CN108948181A - 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法 - Google Patents

一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108948181A
CN108948181A CN201810728337.2A CN201810728337A CN108948181A CN 108948181 A CN108948181 A CN 108948181A CN 201810728337 A CN201810728337 A CN 201810728337A CN 108948181 A CN108948181 A CN 108948181A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
pla2r
transfection
preparation
processing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810728337.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郁胜强
麦靖邦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruino Medical Technology (shanghai) Co Ltd
Original Assignee
Ruino Medical Technology (shanghai) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruino Medical Technology (shanghai) Co Ltd filed Critical Ruino Medical Technology (shanghai) Co Ltd
Priority to CN201810728337.2A priority Critical patent/CN108948181A/zh
Publication of CN108948181A publication Critical patent/CN108948181A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Abstract

本发明提供一种磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，包括：根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理；将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物；利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞；对所述转染细胞进行压力筛选处理；对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理；利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。本发明提供的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，能够制备出高纯度PLA2R蛋白，可以定量检测血清样本中PLA2R抗体的浓度，与传统的侵入性肾病活体检测相比，对患者的伤害性非常小，在临床上具有良好的应用前景。

Description

一种磷脂酶A2受体蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种磷脂酶A2受体蛋白的制备方法。
背景技术
膜性肾病(Membranous Nephropathy，MN)是成人肾病综合征(NephroticSyndrome，NS)最常见的病理类型，为我国原发性肾小球疾病的第二大病因，其中70％膜性肾病患者表现为持续反复的蛋白尿，从而导致肾脏损伤，甚至危及生命。膜性肾病可分为特发性膜性肾病(Idiopathic Membranous Nephropathy，IMN)和继发性膜性肾病(SecondaryMembranous Nephropathy，SMN)，其中IMN患者约占70％～80％，SMN患者约占20％～30％。其中75％～85％的IMN患者有肾病程度的蛋白尿，约40％～60％的IMN患者会在5～20年内发展为终末期肾衰竭。传统的IMN临床诊断方法为肾脏穿刺进行肾组织病理学检查，包括光镜、荧光和电镜，这是一种侵入式的检测方法，不仅需要有较高的技术要求，还对患者有一定的损伤。
现有技术中已经证实PLA2R受体，即磷脂酶A2受体，是自身抗体的主要靶抗原，研究发现75％的IMN患者血清中抗PLA2R受体抗体为阳性，而SMN患者极少表现为阳性，其他类型肾小球疾病患者、健康人群均为阴性。然而目前缺少高纯度的PLA2R蛋白，以检测IMN患者血清中的抗体。
发明内容
本发明提供一种磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，以解决制备磷脂酶A2受体蛋白的问题。
本发明的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，包括：
根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理；
将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物；
利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞；
对所述转染细胞进行压力筛选处理；
对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理；
利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。
进一步，本发明所述的制备方法，所述根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物的步骤具体包括：
设计所述PCR引物的PLA2R胞外片段基因正向引物和PLA2R胞外片段基因反向引物；
其中，所述PLA2R胞外片段基因正向引物设有第一限制性酶切位点，所述PLA2R胞外片段基因反向引物设有第二限制性酶切位点。
进一步，本发明所述的制备方法，
根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因正向引物：
5’-CGTGGCCGGCCGCCGCCACCATGCTGCTG-3’；
其中，所述第一限制性酶切位点为：GGCCGGCC；
并且，根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因反向引物：
5’-TAAGCTAGCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTCCTTATCATCGTCGTCTTTGTAATCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGCTGCCACCGCCACCGCTGTGACTTGGTCCTTTTTCTGGC-3’；
其中，所述第二限制性酶切位点为：GCTAGC。
进一步，本发明所述的制备方法，所述PCR扩增处理的步骤具体包括：
利用PCR缓冲液、所述PLA2R胞外片段基因正向引物、所述PLA2R胞外片段基因反向引物和cDNA模板配制PCR反应溶液进行PCR反应，以获取扩增的PCR产物。
进一步，本发明所述的制备方法，
具体按照如下表1的体积比配制所述PCR反应溶液：
表1
并且，具体按照如下表2的条件进行所述PCR反应：
表2。
进一步，本发明所述的制备方法，在配制PCR反应溶液进行PCR反应之后，还包括：
利用琼脂糖凝胶检测所述PCR产物，将符合DNA分子量标准的所述PCR产物进行回收和纯化处理。
进一步，本发明所述的制备方法，将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体的步骤具体包括：
利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对质粒进行双酶切处理，以获取所述质粒载体；
利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对所述PCR产物进行双酶切处理，以获取所述PLA2R胞外片段基因；
将所述PLA2R胞外片段基因与所述质粒载体进行连接处理，以获取所述连接产物。
进一步，本发明所述的制备方法，具体按照如下表3的体积比混合以对质粒进行双酶切处理：
试剂名称 体积比
限制性内切酶缓冲液 9％～11％
第一限制性酶切位点酶 1％～3％
第二限制性酶切位点酶 1％～3％
表达质粒 1％～3％
小牛肠碱性磷酸酶 11％～13％
双蒸水 77％～67％
表3
其中，对质粒进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴1.4小时～1.6小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述质粒载体。
进一步，本发明所述的制备方法，具体按照如下表4的体积比混合以对所述PCR产物进行双酶切处理：
试剂名称 体积比
限制性内切酶缓冲液 9％～11％
第一限制性酶切位点酶 1％～3％
第二限制性酶切位点酶 1％～3％
PCR产物 29％～31％
双蒸水 60％～52％
表4
其中，对所述PCR产物进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴2.4小时～2.6小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述PLA2R胞外片段基因。
进一步，本发明所述的制备方法，具体按照如下表5的体积比混合以进行所述连接处理：
表5
其中，所述连接处理的条件为：24℃～26℃水浴4.4小时～4.6小时。
进一步，本发明所述的制备方法，在将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体之后，在利用所述连接产物进行转染处理之前，还包括：
对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物。
进一步，本发明所述的制备方法，所述利用所述连接产物进行转染处理的步骤具体包括：
培养种子细胞；
利用所述连接产物得到DNA复合物；
将所述DNA复合物加入所述种子细胞进行转染，以得到所述转染细胞。
进一步，本发明所述的制备方法，所述种子细胞采用仓鼠卵巢细胞，培养所述种子细胞的密度至1.1E6/毫升以上。
进一步，本发明所述的制备方法，利用所述连接产物得到DNA复合物的步骤具体包括：
使用第一无血清培养基稀释所述连接产物得到经过稀释的连接产物；
使用第二无血清培养基稀释转染试剂得到经过稀释的转染试剂；
将所述经过稀释的连接产物与所述经过稀释的转染试剂混合，以得到所述DNA复合物。
进一步，本发明所述的制备方法，所述对所述转染细胞进行压力筛选处理的步骤具体包括：
将所述转染细胞加入至含有抗生素的筛选培养基；
当所述转染细胞的存活率达到预设存活阈值以上时，对所述转染细胞进行恢复培养。
进一步，本发明所述的制备方法，在所述压力筛选处理之后，在所述细胞株单克隆化处理之前，还包括：
对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
进一步，本发明所述的制备方法，对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理的步骤具体包括：
按照细胞培养板中每孔一个细胞的标准，将所述转染细胞加入至所述细胞培养板中进行培养。
进一步，本发明所述的制备方法，将所述转染细胞加入至所述细胞培养板中进行培养的步骤具体包括：
稀释包含所述转染细胞的细胞液，并将所述细胞液加入至含谷氨酰胺的CD培养基；其中，所述转染细胞的密度不超过0.5/200毫升；
将所述CD培养基加入至细胞培养板以对所述转染细胞进行培养。
进一步，本发明所述的制备方法，在所述细胞株单克隆化处理之后，还包括：
对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
进一步，本发明所述的制备方法，利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理的步骤具体包括：
离心收集包含所述转染细胞的培养上清；
对所述培养上清进行离子洗脱处理，以得到PLA2R蛋白溶液；
对所述PLA2R蛋白溶液进行分子筛纯化处理。
进一步，本发明所述的制备方法，在离心收集包含所述转染细胞的培养上清之后，在对所述培养上清进行离子洗脱处理之前还包括：
对所述培养上清进行超滤浓缩处理。
进一步，本发明所述的制备方法，对所述培养上清进行离子洗脱处理的步骤具体包括：
按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理，并收集在PLA2R蛋白洗脱梯度下进行洗脱处理所得到的洗脱液，以得到所述PLA2R蛋白溶液；
其中，所述洗脱梯度包括：所述PLA2R蛋白洗脱梯度和至少两个杂质洗脱梯度；所述PLA2R蛋白洗脱梯度位于所述杂质洗脱梯度之间。
进一步，本发明所述的制备方法，所述PLA2R蛋白洗脱梯度采用290至310mM的氯化钠。
进一步，本发明所述的制备方法，在按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理之前，还包括：
使用0.22μm滤膜对所述培养上清进行过滤；
在按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理之后，还包括：
使用氢氧化钠对所述PLA2R蛋白溶液进行离子交换层析柱再生。
进一步，本发明所述的制备方法，对所述PLA2R蛋白溶液进行分子筛纯化处理的步骤具体包括：
对所述PLA2R蛋白溶液进行超滤浓缩；
使用0.22μm滤膜对所述PLA2R蛋白溶液进行过滤；
对所述PLA2R蛋白溶液进行凝胶过滤柱层析纯化。
进一步，本发明所述的制备方法，在对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理之后，在利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白之前，还包括：
对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达。
进一步，本发明所述的制备方法，对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达的步骤具体包括：
将所述转染细胞接种至细胞培养摇瓶进行工程细胞培养处理；
当所述转染细胞的密度达到工程细胞最低培养密度之上时，进行补料处理；
当所述转染细胞的活性细胞密度开始下降并且存活率低于预设工程细胞培养存活率时，结束工程细胞培养处理。
进一步，本发明所述的制备方法，所述工程细胞培养处理的条件为：36.5℃～37.5℃，4.5％～5.5％二氧化碳，145～155转/每分钟旋转培养。
进一步，本发明所述的制备方法，进行所述补料处理的步骤具体包括：
按照所述转染细胞的密度增量，逐步增加每次加入的补料液总量。
进一步，本发明所述的制备方法，对所述转染细胞进行重组蛋白检测的步骤具体包括：
对所述转染细胞取上清点样并置于硝酸纤维素膜，在36.5℃～37.5℃条件下风干25～30分钟；
采用牛血清白蛋白-磷酸缓冲液对风干后的硝酸纤维素膜进行封闭；
将封闭后的所述硝酸纤维素膜与辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体稀释液在36.5℃～37.5℃条件下孵育30～60分钟；
使用缓冲液清洗掉未结合的辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体；
将所述硝酸纤维素膜与化学发光剂在室温避光条件下孵育1～2小时；
利用生物分子成像仪对所述硝酸纤维素膜进行成像处理；
根据所述成像处理的成像结果判定所述转染细胞的重组蛋白表达结果。
本发明提供的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，工艺简单、费用低廉、操作方便，能够制备出高纯度磷脂酶A2受体蛋白。利用本发明制备的磷脂酶A2受体蛋白可以定量检测血清样本中PLA2R抗体的浓度，与传统的侵入性肾病活体检测相比，对患者的伤害性非常小，属于非创伤性检测。而且通过本发明制备的磷脂酶A2受体蛋白的纯度和效价较高，提高了对特发性膜性肾病的检出率，可以为特发性膜性肾病的治疗监测和预后预测提供辅助作用，在临床上具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例一的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法的流程示意图；
图2为本发明实施例二的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法的流程示意图；
图3为本发明实施例三的梯度洗脱效果示意图；
图4为本发明实施例三的凝胶过滤柱层析纯化效果示意图；
图5为本发明实施例三的PLA2R蛋白纯度分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例一
图1为本发明实施例一的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法的流程示意图，如图1所示，本发明实施例一的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法包括：
步骤S101，根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理。
其中，PLA2R蛋白即为磷脂酶A2受体蛋白,PCR反应即为聚合酶链式反应。
例如，根据PLA2R胞外片段基因的C端(羧基)设计PCR引物的正向引物PLA2R-Primer1，并且根据PLA2R胞外片段基因的N端(氨基)设计PCR引物的反向引物PLA2R-Prime2，正向引物PLA2R-Primer1带有第一限制性酶切位点Fsel(GGCCGGCC)，反向引物PLA2R-Prime2带有第二限制性酶切位点Nhel(GCTAGC)。
其中，正向引物PLA2R-Primer1的基因序列如下：
5’-CGTGGCCGGCCGCCGCCACCATGCTGCTG-3’。
其中，反向引物PLA2R-Prime2的基因序列如下：
5’-TAAGCTAGCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTCCTTATCATCGTCGTCTTTGTAATCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGCTGCCACCGCCACCGCTGTGACTTGGTCCTTTTTCTGGC-3’。
正向引物PLA2R-Primer1和反向引物PLA2R-Prime2的基因序列根据PLA2R胞外片段基因获得。例如，利用现有的PLA2R基因，与cDNA(互补脱氧核糖核酸)模板配制PCR溶液，进行PCR扩增反应，扩增PLA2R胞外片段基因的数量，以便于提取PLA2R胞外片段基因并转入表达质粒载体。
步骤S102，将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物。
例如，分别通过第一限制性酶切位点Fsel和第二限制性酶切位点Nhel双酶切质粒载体UCOE Mu-P(一种商品化表达质粒，默克公司Merk)，以得到质粒载体。并且，分别通过第一限制性酶切位点Fsel和第二限制性酶切位点Nhel双酶切PCR扩增反应得到的PCR产物，以得到大量PLA2R胞外片段基因。之后，将PLA2R胞外片段基因与质粒载体进行连接处理，以得到连接产物，作为PLA2R胞外片段基因的表达载体。
步骤S103，利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞。
例如，选择CHO(中国仓鼠卵巢细胞)作为宿主细胞，将宿主细胞作为种子细胞进行培养。然后将作为PLA2R胞外片段基因表达载体的连接产物与CHO种子细胞进行基因表达处理，以得到携带有PLA2R胞外片段基因的转染细胞。
步骤S104，对所述转染细胞进行压力筛选处理。
例如，将步骤103得到的包含转染细胞的细胞溶液加入含抗生素的筛选培养基，杀死其中的正常细胞，例如没有被转染成功的CHO种子细胞等，而得到仅带有PLA2R胞外片段基因的转染细胞。
步骤S105，对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理。
例如，按照每孔最多一个转染细胞的密度标准，对包含转染细胞的细胞溶液进行稀释，并按照每孔最多一个转染细胞的密度标准将转染细胞加入至细胞培养板进行培养。成功携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞在孔内自行繁育，从而得到对于PLA2R胞外片段基因表达高并且表达稳定的转染细胞。
步骤S106，利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。
例如，提取单克隆化处理后的转染细胞的培养上清，利用离子柱纯化提取出其中的PLA2R蛋白溶液，然后利用分子筛纯化处理，从而得到高纯度的PLA2R蛋白，可用于血清样本中PLA2R抗体的浓度检测。得到的PLA2R蛋白可采用常规生物处理工艺进行保存等，进一步用于制备特发性膜性肾病检测试剂盒，以检测特发性膜性肾病。
实施例二
图2为本发明实施例二的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法的流程示意图，如图2所示，本发明实施例二的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法包括：
步骤S201，根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理。
步骤S202，将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物。
步骤S203，对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物。
其中，可选用常规的基因测序手段对连接产物进行基因测序，选取符合PLA2R胞外片段基因的连接产物。通过选取基因测序正确的连接产物，可保证后续处理仅针对PLA2R胞外片段基因进行表达，避免并非PLA2R胞外片段基因的其它基因混入后续实验。
步骤S204，利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞。
步骤S205，对所述转染细胞进行压力筛选处理。
步骤S206，对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
例如，在步骤S204和步骤S205中分为若干组分别进行转染处理、压力筛选处理，通过PLA2R蛋白的分子量标准对每组转染细胞取样进行重组蛋白检测和筛选，选取出符合PLA2R重组蛋白表达的一组或几组转染细胞，剔除不具有PLA2R胞外片段基因的转染细胞，使后续的细胞株单克隆化处理仅针对携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞，提高PLA2R胞外片段基因的表达效果。
步骤S207，对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理。
步骤S208，对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
例如，在步骤S207中以细胞培养板的每个孔的转染细胞作为一组，分别进行细胞株单克隆化处理，由于细胞株单克隆化处理的基因传代并不非常稳定，可能产生并不携带有PLA2R胞外片段基因的转染细胞。通过PLA2R蛋白的分子量标准对每组转染细胞取样进行重组蛋白检测和筛选，选取出符合PLA2R重组蛋白表达的转染细胞，剔除不具有PLA2R胞外片段基因的转染细胞，使后续的工程细胞大规模表达仅针对携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞，进一步提高PLA2R胞外片段基因的表达效果。
步骤S209，对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达。
其中，步骤S209具体包括：步骤S2091～步骤S2094。
步骤S2091，将所述转染细胞接种至细胞培养摇瓶进行工程细胞培养处理。
其中，在36.5℃～37.5℃温度范围内，细胞培养摇瓶内保持体积比为4.5％～5.5％的二氧化碳，以145～155转/每分钟的速度旋转细胞培养摇瓶对转染细胞进行培养。优选地，工程细胞培养处理条件为：37℃，5％二氧化碳，细胞培养摇瓶旋转速度150转/分钟。
步骤S2092，当所述转染细胞的密度达到工程细胞最低培养密度之上时，进行补料处理。
例如，设工程细胞最低培养密度为1.5E6/ml。起始时，转染细胞密度为0.1E6/ml，定期计数转染细胞的密度，例如每天计数转染细胞的密度。当转染细胞密度达到1.5E6/ml时，开始向细胞培养摇瓶补充补料液。其中，按照所述转染细胞的密度增量，逐步增加每次加入的补料液总量。例如，第5天转染细胞密度为3.4E6/ml，添加补料液24ml。第6天转染细胞密度增加为6.0E6/ml，则添加的补料液增加至36ml，以保证转染细胞有充足养分。
步骤S2093，当所述转染细胞的活性细胞密度开始下降并且存活率低于预设工程细胞培养存活率时，结束工程细胞培养处理。
例如，设工程细胞培养存活率为90％，当发现转染细胞中的活细胞密度开始下降而且存活率率低于90％时，结束培养。
通过工程细胞大规模表达可获得大量能够稳定表达PLA2R胞外片段基因的转染细胞，便于大规模生产PLA2R蛋白。
步骤S210，利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。
例如，提取工程细胞大规模表达后的转染细胞的培养上清，利用离子柱纯化提取出其中的PLA2R蛋白溶液，然后利用分子筛纯化得到高纯度的PLA2R蛋白。
本发明实施例二的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法与本发明实施例一的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法基本相同，可参考实施例一的具体原理，此处不再赘述。本发明实施例二的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法与本发明实施例一的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法的不同之处在于：
在得到连接产物后要进行基因测序，以筛选出符合PLA2R胞外片段基因的连接产物。并且在压力筛选处理和细胞株单克隆化处理后，要进行重组蛋白检测，以筛选出只携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞进行后续处理。通过上述筛选，避免在后续处理中掺杂入杂质，从而保证了制备的PLA2R蛋白的纯度在98％以上。
此外，还在细胞株单克隆化处理后加入了工程细胞大规模表达的步骤，能够满足扩大PLA2R蛋白生产的需求。
实施例三
参考图2，本发明实施例三的磷脂酶A2受体蛋白的制备方法包括：步骤S301～步骤S310。
步骤S301，根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理。
其中，步骤S301中根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物的步骤具体包括：
设计所述PCR引物的PLA2R胞外片段基因正向引物和PLA2R胞外片段基因反向引物。其中，所述PLA2R胞外片段基因正向引物设有第一限制性酶切位点Fsel，所述PLA2R胞外片段基因反向引物设有第二限制性酶切位点Nhel。
具体地，根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因正向引物：
5’-CGTGGCCGGCCGCCGCCACCATGCTGCTG-3’。
其中，所述第一限制性酶切位点Fsel为：GGCCGGCC。
并且，具体根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因反向引物：
5’-TAAGCTAGCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTCCTTATCATCGTCGTCTTTGTAATCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGCTGCCACCGCCACCGCTGTGACTTGGTCCTTTTTCTGGC-3’。
其中，所述第二限制性酶切位点Nhel为：GCTAGC。
其中，步骤S301中PCR扩增处理的步骤具体包括：
利用PCR缓冲液、所述PLA2R胞外片段基因正向引物、所述PLA2R胞外片段基因反向引物和cDNA模板配制PCR反应溶液进行PCR反应，以获取扩增的PCR产物。
具体地，具体按照如下表1的体积比配制所述PCR反应溶液：
试剂名称 体积比
PCR缓冲液 49％～51％
脱氧核糖核苷三磷酸化合物溶剂 1％～3％
PLA2R胞外片段基因正向引物 3％～5％
PLA2R胞外片段基因反向引物 3％～5％
cDNA模板 3％～5％
DNA聚合酶溶剂 1％～3％
双蒸水 40％～28％
表1
并且，具体按照如下表2的条件进行所述PCR反应：
表2。
具体地，根据表1配制PCR反应溶液后，在94℃～96℃温度条件下预变性29秒～31秒，然后，94℃～96℃条件下变性14秒～16秒、57℃～59℃条件下退火14秒～16秒、70℃～74℃条件下延伸4分～5分，29～31个循环，然后，在70℃～74℃条件下维持9分～11分，使引物延伸完全，最后在2℃～6℃条件下停止PCR反应。
优选地，按照如下表6的比例混合以进行所述PCR反应：
表6
其中，2×Phanta Max buffer缓冲液为PCR缓冲液，10mM dNPT Mix溶剂指脱氧核糖核苷三磷酸化合物溶剂，cDNA模板指互补脱氧核糖核酸模板，Phanta Max super-Fidelity DNA polymerase为DNA聚合酶溶剂，ddH2O指双蒸水。
并且，根据如下表7的条件进行所述PCR反应；
表7
其中，在配制PCR反应溶液进行PCR反应之后，还包括：
利用1％的琼脂糖凝胶检测所述PCR产物，查阅并按照DNA分子量标准，将符合PLA2R蛋白DNA分子量标准的所述PCR产物进行回收和纯化处理。例如，利用天根切胶试剂盒回收并纯化PCR产物，提升PLA2R蛋白的制备纯度。
步骤S302，将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物。
其中，步骤S302具体包括步骤S3021～步骤S3023。
步骤S3021，利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对质粒进行双酶切处理，以获取所述质粒载体。
其中，第一限制性酶切点采用Fsel：GGCCGGCC。第二限制性酶切位点采用Nhel：GCTAGC。
步骤S3021中具体按照如下表3的体积比混合以对质粒进行双酶切处理：
试剂名称 体积比
限制性内切酶缓冲液 9％～11％
第一限制性酶切位点酶 1％～3％
第二限制性酶切位点酶 1％～3％
表达质粒 1％～3％
小牛肠碱性磷酸酶 11％～13％
双蒸水 77％～67％
表3
其中，对质粒进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴1.4小时～1.6小时，使用生工PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述质粒载体。
优选地，按照如下表8的体积比混合以对质粒进行双酶切处理：
表8
对质粒进行双酶切处理的条件为：37℃水浴1.5小时，使用生工PCR产物柱式纯化试剂盒对酶切产物纯化并回收，以得到所述质粒载体。
其中，10×Cutsmart buffer指限制性内切酶缓冲液，Fsel酶指第一限制性酶切位点酶，Nhel酶指第二限制性酶切位点酶，UCOE Mu-P质粒是一种商品化表达质粒名称，CIAP指小牛肠碱性磷酸酶，ddH2O指双蒸水。
步骤S3022，利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对所述PCR产物进行双酶切处理，以获取所述PLA2R胞外片段基因。
其中，第一限制性酶切点采用Fsel：GGCCGGCC。第二限制性酶切位点采用Nhel：GCTAGC。
步骤S3022中具体按照如下表4的体积比混合以对所述PCR产物进行双酶切处理：
试剂名称 体积比
限制性内切酶缓冲液 9％～11％
第一限制性酶切位点酶 1％～3％
第二限制性酶切位点酶 1％～3％
PCR产物 29％～31％
双蒸水 60％～52％
表4
其中，对所述PCR产物进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴2.4小时～2.6小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述PLA2R胞外片段基因。
优选地，按照如下表9的体积比混合以对所述PCR产物进行双酶切处理：
表9
其中，对所述PCR产物进行双酶切处理的条件为：37℃水浴2.5小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒对酶切产物纯化并回收，以得到PLA2R胞外片段基因。
步骤S3023，将所述PLA2R胞外片段基因与所述质粒载体进行连接处理，以获取所述连接产物。
步骤S3023中具体按照如下表5的体积比混合以进行所述连接处理：
试剂名称 体积比
T4脱氧核糖核酸连接酶缓冲液 24％～26％
T4脱氧核糖核酸连接酶 12％～13％
PLA2R胞外片段基因 12％～13％
质粒载体 24％～26％
双蒸水 28％～22％
表5
其中，所述连接处理的条件为：24℃～26℃水浴4.4小时～4.6小时。
优选地，按照如下表10的体积比混合以进行所述连接处理：
表10
所述连接处理的条件为：25℃水浴4.5小时，以得到连接产物。
其中，10×T4DNA Ligase buffer指T4脱氧核糖核酸连接酶缓冲液，T4DNA Ligase指T4脱氧核糖核酸连接酶，UCOE Mu-P是一种商品化表达质粒名称，ddH2O指双蒸水。
步骤S303，对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物。
其中，可选用常规的基因测序手段对连接产物进行基因测序，选取符合PLA2R胞外片段基因的连接产物。
步骤S304，利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞。
其中，步骤S304具体包括步骤S3041～步骤S3043。
步骤S3041，培养种子细胞。
其中，所述种子细胞采用仓鼠卵巢细胞(CHO)，培养所述种子细胞的密度至1.1E6/毫升以上。种子细胞需提前培养，例如，至少在转染前一天，提前约23～25小时，将种子细胞培养传代至密度为0.5E6/ml，这样在进行转染当天，种子细胞密度增长为1.2E6/ml并且细胞活力大于95％，以得到符合转染标准的密度和活力指标。
步骤S3042，利用所述连接产物得到DNA复合物。其步骤S3042具体包括：使用第一无血清培养基稀释所述连接产物得到经过稀释的连接产物；使用第二无血清培养基稀释转染试剂得到经过稀释的转染试剂；将所述经过稀释的连接产物与所述经过稀释的转染试剂混合，以得到所述DNA复合物。
例如，使用第一无血清培养基SFM(商品化无血清培养基)将50μg步骤S302得到的连接产物，即包含有PLA2R胞外片段基因的质粒载体，稀释至750μl。同时使用第二无血清培养基SFM将150μg转染试剂PEI(聚醚酰亚胺)稀释至750μl。将稀释后的连接产物和稀释后的转染试剂PEI混合，并震荡混匀3次，每次1秒，在室温条件下静置20分钟，以得到包含PLA2R胞外片段基因的DNA复合物。
步骤S3043，将所述DNA复合物加入所述种子细胞进行转染，以得到所述转染细胞。
其中，将所述DNA复合物加入所述种子细胞进行转染，例如，将DNA复合物逐滴加入经稀释得到的包含种子细胞的细胞液中，在37℃条件下过夜培养，细胞密度可以达到1.5/ml，能够得到符合后续实验的转染细胞。
步骤S305，对所述转染细胞进行压力筛选处理。
其中，步骤S305具体包括：步骤S3051～步骤S3052。
步骤S3051，将所述转染细胞加入至含有抗生素的筛选培养基；
步骤S3052，当所述转染细胞的存活率达到预设存活阈值以上时，对所述转染细胞进行恢复培养。
例如，将转染细胞换液至含有20μg/ml puro(嘌呤霉素)的筛选培养基，传代密度为0.5E6/ml，静置培养。当转染细胞的存活率达到30％以上时，即达到预设存活率阈值以上，将转染细胞转移至摇瓶进行恢复培养。当存活率达到90％以上时，冻存3支转染细胞以保种，其中保种的转染细胞需达到密度1E7/ml。之后根据需要扩大若干克隆pool进行补液培养，以获取重组后的PLA2R蛋白。
步骤S306，对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
例如，在步骤S304和步骤S305中分为若干组分别进行转染处理、压力筛选处理，通过PLA2R蛋白的分子量标准对每组转染细胞取样进行重组蛋白检测和筛选，选取出符合PLA2R重组蛋白表达的一组或几组转染细胞，剔除不具有PLA2R胞外片段基因的转染细胞，使后续的细胞株单克隆化处理仅针对携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞，提高PLA2R胞外片段基因的表达效果。
步骤S307，对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理。
其中，步骤S307具体包括:按照细胞培养板中每孔一个细胞的标准，将所述转染细胞加入至所述细胞培养板中进行培养。
具体地，步骤S307包括：步骤S3071～步骤S3072。
步骤S3071，稀释包含所述转染细胞的细胞液，并将所述细胞液加入至含谷氨酰胺的CD培养基(成分固定培养基)；其中，所述转染细胞的密度不超过0.5/200毫升。
步骤S3072，将所述CD培养基加入至细胞培养板以对所述转染细胞进行培养。
例如，将步骤S402得到的转染细胞的细胞液以10倍梯度进行稀释，稀释后转染细胞密度为1.1×103/ml。将1.8ml稀释后的转染细胞加入400ml含Glu(谷氨酰胺)的CDForiti培养基(一种商品化培养基，赛默飞世而公司Thermo Fisher Scientific)中，混合均匀。取200ml包含有转染细胞的CD Foriti培养基溶液，加入到400细胞培养板(96孔板)的孔内，按照每个孔一个细胞，37℃条件下静置培养。
步骤S308，对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
例如，在步骤S307中以细胞培养板的每个孔的转染细胞作为一组，分别进行细胞株单克隆化处理，由于细胞株单克隆化处理的基因传代并不非常稳定，可能产生并不携带有PLA2R胞外片段基因的转染细胞。通过PLA2R蛋白的分子量标准对每组转染细胞取样进行重组蛋白检测和筛选，选取出符合PLA2R重组蛋白表达的转染细胞，剔除不具有PLA2R胞外片段基因的转染细胞，使后续的工程细胞大规模表达仅针对携带PLA2R胞外片段基因的转染细胞，进一步提高PLA2R胞外片段基因的表达效果。
步骤S309，对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达。
其中，步骤S309具体包括：步骤S3091～步骤S3094。
步骤S3091，将所述转染细胞接种至细胞培养摇瓶进行工程细胞培养处理。
其中，在36.5℃～37.5℃温度范围内，细胞培养摇瓶内保持体积比为4.5％～5.5％的二氧化碳，以145～155转/每分钟的速度旋转细胞培养摇瓶对转染细胞进行培养。优选地，工程细胞培养处理条件为：37℃，5％二氧化碳，细胞培养摇瓶旋转速度150转/分钟。
步骤S3092，当所述转染细胞的密度达到工程细胞最低培养密度之上时，进行补料处理。
例如，设工程细胞最低培养密度为1.5E6/ml。起始时，转染细胞密度为0.1E6/ml，定期计数转染细胞的密度，例如每天计数转染细胞的密度。当转染细胞密度达到1.5E6/ml时，开始向细胞培养摇瓶补充补料液。其中，按照所述转染细胞的密度增量，逐步增加每次加入的补料液总量。例如，第5天转染细胞密度为3.4E6/ml，添加补料液24ml。第6天转染细胞密度增加为6.0E6/ml，则添加的补料液增加至36ml，以保证转染细胞有充足养分。
步骤S3093，当所述转染细胞的活性细胞密度开始下降并且存活率低于预设工程细胞培养存活率时，结束工程细胞培养处理。
例如，设工程细胞培养存活率为90％，当发现转染细胞中的活细胞密度开始下降而且存活率率低于90％时，结束培养。
通过工程细胞大规模表达可获得大量能够稳定表达PLA2R胞外片段基因的转染细胞，便于大规模生产PLA2R蛋白。
步骤S310，利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。
其中，步骤310具体包括：步骤3101～步骤3104。
步骤3101，离心收集包含所述转染细胞的培养上清。例如，提取工程细胞大规模表达后转染细胞的培养液上清。
步骤3102，对所述培养上清进行超滤浓缩处理。
例如，将收集提取的培养上清超滤更换缓冲液至20mM PBS磷酸缓冲液(pH 7.0)并浓缩10～20倍，以用于Sourse 30Q阴离子交换柱层析纯化，其测电导设为2.3ms/cm。
步骤3103，对所述培养上清进行离子洗脱处理，以得到PLA2R蛋白溶液。步骤3103具体包括：步骤31031～步骤31033。
步骤31031，使用0.22μm滤膜对所述培养上清进行过滤。
步骤31032，按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理，并收集在PLA2R蛋白洗脱梯度下进行洗脱处理所得到的洗脱液，以得到所述PLA2R蛋白溶液。其中，所述洗脱梯度包括：所述PLA2R蛋白洗脱梯度和至少两个杂质洗脱梯度。所述PLA2R蛋白洗脱梯度位于所述杂质洗脱梯度之间。PLA2R蛋白洗脱梯度优选采用290至310mM的氯化钠。
例如，采用sourse 30Q(一种商品化阴离子交换填料，GE公司)离子柱对蛋白溶液进行洗脱，以分别含50mM、200mM、300mM和500mM氯化钠的20mMPBS磷酸缓冲液(pH 7.0)进行梯度洗脱，根据紫外280nm吸收峰收集洗脱液。其中，50mM、200mM、300mM和500mM的氯化钠浓度为洗脱梯度，300mM的氯化钠浓度为PLA2R蛋白洗脱梯度，剩余的50mM、200mM和500mM的氯化钠浓度为杂质洗脱梯度。
图3为本发明实施例三的梯度洗脱效果示意图，如图3所示，从左向右依次顺序排布9条泳道(lane)的梯度洗脱处理效果：
Lane 1：培养上清(超滤浓缩后的培养上清液)；
Lane 2：离子交换流穿液；
Lane 3：50mM NaCl洗脱液；
Lane 4：200mM NaCl洗脱液；
Lane 5：PLA2R标准品；
Lane 6：蛋白分子量标准；
Lane 7：300mM NaCl洗脱液1；
Lane 8：300mM NaCl洗脱液2；
Lane 9：500mM NaCl洗脱液。
可见，Lane 1的培养上清中除了含有PLA2R蛋白，还含有其他蛋白杂质。在50mM、200mM和500mM NaCl洗脱液的洗脱处理下，PLA2R蛋白以外的其他蛋白被洗脱掉，在300mMNaCl洗脱液的洗脱处理下，PLA2R蛋白被洗脱掉，因此收集300mM NaCl洗脱液的洗脱处理后的培养上清，就得到了PLA2R蛋白溶液。因此将300mM氯化钠浓度作为PLA2R蛋白洗脱梯度，其他氯化钠浓度作为杂质洗脱梯度。PLA2R蛋白洗脱梯度可以洗脱符合PLA2R蛋白分子量的蛋白，从而得到PLA2R蛋白溶液。在PLA2R蛋白洗脱梯度之前的杂质洗脱梯度可以洗脱小于PLA2R蛋白分子量的杂质蛋白，在PLA2R蛋白洗脱梯度之后的杂质洗脱梯度可以洗脱大于PLA2R蛋白分子量的杂质蛋白，从而起到分离PLA2R蛋白的作用。
步骤31033，使用氢氧化钠对所述PLA2R蛋白溶液进行离子交换层析柱再生，使PLA2R蛋白可以重复使用。
例如，同样采用sourse 30Q离子柱对洗脱处理得到的蛋白溶液进行再次洗脱。其中，洗脱液根据如下条件配制：
平衡缓冲液：20mM PBS，PH7.0；
洗脱缓冲液：20mM PBS；
NaOH溶液：0.5M，PH7.0。
步骤3104，对所述PLA2R蛋白溶液进行分子筛纯化处理。
其中，步骤S3104具体包括：步骤S31041～步骤S31043。
步骤S31041，对所述PLA2R蛋白溶液进行超滤浓缩；
步骤S31042，使用0.22μm滤膜对所述PLA2R蛋白溶液进行过滤；
步骤S31043，对所述PLA2R蛋白溶液进行凝胶过滤柱层析纯化。
例如，以S200HR柱(GE公司的商品化凝胶过滤柱)进行凝胶过滤柱层析，缓冲体系为20mM PBS(pH 7.0)，根据紫外280nm吸收峰收集洗脱液。洗脱时的上流速度设为：1.3ml/min。
图4为本发明实施例三的凝胶过滤柱层析纯化效果示意图，如图4所示，从左向右依次顺序排布3条泳道(lane)的凝胶过滤柱层析纯化效果：
Lane 1：蛋白分子量标准；
Lane 2：PLA2R蛋白(氧化型)；
Lane 3：PLA2R蛋白(还原型)。
可见，主带为PLA2R蛋白，未见其他蛋白条带，在氧化型电泳时，也未见PLA2R蛋白聚合体存在，表明纯化的PLA2R蛋白纯度极高。
图5为本发明实施例三的PLA2R蛋白纯度分析示意图，如图5所示，在PBS(pH 7.0)缓冲液体系下，在安捷伦HPLC1200仪器上，以TSKG3000SW凝胶过滤HPLC层析柱，分析纯化的PLA2R蛋白的纯度，结果表明，PLA2R蛋白经凝胶过滤柱层析纯化后，纯度为98％以上，除PLA2R蛋白主峰外，基本不见杂质峰，这个结果与图4中的SDS-PAGE的分析结果一致。
其中，步骤S306和步骤S308中对所述转染细胞进行重组蛋白检测的步骤具体包括：
步骤S401，对所述转染细胞的培养液进行离心并取上清点样并置于硝酸纤维素膜(PVDF膜，Merck Miliproe)，例如，将培养液300g离心5分钟，取2μl上清点样于硝酸纤维素膜，在36.5℃～37.5℃条件下风干25～30分钟。
步骤S402，采用3％BSA-PBS(牛血清白蛋白-磷酸缓冲液)对风干后的硝酸纤维素膜进行封闭。
步骤S403，将封闭后的所述硝酸纤维素膜与辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体稀释液在36.5℃～37.5℃条件下孵育30～60分钟。
步骤S404，使用缓冲液清洗掉未结合的辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体。
步骤S405，将所述硝酸纤维素膜与化学发光剂(Immobilon WesternChemiluminescent HRP Substrate，Millipore公司，货号WBKLS0500)在室温避光条件下孵育1～2小时。
步骤S406，利用生物分子成像仪(GE公司，型号Las400mini)对所述硝酸纤维素膜进行成像处理。
步骤S407，根据所述成像处理的成像结果判定所述转染细胞的重组蛋白表达结果。例如，根据成像有/无和强/弱判定重组PLA2R蛋白的多或少。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。

Claims (30)

1.一种磷脂酶A2受体蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物，并且进行PCR扩增处理；
将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体，以得到连接产物；
利用所述连接产物进行转染处理，以得到转染细胞；
对所述转染细胞进行压力筛选处理；
对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理；
利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述根据PLA2R胞外片段基因设计PCR引物的步骤具体包括：
设计所述PCR引物的PLA2R胞外片段基因正向引物和PLA2R胞外片段基因反向引物；
其中，所述PLA2R胞外片段基因正向引物设有第一限制性酶切位点，所述PLA2R胞外片段基因反向引物设有第二限制性酶切位点。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因正向引物：
5’-CGTGGCCGGCCGCCGCCACCATGCTGCTG-3’；
其中，所述第一限制性酶切位点为：GGCCGGCC；
并且，根据如下基因序列设计所述PLA2R胞外片段基因反向引物：
5’-TAAGCTAGCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTCCTTATCATCGTCGTCTTTGTAATCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGCTGCCACCGCCACCGCTGTGACTTGGTCCTTTTTCTGGC-3’；
其中，所述第二限制性酶切位点为：GCTAGC。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增处理的步骤具体包括：
利用PCR缓冲液、所述PLA2R胞外片段基因正向引物、所述PLA2R胞外片段基因反向引物和cDNA模板配制PCR反应溶液进行PCR反应，以获取扩增的PCR产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
具体按照如下表1的体积比配制所述PCR反应溶液：
试剂名称 体积比 PCR缓冲液 49％～51％ 脱氧核糖核苷三磷酸化合物溶剂 1％～3％ PLA2R胞外片段基因正向引物 3％～5％ PLA2R胞外片段基因反向引物 3％～5％ cDNA模板 3％～5％ DNA聚合酶溶剂 1％～3％ 双蒸水 40％～28％
表1
并且，具体按照如下表2的条件进行所述PCR反应：
表2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在配制PCR反应溶液进行PCR反应之后，还包括：
利用琼脂糖凝胶检测所述PCR产物，将符合DNA分子量标准的所述PCR产物进行回收和纯化处理。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体的步骤具体包括：
利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对质粒进行双酶切处理，以获取所述质粒载体；
利用所述第一限制性酶切点和所述第二限制性酶切点对所述PCR产物进行双酶切处理，以获取所述PLA2R胞外片段基因；
将所述PLA2R胞外片段基因与所述质粒载体进行连接处理，以获取所述连接产物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体按照如下表3的体积比混合以对质粒进行双酶切处理：
试剂名称 体积比 限制性内切酶缓冲液 9％～11％ 第一限制性酶切位点酶 1％～3％ 第二限制性酶切位点酶 1％～3％ 表达质粒 1％～3％ 小牛肠碱性磷酸酶 11％～13％ 双蒸水 77％～67％
表3
其中，对质粒进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴1.4小时～1.6小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述质粒载体。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体按照如下表4的体积比混合以对所述PCR产物进行双酶切处理：
试剂名称 体积比 限制性内切酶缓冲液 9％～11％ 第一限制性酶切位点酶 1％～3％ 第二限制性酶切位点酶 1％～3％ PCR产物 29％～31％ 双蒸水 60％～52％
表4
其中，对所述PCR产物进行双酶切处理的条件为：36℃～38℃水浴2.4小时～2.6小时，使用PCR产物柱式纯化试剂盒回收所述PLA2R胞外片段基因。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体按照如下表5的体积比混合以进行所述连接处理：
试剂名称 体积比 T4脱氧核糖核酸连接酶缓冲液 24％～26％ T4脱氧核糖核酸连接酶 12％～13％ PLA2R胞外片段基因 12％～13％ 质粒载体 24％～26％ 双蒸水 28％～22％
表5
其中，所述连接处理的条件为：24℃～26℃水浴4.4小时～4.6小时。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将所述PLA2R胞外片段基因转入质粒载体之后，在利用所述连接产物进行转染处理之前，还包括：
对所述连接产物进行基因测序以验证克隆结果，并选取基因测序正确的所述连接产物。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述利用所述连接产物进行转染处理的步骤具体包括：
培养种子细胞；
利用所述连接产物得到DNA复合物；
将所述DNA复合物加入所述种子细胞进行转染，以得到所述转染细胞。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述种子细胞采用仓鼠卵巢细胞，培养所述种子细胞的密度至1.1E6/毫升以上。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，利用所述连接产物得到DNA复合物的步骤具体包括：
使用第一无血清培养基稀释所述连接产物得到经过稀释的连接产物；
使用第二无血清培养基稀释转染试剂得到经过稀释的转染试剂；
将所述经过稀释的连接产物与所述经过稀释的转染试剂混合，以得到所述DNA复合物。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述对所述转染细胞进行压力筛选处理的步骤具体包括：
将所述转染细胞加入至含有抗生素的筛选培养基；
当所述转染细胞的存活率达到预设存活阈值以上时，对所述转染细胞进行恢复培养。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述压力筛选处理之后，在所述细胞株单克隆化处理之前，还包括：
对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理的步骤具体包括：
按照细胞培养板中每孔一个细胞的标准，将所述转染细胞加入至所述细胞培养板中进行培养。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，将所述转染细胞加入至所述细胞培养板中进行培养的步骤具体包括：
稀释包含所述转染细胞的细胞液，并将所述细胞液加入至含谷氨酰胺的CD培养基；其中，所述转染细胞的密度不超过0.5/200毫升；
将所述CD培养基加入至细胞培养板以对所述转染细胞进行培养。
19.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述细胞株单克隆化处理之后，还包括：
对所述转染细胞进行重组蛋白检测，并筛选出符合重组蛋白表达的所述转染细胞。
20.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白，并进行纯化处理的步骤具体包括：
离心收集包含所述转染细胞的培养上清；
对所述培养上清进行离子洗脱处理，以得到PLA2R蛋白溶液；
对所述PLA2R蛋白溶液进行分子筛纯化处理。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在离心收集包含所述转染细胞的培养上清之后，在对所述培养上清进行离子洗脱处理之前还包括：
对所述培养上清进行超滤浓缩处理。
22.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，对所述培养上清进行离子洗脱处理的步骤具体包括：
按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理，并收集在PLA2R蛋白洗脱梯度下进行洗脱处理所得到的洗脱液，以得到所述PLA2R蛋白溶液；
其中，所述洗脱梯度包括：所述PLA2R蛋白洗脱梯度和至少两个杂质洗脱梯度；所述PLA2R蛋白洗脱梯度位于所述杂质洗脱梯度之间。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述PLA2R蛋白洗脱梯度采用290至310mM的氯化钠。
24.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，
在按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理之前，还包括：
使用0.22μm滤膜对所述培养上清进行过滤；
在按照至少三个洗脱梯度对所述培养上清进行洗脱处理之后，还包括：
使用氢氧化钠对所述PLA2R蛋白溶液进行离子交换层析柱再生。
25.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，对所述PLA2R蛋白溶液进行分子筛纯化处理的步骤具体包括：
对所述PLA2R蛋白溶液进行超滤浓缩；
使用0.22μm滤膜对所述PLA2R蛋白溶液进行过滤；
对所述PLA2R蛋白溶液进行凝胶过滤柱层析纯化。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的制备方法，其特征在于，在对所述转染细胞进行细胞株单克隆化处理之后，在利用所述转染细胞提取PLA2R蛋白之前，还包括：
对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，对所述转染细胞进行工程细胞大规模表达的步骤具体包括：
将所述转染细胞接种至细胞培养摇瓶进行工程细胞培养处理；
当所述转染细胞的密度达到工程细胞最低培养密度之上时，进行补料处理；
当所述转染细胞的活性细胞密度开始下降并且存活率低于预设工程细胞培养存活率时，结束工程细胞培养处理。
28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述工程细胞培养处理的条件为：36.5℃～37.5℃，4.5％～5.5％二氧化碳，145～155转/每分钟旋转培养。
29.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，进行所述补料处理的步骤具体包括：
按照所述转染细胞的密度增量，逐步增加每次加入的补料液总量。
30.根据权利要求16或19所述的制备方法，其特征在于，对所述转染细胞进行重组蛋白检测的步骤具体包括：
对所述转染细胞取上清点样并置于硝酸纤维素膜，在36.5℃～37.5℃条件下风干25～30分钟；
采用牛血清白蛋白-磷酸缓冲液对风干后的硝酸纤维素膜进行封闭；
将封闭后的所述硝酸纤维素膜与辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体稀释液在36.5℃～37.5℃条件下孵育30～60分钟；
使用缓冲液清洗掉未结合的辣根过氧化物酶标记的抗FLAG抗体；
将所述硝酸纤维素膜与化学发光剂在室温避光条件下孵育1～2小时；
利用生物分子成像仪对所述硝酸纤维素膜进行成像处理；
根据所述成像处理的成像结果判定所述转染细胞的重组蛋白表达结果。
CN201810728337.2A 2018-07-05 2018-07-05 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法 Pending CN108948181A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810728337.2A CN108948181A (zh) 2018-07-05 2018-07-05 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810728337.2A CN108948181A (zh) 2018-07-05 2018-07-05 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108948181A true CN108948181A (zh) 2018-12-07

Family

ID=64485757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810728337.2A Pending CN108948181A (zh) 2018-07-05 2018-07-05 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108948181A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195154A (zh) * 2019-07-08 2021-01-08 江苏汇智生物科技有限公司 一种基因改造表达改造型pla2r受体的细胞及其应用
CN113481227A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 张家港博泽利斯生物技术有限公司 Pla2r重组蛋白的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105647970A (zh) * 2016-02-22 2016-06-08 河北利同康生物科技有限公司 前列腺癌特异性pap-gm-csf-il-6基因重组融合蛋白及其制备方法
CN106432508A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种pla2r‑thsd7a融合蛋白及其应用和试剂盒
EP3152231A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-12 The University Of Manchester Peptides, and methods and apparatus utilising same
CN107663235A (zh) * 2017-08-11 2018-02-06 南京诺唯赞医疗科技有限公司 特发性膜性肾病相关的pla2r重组蛋白及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3152231A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-12 The University Of Manchester Peptides, and methods and apparatus utilising same
CN105647970A (zh) * 2016-02-22 2016-06-08 河北利同康生物科技有限公司 前列腺癌特异性pap-gm-csf-il-6基因重组融合蛋白及其制备方法
CN106432508A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种pla2r‑thsd7a融合蛋白及其应用和试剂盒
CN107663235A (zh) * 2017-08-11 2018-02-06 南京诺唯赞医疗科技有限公司 特发性膜性肾病相关的pla2r重组蛋白及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIN LI等: "Anti-PLA2R Antibodies in Chinese Patients with Membranous Nephropathy", 《MEDICAL SCIENCE MONITOR》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195154A (zh) * 2019-07-08 2021-01-08 江苏汇智生物科技有限公司 一种基因改造表达改造型pla2r受体的细胞及其应用
CN112195154B (zh) * 2019-07-08 2024-03-29 江苏汇智生物科技有限公司 一种基因改造表达改造型pla2r受体的细胞及其应用
CN113481227A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 张家港博泽利斯生物技术有限公司 Pla2r重组蛋白的制备方法
CN113481227B (zh) * 2021-07-30 2022-12-30 张家港博泽利斯生物技术有限公司 Pla2r重组蛋白的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108929874B (zh) 一种特异性结合高表达pdl1蛋白的细胞的核酸适配体及其应用
Wilkie et al. Mitochondria and the yeast cell surface: implications for carcinogenesis
CN103076453A (zh) P16免疫细胞化学试剂盒及其制备用多肽序列
CN108948181A (zh) 一种磷脂酶a2受体蛋白的制备方法
CN105255895B (zh) 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统
CN114276445B (zh) 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法
CN104558172A (zh) 一种针对β淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体及其应用
CN106132986B (zh) TRAIL穿膜肽样突变体MuR5、制备方法及应用
US20230091895A1 (en) Nanobody for pcsk9 and application thereof
CN113004403A (zh) 过敏原特异性IgE抗体复合质控品的制备方法及过敏原特异性IgE抗体复合质控品
CN114044822A (zh) 血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区、抗体及运用
CN112961865A (zh) 一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用
CN103305521B (zh) 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用
Yao et al. Biochemical characteristics of a diffusible factor that induces gametophyte to sporophyte switching in the brown alga Ectocarpus
CN109324043A (zh) 一种用于肾病检测的试剂盒、及其制备和使用方法
JPH06225766A (ja) 発現クローニング法
CN110161253A (zh) 一种免疫活性肽的筛选方法
CN106084042B (zh) 一种全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗体及其应用
CN113717279B (zh) m6A重组兔单克隆抗体及制备方法
Betsholtz et al. The glomerular transcriptome and proteome
JP6795214B2 (ja) ステロイドホルモン膜受容体の精製方法
CN115074365B (zh) 靶向GATM基因的sgRNA及其应用
Schofield et al. Sequencing and affinity determination of antigen-specific B lymphocytes from peripheral blood
CN116751792B (zh) 一种转录因子下游基因筛选方法
CN106754976A (zh) 一种新的柔嫩艾美尔球虫tert相关蛋白基因otu

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181207

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication