CN107663235A

CN107663235A - 特发性膜性肾病相关的pla2r重组蛋白及其应用

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Publication number: CN107663235A
Application number: CN201710685346.3A
Authority: CN
Inventors: 曹林; 唐波; 朱婷婷; 许雯
Original assignee: Nanjing Promise Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Promise Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: CN107663235B

Abstract

本发明公开一种PLA2R重组蛋白PLA2R‑T，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该重组蛋白能够被患者血液中PLA2R抗体灵敏、特异地识别，且能够在体外大量表达，可达300mg/L，且能够与膜性肾病患者血液中的抗PLA2R抗体特异性地结合，并具有极高的亲和力，最低检测浓度能够达到0.39ng/ml。

Description

特发性膜性肾病相关的PLA2R重组蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种PLA2R重组蛋白及其应用。

背景技术

膜性肾病是导致慢性肾病的主要原因之一，是临床上以无症状蛋白尿或肾病综合征为主要表现，病理上以肾小球基底膜上皮下弥漫的免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为特点的一组疾病。很多膜性肾病患者早期几乎没有症状，极易被漏诊、误诊。而中晚期患者，极易引发肾病综合征，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度浮肿、高脂血症等症状，使患者承受极大痛苦。流行病学调查显示约40％～60％的患者在5～15年内进展至终末期肾病，甚至尿毒症，5年死亡率约为5％～10％，属于难治性疾病。

膜性肾病分为特发性膜性肾病和继发性膜性肾病，其中前者占膜性肾病患者的80％。目前，临床区分这两种类型主要通过肾脏组织活检，即肾脏穿刺法，该方法对病人来说是个痛苦、有风险、经济负担重的过程，极易导致诸多并发症，并且适用人群因其方法学的特殊性受限。2009年国际上首次报道特发性膜性肾病的实质是磷脂酶A2受体(PLA2R)与自身抗体反应的结果。PLA2R由肾小球足细胞表达，主要分为两型，目前已经确认M型PLA2R是自身抗体的主要靶抗原，研究发现约75％的特发性膜性肾病患者可以在血清学检测中检出PLA2R抗体。临床研究表明用免疫荧光方法检测PLA2R抗体诊断特发性膜性肾病的灵敏度为52％，特异度为100％。表明PLA2R抗体是一个适合作为特发性膜性肾病筛查的生物标志物。

PLA2R抗体的免疫学诊断试剂均需要以PLA2R作为抗原来进行检测，因此PLA2R重组蛋白的天然构象和产量对于诊断试剂的灵敏度，特异度和规模化生产十分重要。PLA2R是一个膜蛋白，由Ricin B-type lectin结构域、Fibronectin type-II结构域、8个序列相似度非常高的C-type lectin结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，成熟蛋白全长1463个氨基酸，分子量约160kDa。PLA2R全长蛋白由于含有跨膜的疏水结构，重组表达时容易形成包涵体，产量非常低；人PLA2R蛋白在肾小球足细胞上表达时，仅有胞外区处于血液环境中，因此特发性膜性肾病患者的自身抗体都是针对PLA2R的胞外区结构，而PLA2R的胞外区域由1378个氨基酸组成，分子量较大(约150kDa)，在重组表达时产量也较低。因此无论是表达PLA2R的全长蛋白还是胞外区都难以获得大量蛋白，无法满足诊断试剂规模化生产的需要。

众所周知，蛋白质功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也可能随之改变。如何缩短蛋白长度，提高重组蛋白产量，又不影响PLA2R重组蛋白与患者自身抗体反应的灵敏度和特异性，是在研发重组蛋白中需要面临的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种PLA2R重组蛋白，该重组蛋白能够被患者血液中PLA2R抗体灵敏、特异地识别，且能够在体外大量表达，本发明的另一目的是提供该重组蛋白在制备PLA2R抗体含量检测试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

本发明具体提供了一种PLA2R重组蛋白PLA2R-T，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种编码所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的基因。

根据氨基酸序列密码子编码的偏好性，本发明还提供了一种具体的编码所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的基因，其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的编码所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的基因，其序列还可以为：与SEQID No.1所示DNA序列杂交且编码SEQ ID No.2所示重组蛋白PLA2R-T的DNA序列。

本发明还提供了一种包括上述编码所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的基因的重组质粒。

本发明还提供了一种包含上述重组质粒的单细胞株。

本发明还提供一种包含所述的PLA2R重组蛋白PLA2R-T的试剂盒，该试剂盒可用于人体组织或血液中PLA2R抗体含量的检测。

本发明还提供所述的PLA2R重组蛋白PLA2R-T或本发明所述试剂盒在制备免疫学诊断试剂中的应用。

本发明还提供所述的PLA2R重组蛋白PLA2R-T或本发明所述试剂盒在制备特发性膜性肾病免疫学诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种PLA2R重组蛋白的制备方法，其特征在于，根据PLA2R的胞外区包含的8个C-type lectin结构域，设计不同的截短体，每个截短体包含至少一个C-typelectin结构域或者至少包含一个C-type lectin结构域及其C端连接区；每个截短体与PLA2R胞外区的Ricin B-type lectin结构域和Fibronectin type-II结构域组成PLA2R重组蛋白，筛选出表达量高于PLA2R全长蛋白，且具有免疫特异性的重组蛋白。

本发明还提供了上述方法所制备的重组蛋白、所制备的重组蛋白的编码基因、包含编码基因的重组质粒、包含重组质粒的单细胞株以及含有上述方法所制备的重组蛋白的试剂盒。

本发明还提供了上述方法所制备的重组蛋白或含有上述方法所制备的重组蛋白的试剂盒在制备免疫学诊断试剂中的应用，优选在制备特发性膜性肾病免疫学诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种PLA2R重组蛋白的表达和纯化方法，将PLA2R重组蛋白的DNA构建克隆转入受体细胞，将细胞大量培养后，收集细胞培养基，经金属螯合层析及离子交换层析分离纯化，可大量制备出PLA2R重组蛋白。

本发明还提供一种更为具体的PLA2R重组蛋白的表达和纯化方案如下：

(1)PLA2R重组蛋白筛选：根据PLA2R的胞外区包含的8个C-type lectin结构域，设计PLA2R截短体序列，每个截短体包含至少一个C-type lectin结构域或者至少包含一个C-type lectin结构域及其C端连接区；每个截短体与PLA2R胞外区的Ricin B-type lectin结构域和Fibronectin type-II结构域组成PLA2R重组蛋白，在人肾上皮细胞系中重组表达，通过免疫荧光检测的方法，筛选出表达量高且与全长蛋白免疫反应性一致的重组蛋白；

(2)克隆构建：以上述重组蛋白cDNA合成序列为模板，设计上游引物PLA2R-F和下游引物PLA2R-R进行PCR扩增得到重组蛋白基因的开放阅读框序列，产物经纯化后与线性化UCOE载体进行一步克隆转入感受态细胞，经培养、菌落鉴定、质粒抽提后获得UCOE-PLA2R质粒；

(3)质粒大提：取上述质粒进行感受态转化并培养后，进行质粒大提，去除内毒素；

(4)抗原瞬转表达：进行抗原瞬转表达，将上述提纯后的质粒DNA对宿主细胞瞬时转染，所述宿主细胞为真核细胞，细胞株为expiCHO细胞，收集培养后细胞上清，纯化抗原并进行抗原反应性鉴定；

(5)稳株筛选：选取CHO-S细胞作为稳株筛选细胞系，质粒为UCOE-PLA2R进行稳株筛选，获得稳定表达抗原的单细胞株；

(6)抗原表达与纯化：将上述稳株细胞扩大培养，体积为1L，初始细胞密度为3×10⁵/ml，培养条件为37℃，5％CO₂，125rpm，培养周期为12天，当活力降至70％时，收集细胞上清并过滤，再先后进行金属螯合层析以及离子交换层析，获得高纯度的目的蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明提供的纯化的重组PLA2R蛋白易于表达和提纯，产量高，可达300mg/L，且能够与膜性肾病患者血液中的抗PLA2R抗体特异性地结合，并具有极高的亲和力，最低检测浓度能够达到0.39ng/ml。

2、该重组蛋白具有良好的稳定性，37℃可以保存至少15天，可以作为准确检测人血液中PLA2R抗体含量的体外诊断试剂盒的关键原料。

附图说明

图1瞬时转染的PLA2R重组蛋白PLA2R-T；

图2PLA2R重组蛋白纯度PLA2R-T；

图3间接ELISA法测定PLA2R重组蛋白PLA2R-T检测患者自身抗体的灵敏度；

图4PLA2R重组蛋白PLA2R-T的温度稳定性；

图5人PLA2R抗体检测试剂盒的校准曲线。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，如分子克隆实验指南(Cold spring Harbor laboratory Press,2001)、《GibcoExpiCHO Expression System Essential protocol guide》中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件执行。

实施例1PLA2R重组蛋白筛选

1、PLA2R序列及结构域信息获取

查询Uniprot网站，获得PLA2R序列信息，蛋白序列见SEQ ID No.3，其成熟结构由胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域组成(表1)。

表1PLA2R序列信息

2、重组蛋白片段设计及基因合成

基于全长蛋白序列，按照表2设计截短体，并在进行对应基因合成时，在每个重组蛋白的N端信号肽后加Flag标签(DYKDDDK)，并直接合成进pcDNA3.4载体。

表2PLA2R重组蛋白序列信息

3、质粒瞬转

HEK293T细胞复苏：取冻存管中的HEK293T细胞在37℃水浴锅中搅动溶解，向10cm培养皿中加入9ml培养基，并将解冻后的细胞加入培养基中，十字交叉混合均匀，27℃静置培养。1小时后，吸出培养基，换上新的10ml培养基继续培养。

细胞传代：吸弃培养基，加3ml预冷的1×PBS清洗一遍，吸弃PBS；加2ml预冷的0.02％EDTA清洗一遍，吸弃EDTA，加入1ml胰酶，使胰酶接触细胞约1分钟，吸弃胰酶，用残余的胰酶使之消化，约2分钟；加入1ml含有10％FBS血清的培养基，用移液器轻轻吹打细胞，将细胞团分散；另取3个10cm培养皿，加入7ml培养基，将上述分散均匀的细胞均分至这3培养皿中，十字交叉摇晃。静置培养，培养条件为37℃，5％CO2。

瞬转：取六孔板2块，在6孔板底放置一片玻片；前一天铺好密度约为70％的HEK293T细胞；取EP管，加入1ml无血清培养基，2μg质粒和8μg PEI，混合均匀后静置30分钟。#1-#10为PLA2R抗原10种不同长度的克隆质粒，#11为pcDNA3.4-GFP质粒，#12为pcDNA3.4空载质粒；将上述混合液加入细胞，37℃静置培养，12小时后将培养基换成含有10％FBS的培养基，培养36小时。

4、免疫荧光检测

过夜培养：在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3分钟；用4％的多聚甲醛固定爬片15分钟，PBS浸洗玻片3次，每次3分钟；在玻片上滴加通过肾脏活检确诊的特发性膜性肾病患者血清(来自南京军区总医院)，4℃孵育过夜；为了保证重组蛋白PLA2R蛋白的特异性，每种重组蛋白均用95例特发性膜性肾病患者血清筛选。

荧光图像采集：PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1小时，PBST浸洗切片3次，每次3分钟；

用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像，每个玻片采集三个视野，用Image J软件计算每个视野的荧光强度。

5、PLA2R抗原10个变体的表达量检测

样品制备：将本实施例步骤3中的#1-#10盖玻片上的细胞，用0.5mlRIPA裂解液(货号P0013B，购自碧云天公司)将细胞裂解，并转移细胞裂解液至1.5ml离心管中，13,000rpm离心10分钟，取上清。

电泳：制备8％SDS-PAGE，取#1-#10裂解上清上样30μL，80V电压预跑30分钟，150V电泳30分钟。

转膜：用转膜缓冲液平衡一张硝酸纤维素(NC)膜、两块海绵、四张滤纸；然后按照以下顺序叠放：一块海绵+两张滤纸+SDS-PAGE胶+NC膜+两张滤纸+一块海绵；保证叠放中无气泡；将靠近胶的那一面对着阴极，放入转膜槽，加入转膜液，4℃恒流325mA两小时。

抗体杂交：5％脱脂牛奶(1×TBST配制)封闭，室温孵育1小时；倒掉封闭液，加入稀释好的Flag抗体(5％脱脂牛奶配制)，4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST清洗膜3次，每次5分钟，加入羊抗鼠二抗(5％脱脂牛奶1：3000稀释)，室温孵育2小时。

显色：倒掉二抗，用TBST清洗膜3次，每次5分钟；加入ECL显色液，全自动化学发光处理系统(蛋白成像仪)显色；

灰度计算：将Western Blot结果导入Image J软件，分析灰度，获得野生型和两种野生型蛋白的灰度值，将全长抗原(#1)的表达量均一化为100％。

6、PLA2R重组蛋白确定

计算#1-#10克隆细胞荧光强度与蛋白表达量的比值，该比值代表了不同抗原与特发性膜性肾病患者自身抗体的亲和力强弱，即相对亲和力＝荧光强度/蛋白表达量。计算每种重组蛋白克隆相对亲和力的平均值和标准差，用ANOVA方法检验不同重组蛋白相对亲和力的强弱。

表3PLA2R重组蛋白的表达和免疫反应性

结果表明随着重组蛋白分子量下降，蛋白表达量上升；方差分析结果表明#2及#5重组蛋白的免疫反应性与全长蛋白无差异(p＝0.013和p＝0.022)，而#5的蛋白表达量比#2更高，因此确定#5重组蛋白是适合进行大规模重组表达的PLA2R重组蛋白。

通过分析发现，

本实施例通过对PLA2R的胞外区包含的8个C-type lectin结构域进行相互替代，发现了#5重组蛋白在胞外区蛋白中去掉部分C-type lectin结构域既可以降低PLA2R重组蛋白的分子量，又可以提高重组蛋白的产量，且不影响PLA2R重组蛋白与患者自身抗体反应的灵敏度和特异性，本实施例的#5重组蛋白，即PLA2R重组蛋白PLA2R-T，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2 PLA2R重组蛋白PLA2R-T的克隆构建

1、载体制备

选用Expression Vector-Mouse 3.2kb Hygro set(504866)作为载体，使用FseI和BmtI限制性内切酶线性化该载体，参照Axygen DNA Clean up试剂盒使用说明书，进行载体回收。

2、PLA2R#5DNA片段获得

以实施例1中#5质粒为模板，设计上游引物上游引物PLA2R-F(GTTAAGTTAACGGCCATGCTGCTGTCGCCG)和下游引物PLA2R-R(ATCGCGCTAGCGGCCTTAATGGTGATGGTGATGATG)进行PCR扩增，得到PLA2R重组蛋白PLA2R-T基因的开放阅读框序列，序列中包含#5序列中的Ricin B-type lectin结构域、Fibronectintype-II结构域和C-type lectin结构域1、3和4，以及6×组氨酸标签，但不包含跨膜结构域和胞外结构域，以免其影响可溶性表达。参照Axygen公司纯化试剂盒说明书对PCR产物进行纯化。

上述PCR反应体系为：模板质粒1μl，10×扩增缓冲液10μl，dNTP混合物(2.5mmol/L)4μl，引物(10μmol/L)各2μl，Phanta高保真聚合酶1μl，终体积加入ddH₂O至100μl；PCR反应条件为：95℃，5分钟；95℃30s,59℃65s,72℃30s,35个循环；72℃10分钟。

3、质粒构建

将纯化后的PLA2R DNA片段和UCOE载体使用One drop定量。按照重组体系：5x CEII Buffer 4μl；线性化UCOE载体200ng；PLA2R DNA片段220ng；Exnase II 2μl；ddH2O加至20μl，混匀，置于37℃反应30分钟。将反应管置于冰水浴中冷却5分钟。取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，在冰上放置30分钟。42℃热激90秒，冰水浴孵育2分钟，加入900μl LB培养基，37℃孵育10分钟充分复苏。37℃摇菌45分钟。取100μl菌液均匀涂布在氨苄平板上，倒置于37℃过夜培养。挑取重组反应转化平板上7个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定引物为：PLA2R-F&PLA2R-R，将阳性克隆进行测序，测序正确后，使用质粒抽提试剂盒进行小量质粒抽提即为所需质粒UCOE-PLA2R。

4、质粒大提

将步骤3中的UCOE-PLA2R质粒，使用DH5α感受态进行转化并涂布在氨苄板，37℃过夜培养。挑取单克隆转接至3ml新鲜LB培养基，培养9h。取400μl过夜培养菌液，接种至200ml新鲜LB培养基，37℃过夜培养，按照天根去内毒素大提试剂盒说明书进行质粒大提。

实施例3 PLA2R重组蛋白PLA2R-T的表达与纯化

1、抗原的瞬转表达

瞬转所用细胞株为expiCHO细胞(Thermo Fisher)，质粒为UCOE-PLA2R。

细胞复苏：取冻存管中的expiCHO细胞在37℃水浴锅中搅动溶解，向10cm培养皿中加入9ml培养基，并将解冻后的细胞加入培养基中，十字交叉混合均匀，27℃静置培养。1小时后，吸出培养基，取用新的10ml培养基继续培养。

瞬转：取六孔板1块，铺好密度约为70％的expiCHO细胞；取EP管，加入1ml无血清培养基，2μg质粒和8μg PEI，混合均匀后静置30分钟。1-3为PLA2R重组蛋白抗原#5克隆质粒，4为UCOE空载质粒；将上述混合液加入细胞，37℃静置培养，12小时后将培养基换成含有10％FBS的培养基，培养36小时。

抗原的表达与检测：收集细胞上清，进行步骤4中的抗原纯化获得抗原。采用Western Blot进行抗原反应性检测，其中以特发性膜性肾病患者血清作为一抗，HPR标记的兔抗人IgG作为二抗。测试结果如图1所示。

2、稳株筛选

用于稳株筛选的细胞系为CHO-S细胞，质粒为UCOE-PLA2R。

将常规传代培养的CHO-S细胞以0.8×10⁵/孔接种于24孔板，用10％小牛血清的DMEM/F12培养基培养，待细胞80％融合时进行转染。用无血清的DMEM/F12培养基清洗单层生长的CHO细胞，分别用500μl无血清DMEM/F12培养基稀释8μg质粒DNA和10μlLipofectamine^TM2000，在5分钟内将二者混合，室温放置20分钟后加入培养孔中，设置4孔细胞不加任何质粒为对照；4孔细胞加入UCOE质粒；4孔细胞加入UCOE-PLA2R(Mu)；37℃、5％CO₂条件下培养48h后，将细胞洗下，用有限稀释法辅以倍比稀释法(即取需单克隆化的细胞制成约50/ml的悬液，在96孔板中每孔加100μl，再在顺序的4个空孔中进行倍比稀释)，转至96孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养。24小时细胞贴壁后加G418(900μg/ml)继续培养。两天后，倒置显微镜下观察培养板各孔细胞，挑选只含一个细胞的孔，用G418(900μg/ml)继续培养，每隔3～4天更换培养液，并观察细胞生长状况。细胞培养1周左右，孔中形成较大的克隆，转至6孔板中扩大培养；所有单克隆细胞均扩大培养并冻存。

3、抗原表达

将获得的稳定细胞株进行扩大培养，初始细胞密度为3×10⁵/ml，培养条件为37℃，5％CO₂，125rpm，培养周期为12天，隔天检测细胞密度和活力，当活力降至70％，进行细胞上清收集。

4、抗原纯化

将培养好的细胞转移至离心瓶中，2000rpm，4℃，离心20分钟，取上清，弃沉淀。将上清再次转移到离心瓶中，6000rpm，4℃，离心20分钟，取上清。获得的上清，使用0.45μm滤膜进行过滤。

将过滤好的上清，进行Ni sepharose high performance纯化。其中平衡buffer为：20mMTris-HCl，500mMNaCl，5％甘油，pH 7.5；高盐buffer：20mMTris-HCl，1.5MNaCl，5％甘油，pH 7.5；洗脱Buffer为：20mMTris-HCl，350mMNaCl，500mM咪唑，5％甘油，pH 7.5。将洗脱后的样品使用G25脱盐柱脱盐，置换buffer为：20mMTris-HCl，100mMNaCl，pH 7.5。

脱盐后样品使用QFF阴离子交换柱纯化。其中buffer A：20mMTris-HCl，pH 7.5，buffer B：20mMTris-HCl，1M NaCl，pH 7.5。洗脱后的样品使用G25脱盐柱脱盐，置换buffer为：20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH 7.5。

脱盐后样品使用30kDa浓缩管浓缩蛋白，蛋白浓缩至1mg/ml，-80℃保存，用SDS-PAGE方法检测蛋白纯度及分子量。

结果表明PLA2R重组蛋白PLA2R-T的表观分子量为100kDa，比理论分子量更大，说明该蛋白是经过糖基化的成熟蛋白，其纯度可以达到90％以上(图2)。按照实施例中的实验条件计算，每升培养基可获得300mg蛋白，产量较高。

实施例4抗原免疫反应性评价

1、检测人PLA2R抗体预包被抗原酶标板的制备

(1)准备96孔聚苯乙烯微孔板，将纯化的PLA2R重组蛋白PLA2R-T用包被稀释液稀释，制成浓度为0.98ng/ml、1.95ng/ml、3.91ng/ml、7.81ng/ml、15.63ng/ml、31.2ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的11个梯度的抗原稀释液，并以包被稀释液作为0ng/ml。每孔加入100μl抗原稀释液进行包被；

(2)弃去96孔板中液体，用PBS洗涤3次，甩干96孔板；

(3)每孔加入200μl封闭液，封闭液为3％BSA溶液，封膜，置于37℃隔水式恒温培养箱，2小时；

(4)重复步骤(2)。

2、其他相关试剂准备

(1)酶标二抗稀释液：工作浓度的HRP兔抗人IgG二抗(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)；

(2)洗涤液：含0.1％Tween-20的1×PBS,pH 7.5；

(3)显色剂TMB A、B液：底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺；

(4)终止液：2M H₂SO₄溶液；

(5)样本：7例特发性膜性肾病患者血清，诊断方法学为肾脏活检，1例正常人血清，来源均为南京军区总医院。

3、抗原灵敏度测试

取包被好的96孔板，包被有相同抗原量的不同孔中分别加入阳性血清样本、阴性对照50μl，空白对照孔不加样；封膜后置于37℃隔水式恒温培养箱，孵育1小时；洗板，每孔加入显色剂A、B液各50μl，混匀后置于37℃隔水式恒温培养箱，孵育15分钟；每孔加入终止液50μl，混匀，在酶标仪上设定450nm波长检测，以空白对照校零，读取各孔OD值，认为OD值≥0.2即为检出抗体；

图3结果表明，随着包被抗原的浓度升高，检测待检血清的OD值也随之增大，空白对照与阴性血清基本不变。所有确诊病人的血清均可检测到抗体，在包被抗原浓度在3.91ng/ml以上，即包被抗原量为0.39ng以上时，即可在血清中检测出抗体。

实施例5 PLA2R重组蛋白PLA2R-T稳定性评价

1、-20℃/4℃/37℃PLA2R重组蛋白PLA2R-T准备

取制备好的保存于-80℃的抗原3管，抗原浓度为1mg/ml，储存条件：20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH 7.5，分别放置于-20℃/4℃/37℃，在实验开始后的1、3、5、7、9、11、13、15、20、25、30、40天同一时间分别取样，以-80℃保存样本作为对照。

2、抗原稳定性监测

将不同条件保存的PLA2R重组蛋白PLA2R-T用碳酸钠包被稀释液稀释，稀释终浓度为30ng/ml，包被于96孔聚苯乙烯微孔板，间接ELISA检测抗原活性的变化。图4结果表明，4℃下PLA2R重组蛋白PLA2R-T可保存30天以上，37℃下可保存15天以上，说明该蛋白具有良好的温度稳定性。

实施例6利用PLA2R重组蛋白PLA2R-T制备人血中PLA2R抗体定量检测试剂盒(酶联免疫吸附法)

1、检测人PLA2R抗体预包被抗原酶标板的制备

利用上述PLA2R重组蛋白PLA2R-T，用碳酸钠包被稀释液稀释PLA2R重组蛋白PLA2R-T至15ng/ml，在96孔板每孔加入100μl抗原稀释液包被。弃去96孔板中液体，用PBS洗涤3次，甩干；每个孔中加入200μl封闭液，封闭液为3％BSA溶液，封膜置于37℃隔水式恒温培养箱，2小时；弃去96孔板中液体，用PBS洗涤3次，甩干，封膜后2-8℃保存，待用。

2、检测人PLA2R抗体其他相关试剂准备

(1)酶标二抗稀释液：工作浓度的HRP兔抗人IgG二抗(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)；

(2)洗涤液：含0.1％Tween-20的1×PBS，pH 7.5；

(4)终止液：2M H₂SO₄溶液；

(5)样本：98例特发性膜性肾病患者血清，及52例非特发性膜性肾病的慢性肾病患者血清，血清来源为南京军区总医院，诊断方法学为肾脏活检。

(6)校准品：临床阳性血清样本，经多只混合、灭活、过滤处理，经严格溯源并根据临床实践确定了校准浓度点10RU/ml、120RU/ml、500RU/ml、1000RU/ml、2000RU/ml(RU/ml表示相对单位)。血清样本为特发性膜性肾病患者血清，血清来源为南京军区总医院，诊断方法学为肾脏活检。

3、PLA2R抗体检测试剂盒检测样本的方法

(1)加样：取出预包被好的微孔板，向每个孔中加入待测样品50μl；

(2)孵育：用封板膜封盖反应板，置于37℃隔水式恒温培养箱，孵育1小时；

(3)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中的液体，加满洗涤液，浸泡5s，反复洗板3次，最后将微孔板甩干；

(4)加底物液：向待测样本孔加入显色剂A、B液各50μl，震荡仪震荡混匀，置于37℃隔水式恒温培养箱中，孵育15分钟；

(5)加终止液：向待测样本孔加入终止液50μl，震荡仪震荡混匀；

(6)检测：在酶标仪上设定450nm波长检测，以空白对照校零，再读取各孔OD值；

4、试剂盒临床样本测试性能比对

(1)按照样本检测方法，测试校准品并根据实验结果绘制标准曲线(如图5所示)。图3中曲线上的每一个点代表一个含量的校准品。其中X轴表示PLA2R受体的含量，Y轴表示测试OD值。

(2)选取通过组织病理学检验确诊为特发性膜性肾病患者血清98例，非特发性膜性肾病病人血清52例，以组织病理学检验作为参考系统，检测待测样本进行比对。用四格表统计结果如下：

特异性＝真阴性/阴性总数×100％

敏感性＝真阳性/阳性总数×100％

表4四格表统计结果

表4结果表明，试剂盒的特异性为100％，敏感性为73.45％。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京诺唯赞医疗科技有限公司

<120> 特发性膜性肾病相关的PLA2R重组蛋白及其应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

atgctgctgt cgccgtcgct gctgctgctg ctgctgctgg gggcgccgcg gggctgcgcc 60

gagggtgtgg cggcggcgct tacccccgag cggctcctgg agtggcagga taaaggaata 120

tttgttatcc aaagtgagag tctcaagaaa tgcattcaag caggtaaatc ggttctgacc 180

ctggagaact gcaagcaagc aaacaagcac atgctgtgga aatgggtttc aaaccatggc 240

ctctttaaca taggaggcag tggttgcctg ggcctgaatt tctccgcccc agagcagcca 300

ttaagcttat atgaatgtga ctccaccctc gtttccttac ggtggcgctg taacaggaag 360

atgatcacag gcccgctgca gtactctgtc caggtggcgc atgacaacac agtggtggcc 420

tcacggaagt atattcataa gtggatttct tatgggtcag gtggtggaga catttgtgaa 480

tatctacaca aagatttgca tacaatcaaa gggaacaccc acgggatgcc gtgtatgttt 540

cccttccagt ataaccatca gtggcatcat gaatgtaccc gtgaaggtcg ggaagatgac 600

ttactgtggt gtgccacgac aagccgttat gaaagagatg aaaagtgggg attttgccct 660

gatcccacct ctgcagaagt aggttgtgat actatttggg agaaggacct caattcacac 720

atttgctacc agttcaacct gctttcatct ctctcttgga gtgaggcaca ttcttcatgc 780

cagatgcaag gaggtacgct gttaagtatt acagatgaaa ctgaagaaaa tttcataagg 840

gagcacatga gcagtaaaac agtggaggtg tggatgggcc tcaatcagct ggatgaacac 900

gctggctggc agtggtctga tggaacgccg ctcaactatc tgaattggag cccagaggta 960

aattttgagc catttgttga agatcactgt ggaacattta gttcatttat gccaagtgcc 1020

tggaggagtc gggattgtga gtccaccttg ccatatatat gtaaaaaata tctaaaccac 1080

attgatcatg aaatagttga aaaagatgcg tggaaatatt atgctaccca ctgtgagcct 1140

ggctggaatc cccatggtgg attctgttac aaaattgaca cagtccttcg aagctttgac 1200

caagcttcca gcggttatta ctgtcctcct gcacttgtaa ccattacaaa caggtttgaa 1260

caggctttta ttaccagttt gatcagtagt gtggtaaaaa tgaaggacag ttatttttgg 1320

atagctcttc aggaccaaaa tgatacggga gaatacactt ggaagccagt agggcagaaa 1380

cccgagccgg tgcagtacac acactggaac acacaccagc cgcgctacag tggtggctgt 1440

gttgccatgc gaggaaggca tccacttggt cgctgggaag tgaagcactg tcggcacttt 1500

aaggcaatgt ccttgtgcaa gcagccagtt gaaaatcagg aaaaagcaga gtatgaagag 1560

agatggccct ttcacccctg ctatttggac tgggagtcag agcctggtct ggccagttgc 1620

ttcaaggtat ttcatagtga aaaagttctg atgaaaagaa catggagaga agctgaagca 1680

ttttgcgaag aatttggagc tcatcttgca agctttgccc atattgagga agagaatttt 1740

gtgaatgagc tcttacattc aaaatttaat tggacagaag aaaggcagtt ctggattgga 1800

tttaataaaa gaaacccact gaatgccggc tcatgggagt ggtctgatag aactcctgtt 1860

gtctcttcgt ttttagacaa cacttatttt ggagaagatg caagaaactg tgctgtttat 1920

aaggcaaaca aaacattgct gcccttacac tgtggttcca aacgtgaatg gatatgcaaa 1980

atcccaagag atgtgaaacc caagattccg ttctggtacc agtacgatgt accctggctc 2040

ttttaa 2046

<210> 2

<211> 661

<212> PRT

<213> 人肾上皮细胞系

<400> 2

Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu Leu Glu Trp Gln

1 5 10 15

Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu Lys Lys Cys Ile

20 25 30

Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys Lys Gln Ala Asn

35 40 45

Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly Leu Phe Asn Ile

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala Pro Glu Gln Pro

65 70 75 80

Leu Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser Leu Arg Trp Arg

85 90 95

Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr Ser Val Gln Val

100 105 110

Ala His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr Ile His Lys Trp

115 120 125

Ile Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu Tyr Leu His Lys

130 135 140

Asp Leu His Thr Ile Lys Gly Asn Thr His Gly Met Pro Cys Met Phe

145 150 155 160

Pro Phe Gln Tyr Asn His Gln Trp His His Glu Cys Thr Arg Glu Gly

165 170 175

Arg Glu Asp Asp Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Arg Tyr Glu Arg

180 185 190

Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser Ala Glu Val Gly

195 200 205

Cys Asp Thr Ile Trp Glu Lys Asp Leu Asn Ser His Ile Cys Tyr Gln

210 215 220

Phe Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala His Ser Ser Cys

225 230 235 240

Gln Met Gln Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asp Glu Thr Glu Glu

245 250 255

Asn Phe Ile Arg Glu His Met Ser Ser Lys Thr Val Glu Val Trp Met

260 265 270

Gly Leu Asn Gln Leu Asp Glu His Ala Gly Trp Gln Trp Ser Asp Gly

275 280 285

Thr Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Ser Pro Glu Val Asn Phe Glu Pro

290 295 300

Phe Val Glu Asp His Cys Gly Thr Phe Ser Ser Phe Met Pro Ser Ala

305 310 315 320

Trp Arg Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Lys

325 330 335

Tyr Leu Asn His Ile Asp His Glu Ile Val Glu Lys Asp Ala Trp Lys

340 345 350

Tyr Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro His Gly Gly Phe

355 360 365

Cys Tyr Lys Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser

370 375 380

Gly Tyr Tyr Cys Pro Pro Ala Leu Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu

385 390 395 400

Gln Ala Phe Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp

405 410 415

Ser Tyr Phe Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr

420 425 430

Thr Trp Lys Pro Val Gly Gln Lys Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His

435 440 445

Trp Asn Thr His Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg

450 455 460

Gly Arg His Pro Leu Gly Arg Trp Glu Val Lys His Cys Arg His Phe

465 470 475 480

Lys Ala Met Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala

485 490 495

Glu Tyr Glu Glu Arg Trp Pro Phe His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu

500 505 510

Ser Glu Pro Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys

515 520 525

Val Leu Met Lys Arg Thr Trp Arg Glu Ala Glu Ala Phe Cys Glu Glu

530 535 540

Phe Gly Ala His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe

545 550 555 560

Val Asn Glu Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Trp Thr Glu Glu Arg Gln

565 570 575

Phe Trp Ile Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp

580 585 590

Glu Trp Ser Asp Arg Thr Pro Val Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Thr

595 600 605

Tyr Phe Gly Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys

610 615 620

Thr Leu Leu Pro Leu His Cys Gly Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys

625 630 635 640

Ile Pro Arg Asp Val Lys Pro Lys Ile Pro Phe Trp Tyr Gln Tyr Asp

645 650 655

Val Pro Trp Leu Phe

660

<210> 3

<211> 1463

<212> PRT

<213> 人肾上皮细胞系

<400> 3

Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Arg Gly Cys Ala Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu

20 25 30

Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu

35 40 45

Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys

50 55 60

Lys Gln Ala Asn Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly

65 70 75 80

Leu Phe Asn Ile Gly Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala

85 90 95

Pro Glu Gln Pro Leu Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser

100 105 110

Leu Arg Trp Arg Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr

115 120 125

Ser Val Gln Val Ala His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr

130 135 140

Ile His Lys Trp Ile Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu

145 150 155 160

Tyr Leu His Lys Asp Leu His Thr Ile Lys Gly Asn Thr His Gly Met

165 170 175

Pro Cys Met Phe Pro Phe Gln Tyr Asn His Gln Trp His His Glu Cys

180 185 190

Thr Arg Glu Gly Arg Glu Asp Asp Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser

195 200 205

Arg Tyr Glu Arg Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser

210 215 220

Ala Glu Val Gly Cys Asp Thr Ile Trp Glu Lys Asp Leu Asn Ser His

225 230 235 240

Ile Cys Tyr Gln Phe Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala

245 250 255

His Ser Ser Cys Gln Met Gln Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asp

260 265 270

Glu Thr Glu Glu Asn Phe Ile Arg Glu His Met Ser Ser Lys Thr Val

275 280 285

Glu Val Trp Met Gly Leu Asn Gln Leu Asp Glu His Ala Gly Trp Gln

290 295 300

Trp Ser Asp Gly Thr Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Ser Pro Glu Val

305 310 315 320

Asn Phe Glu Pro Phe Val Glu Asp His Cys Gly Thr Phe Ser Ser Phe

325 330 335

Met Pro Ser Ala Trp Arg Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Leu Asn His Ile Asp His Glu Ile Val Glu Lys

355 360 365

Asp Ala Trp Lys Tyr Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro

370 375 380

Tyr Asn Arg Asn Cys Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Glu Lys Thr Trp His

385 390 395 400

Glu Ala Leu Arg Ser Cys Gln Ala Asp Asn Ser Ala Leu Ile Asp Ile

405 410 415

Thr Ser Leu Ala Glu Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu

420 425 430

Asn Ala Ser Glu Thr Trp Ile Gly Leu Ser Ser Asn Lys Ile Pro Val

435 440 445

Ser Phe Glu Trp Ser Asn Asp Ser Ser Val Ile Phe Thr Asn Trp His

450 455 460

Thr Leu Glu Pro His Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser

465 470 475 480

Ala Glu Gln Ser Glu Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Arg

485 490 495

Leu Phe Tyr Ile Cys Lys Lys Ala Gly His Val Leu Ser Asp Ala Glu

500 505 510

Ser Gly Cys Gln Glu Gly Trp Glu Arg His Gly Gly Phe Cys Tyr Lys

515 520 525

Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr

530 535 540

Cys Pro Pro Ala Leu Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe

545 550 555 560

Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp Ser Tyr Phe

565 570 575

Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys

580 585 590

Pro Val Gly Gln Lys Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His Trp Asn Thr

595 600 605

His Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg Gly Arg His

610 615 620

Pro Leu Gly Arg Trp Glu Val Lys His Cys Arg His Phe Lys Ala Met

625 630 635 640

Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Tyr Glu

645 650 655

Glu Arg Trp Pro Phe His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro

660 665 670

Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met

675 680 685

Lys Arg Thr Trp Arg Glu Ala Glu Ala Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala

690 695 700

His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu

705 710 715 720

Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Trp Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile

725 730 735

Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser

740 745 750

Asp Arg Thr Pro Val Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Thr Tyr Phe Gly

755 760 765

Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu

770 775 780

Pro Leu His Cys Gly Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg

785 790 795 800

Asp Val Lys Pro Lys Ile Pro Phe Trp Tyr Gln Tyr Asp Val Pro Trp

805 810 815

Leu Phe Tyr Gln Asp Ala Glu Tyr Leu Phe His Thr Phe Ala Ser Glu

820 825 830

Trp Leu Asn Phe Glu Phe Val Cys Ser Trp Leu His Ser Asp Leu Leu

835 840 845

Thr Ile His Ser Ala His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Lys

850 855 860

Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Trp Ile Gly Leu Gln Glu Glu

865 870 875 880

Arg Ala Asn Asp Glu Phe Arg Trp Arg Asp Gly Thr Pro Val Ile Tyr

885 890 895

Gln Asn Trp Asp Thr Gly Arg Glu Arg Thr Val Asn Asn Gln Ser Gln

900 905 910

Arg Cys Gly Phe Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Gly Ser Glu Glu

915 920 925

Cys Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Leu

930 935 940

Ile Glu Lys Lys Lys Asp Thr Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Lys

945 950 955 960

Gly Trp Leu Tyr Phe Asn Tyr Lys Cys Leu Leu Leu Asn Ile Pro Lys

965 970 975

Asp Pro Ser Ser Trp Lys Asn Trp Thr His Ala Gln His Phe Cys Ala

980 985 990

Glu Glu Gly Gly Thr Leu Val Ala Ile Glu Ser Glu Val Glu Gln Ala

995 1000 1005

Phe Ile Thr Met Asn Leu Phe Gly Gln Thr Thr Ser Val Trp Ile

1010 1015 1020

Gly Leu Gln Asn Asp Asp Tyr Glu Thr Trp Leu Asn Gly Lys Pro

1025 1030 1035

Val Val Tyr Ser Asn Trp Ser Pro Phe Asp Ile Ile Asn Ile Pro

1040 1045 1050

Ser His Asn Thr Thr Glu Val Gln Lys His Ile Pro Leu Cys Ala

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Ser Asn Pro Asn Phe His Phe Thr Gly Lys Trp Tyr

1070 1075 1080

Phe Glu Asp Cys Gly Lys Glu Gly Tyr Gly Phe Val Cys Glu Lys

1085 1090 1095

Met Gln Asp Thr Ser Gly His Gly Val Asn Thr Ser Asp Met Tyr

1100 1105 1110

Pro Met Pro Asn Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Arg Thr Tyr Lys Ile

1115 1120 1125

Ile Asn Ala Asn Met Thr Trp Tyr Ala Ala Ile Lys Thr Cys Leu

1130 1135 1140

Met His Lys Ala Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp Gln Tyr His Gln

1145 1150 1155

Ser Phe Leu Thr Val Val Leu Asn Arg Leu Gly Tyr Ala His Trp

1160 1165 1170

Ile Gly Leu Phe Thr Thr Asp Asn Gly Leu Asn Phe Asp Trp Ser

1175 1180 1185

Asp Gly Thr Lys Ser Ser Phe Thr Phe Trp Lys Asp Glu Glu Ser

1190 1195 1200

Ser Leu Leu Gly Asp Cys Val Phe Ala Asp Ser Asn Gly Arg Trp

1205 1210 1215

His Ser Thr Ala Cys Glu Ser Phe Leu Gln Gly Ala Ile Cys His

1220 1225 1230

Val Pro Pro Glu Thr Arg Gln Ser Glu His Pro Glu Leu Cys Ser

1235 1240 1245

Glu Thr Ser Ile Pro Trp Ile Lys Phe Lys Ser Asn Cys Tyr Ser

1250 1255 1260

Phe Ser Thr Val Leu Asp Ser Met Ser Phe Glu Ala Ala His Glu

1265 1270 1275

Phe Cys Lys Lys Glu Gly Ser Asn Leu Leu Thr Ile Lys Asp Glu

1280 1285 1290

Ala Glu Asn Ala Phe Leu Leu Glu Glu Leu Phe Ala Phe Gly Ser

1295 1300 1305

Ser Val Gln Met Val Trp Leu Asn Ala Gln Phe Asp Gly Asn Asn

1310 1315 1320

Glu Thr Ile Lys Trp Phe Asp Gly Thr Pro Thr Asp Gln Ser Asn

1325 1330 1335

Trp Gly Ile Arg Lys Pro Asp Thr Asp Tyr Phe Lys Pro His His

1340 1345 1350

Cys Val Ala Leu Arg Ile Pro Glu Gly Leu Trp Gln Leu Ser Pro

1355 1360 1365

Cys Gln Glu Lys Lys Gly Phe Ile Cys Lys Met Glu Ala Asp Ile

1370 1375 1380

His Thr Ala Glu Ala Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser His Ser Ile

1385 1390 1395

Ile Pro Leu Ala Val Val Leu Thr Leu Ile Val Ile Val Ala Ile

1400 1405 1410

Cys Thr Leu Ser Phe Cys Ile Tyr Lys His Asn Gly Gly Phe Phe

1415 1420 1425

Arg Arg Leu Ala Gly Phe Arg Asn Pro Tyr Tyr Pro Ala Thr Asn

1430 1435 1440

Phe Ser Thr Val Tyr Leu Glu Glu Asn Ile Leu Ile Ser Asp Leu

1445 1450 1455

Glu Lys Ser Asp Gln

1460

Claims

1.一种PLA2R重组蛋白PLA2R-T，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的基因。

3.一种基因，其特征在于，所述基因是如下1)或2)所示的DNA分子：

1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

2)与SEQ ID No.1所示DNA序列杂交且编码SEQ ID No.2所示重组蛋白PLA2R-T的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组质粒。

5.含有权利要求4所述重组质粒的单细胞株。

6.一种含有权利要求1所述PLA2R重组蛋白PLA2R-T的试剂盒。

7.权利要求1所述的PLA2R重组蛋白PLA2R-T或权利要求6所述的试剂盒在制备免疫学诊断试剂中的应用。

8.权利要求1所述的PLA2R重组蛋白PLA2R-T或权利要求6所述的试剂盒在制备特发性膜性肾病免疫学诊断试剂中的应用。

9.一种PLA2R重组蛋白的制备方法，其特征在于，根据PLA2R的胞外区包含的8个C-typelectin结构域，设计不同的截短体，每个截短体包含至少一个C-type lectin结构域或者至少包含一个C-type lectin结构域及其C端连接区；每个截短体与PLA2R胞外区的Ricin B-type lectin结构域和Fibronectin type-II结构域组成PLA2R重组蛋白，筛选出表达量高于PLA2R全长蛋白，且具有免疫特异性的重组蛋白。

10.根据权利要求9所述方法所制备出的重组蛋白。