial Sequence)

<400> 306

ggccgcggtc gcggtgcgtt tctggcgcgg ttttttgctc gcttccgccg cggc 54

<210> 307

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N27F(Artificial Sequence)

<400> 307

catggccaaa cgcaccgcga ccaaagcgta taacgtgacc caggcgtttg gcgc 54

<210> 308

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N27R(Artificial Sequence)

<400> 308

ggccgcgcca aacgcctggg tcacgttata cgctttggtc gcggtgcgtt tggc 54

<210> 309

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N28F(Artificial Sequence)

<400> 309

catggccacc caggcgtttg gccgccgcgg cccggaacag acccagggca acgc 54

<210> 310

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N28R(Artificial Sequence)

<400> 310

ggccgcgttg ccctgggtct gttccgggcc gcggcggcca aacgcctggg tggc 54

<210> 311

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N29F(Artificial Sequence)

<400> 311

catggcccag acccagggca actttggcga tcaggaactg attcgccagg gcgc 54

<210> 312

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N29R(Artificial Sequence)

<400> 312

ggccgcgccc tggcgaatca gttcctgatc gccaaagttg ccctgggtct gggc 54

<210> 313

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N30F(Artificial Sequence)

<400> 313

catggccctg attcgccagg gcaccgatta taaacattgg ccgcagattg cggc 54

<210> 314

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N30R(Artificial Sequence)

<400> 314

ggccgccgca atctgcggcc aatgtttata atcggtgccc tggcgaatca gggc 54

<210> 315

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N31F(Artificial Sequence)

<400> 315

catggcctgg ccgcagattg cgcagtttgc gccgagcgcg agcgcgtttt ttgc 54

<210> 316

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N31R(Artificial Sequence)

<400> 316

ggccgcaaaa aacgcgctcg cgctcggcgc aaactgcgca atctgcggcc aggc 54

<210> 317

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N32F(Artificial Sequence)

<400> 317

catggccgcg agcgcgtttt ttggcatgag ccgcattggc atggaagtga ccgc 54

<210> 318

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N32R(Artificial Sequence)

<400> 318

ggccgcggtc acttccatgc caatgcggct catgccaaaa aacgcgctcg cggc 54

<210> 319

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N33F(Artificial Sequence)

<400> 319

catggccggc atggaagtga ccccgagcgg cacctggctg acctataccg gcgc 54

<210> 320

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N33R(Artificial Sequence)

<400> 320

ggccgcgccg gtataggtca gccaggtgcc gctcggggtc acttccatgc cggc 54

<210> 321

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N34F(Artificial Sequence)

<400> 321

catggccctg acctataccg gcgcgattaa actggatgat aaagatccga acgc 54

<210> 322

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N34R(Artificial Sequence)

<400> 322

ggccgcgttc ggatctttat catccagttt aatcgcgccg gtataggtca gggc 54

<210> 323

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N35F(Artificial Sequence)

<400> 323

catggccgat aaagatccga actttaaaga tcaggtgatt ctgctgaaca aagc 54

<210> 324

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N35R(Artificial Sequence)

<400> 324

ggccgctttg ttcagcagaa tcacctgatc tttaaagttc ggatctttat cggc 54

<210> 325

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N36F(Artificial Sequence)

<400> 325

catggccatt ctgctgaaca aacatattga tgcgtataaa acctttccgc cggc 54

<210> 326

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N36R(Artificial Sequence)

<400> 326

ggccgccggc ggaaaggttt tatacgcatc aatatgtttg ttcagcagaa tggc 54

<210> 327

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N37F(Artificial Sequence)

<400> 327

catggccaaa acctttccgc cgaccgaacc gaaaaaagat aaaaaaaaaa aagc 54

<210> 328

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N37R(Artificial Sequence)

<400> 328

ggccgctttt ttttttttat cttttttcgg ttcggtcggc ggaaaggttt tggc 54

<210> 329

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N38F(Artificial Sequence)

<400> 329

catggccgat aaaaaaaaaa aagcggatga aacccaggcg ctgccgcagc gcgc 54

<210> 330

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N38R(Artificial Sequence)

<400> 330

ggccgcgcgc tgcggcagcg cctgggtttc atccgctttt ttttttttat cggc 54

<210> 331

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N39F(Artificial Sequence)

<400> 331

catggccgcg ctgccgcagc gccagaaaaa acagcagacc gtgaccctgc tggc 54

<210> 332

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N39R(Artificial Sequence)

<400> 332

ggccgccagc agggtcacgg tctgctgttt tttctggcgc tgcggcagcg cggc 54

<210> 333

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N40F(Artificial Sequence)

<400> 333

catggccacc gtgaccctgc tgccggcggc ggatctggat gattttagca aagc 54

<210> 334

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N40R(Artificial Sequence)

<400> 334

ggccgctttg ctaaaatcat ccagatccgc cgccggcagc agggtcacgg tggc 54

<210> 335

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N41F(Artificial Sequence)

<400> 335

catggccgat gattttagca aacagctgca gcagagcatg agcagcgcgg atgc 54

<210> 336

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物N41R(Artificial Sequence)

<400> 336

ggccgcatcc gcgctgctca tgctctgctg cagctgtttg ctaaaatcat cggc 54

<210> 337

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物N42F(Artificial Sequence)

<400> 337

catggccatg agcagcgcgg atagcaccca ggcggc 36

<210> 338

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物N42R(Artificial Sequence)

<400> 338

ggccgccgcc tgggtgctat ccgcgctgct catggc 36

Claims

1.一种多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物具有新型冠状病毒SARS-CoV-2Spike蛋白抗原性或新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白抗原性；

其中，所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白抗原性的多肽组合物为：对应SEQID NO. 1所示序列的224-238位的多肽、254-268位的多肽和294-308位的多肽的混合物；

所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白抗原性的多肽组合物为：对应SEQ ID NO. 2所示序列的31-45位的多肽和231-245位的多肽的混合物。

2.一种用于合成权利要求1所述的多肽组合物的引物组合物，其特征在于，合成所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白抗原性的多肽组合物的引物序列为：

SEQ ID NO. 1的224-238位，其引物序列为SEQ ID NO. 45~46； SEQ ID NO. 1的254-268位，其引物序列为SEQ ID NO. 51~52； SEQ ID NO. 1的294-308位，其引物序列为SEQ ID NO. 59~60；

合成所述具有新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白抗原性的多肽组合物的引物序列为：

SEQ ID NO. 2的31-45位，其引物序列为SEQ ID NO. 261~262； SEQ ID NO. 2的231-245位，其引物序列为SEQ ID NO. 301~302；

其中，各所述引物带有粘性末端。

3. 一种多肽组合物在制备检测或诊断新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂包括能够特异性地与新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体结合的多肽组合物或能够特异性地与新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体结合的多肽组合物；

其中，所述特异性地与新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体结合的多肽组合物为：对应SEQ ID NO. 1所示序列的224-238位的多肽、254-268位的多肽和294-308位的多肽的混合物；

所述特异性地与新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体结合的多肽组合物为：对应SEQ ID NO. 2所示序列的31-45位的多肽和231-245位的多肽的混合物。

4. 一种含有多肽组合物的产品，其特征在于，所述产品包括用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体的多肽组合物或用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体的多肽组合物；

其中，所述用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体的多肽组合物为：对应SEQ ID NO. 1所示序列的224-238位的多肽、254-268位的多肽和294-308位的多肽的混合物；

所述用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体的多肽组合物为：对应SEQ IDNO. 2所示序列的31-45位的多肽和231-245位的多肽的混合物。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为胶体金试剂条或含有所述试剂条的试剂盒。

6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述胶体金试剂条包括NC膜和金标垫，所述NC膜上分别包被抗人IgG抗体和抗人IgM抗体，所述金标垫上包被用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 Spike蛋白的抗体的多肽组合物或用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的抗体的多肽组合物。