CN103305521B - 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用 - Google Patents

一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103305521B
CN103305521B CN201210057620.XA CN201210057620A CN103305521B CN 103305521 B CN103305521 B CN 103305521B CN 201210057620 A CN201210057620 A CN 201210057620A CN 103305521 B CN103305521 B CN 103305521B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
sequence
stomach
cancer cell
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210057620.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103305521A (zh
Inventor
刘杰
张骏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huashan Hospital of Fudan University
Original Assignee
Huashan Hospital of Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huashan Hospital of Fudan University filed Critical Huashan Hospital of Fudan University
Priority to CN201210057620.XA priority Critical patent/CN103305521B/zh
Publication of CN103305521A publication Critical patent/CN103305521A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103305521B publication Critical patent/CN103305521B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用。本发明筛选与胃癌细胞株HGC27特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合HGC27的特征序列TTGGTT。本发明所述的特征序列是核酸适配体与HGC27特异性结合的基础，可用于药物设计、制备药物或其他制品，所述的含有该特征序列的核酸适配体可作为抗胃癌的分子探针或靶点，用于设计、制备抗胃癌的药物或其他制品。

Description

一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用
技术领域
本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用。
背景技术
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，也是最常见的消化道恶性肿瘤；据统计，胃癌在我国的患病率位居各类肿瘤的第二位，在所有胃的恶性肿瘤中，腺癌占到95％。临床上大多数胃癌病人确诊时往往已经处于晚期，其5年生存率不超过10％，因此早期诊断是提高胃癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。
目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段，其特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment，SELEX)技术，SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptideaptamer)，核酸适配体的优势相当明显，例如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。
核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都可以用核酸适配体替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传感器——RiboReporterTM即可以将检测到的蛋白信号直接转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方面，最典型的例子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药物Macugen，其为抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被用于治疗湿性老年性黄斑变性(wetAMD)。另一个核酸适配体药物的例子是由Aptamera公司研制的AGR0100。临床前试验表明，AGRO100对多种癌细胞均有抑制作用。
目前国际上大部分从事核酸适配体研究的科学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少关注中国人的常见疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本发明优先考虑核酸适配体应用于上述严重威胁我国人民健康的重大疾病，开发针对胃癌细胞的核酸适配体作为特征性标志物，为胃癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种胃癌细胞的核酸适配体的序列，尤其涉及一种胃癌细胞株HGC27的核酸适配体中具有特异结合胃癌细胞株HGC27的序列(本发明中命名为HGCAp2)。
本发明中，所述的胃癌细胞的核酸适配体(序列1)中含有特异结合HGC27的特征序列，所述的特征序列为TTGGTT。
本发明中，所述的胃癌细胞选自胃癌细胞株HGC27。
本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，根据对该序列分析，设计抗胃癌的药物并进一步制备抗胃癌的药物或制品。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
利用核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术，以胃癌细胞株HGC27(购自上海细胞库)为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-1(购自上海细胞库)为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与HGC27特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和Aptamer_R(5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)为测序引物进行测序反应，上测序仪测序；根据测序结果分析特征序列。
本发明中，所述的核酸适配体序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列；
本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列；
本发明所述的特征序列是核酸适配体与HGC27特异性结合的基础，可用于药物设计、制备药物或其他制品，所述的含有该特征序列的核酸适配体可作为抗胃癌的分子探针或靶点，用于设计、制备抗胃癌的药物或其他制品。
附图说明
图1是核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术的一般流程。
具体实施方式
实施例1：核酸适配体筛选(一轮)
首轮寡聚DNA文库序列：5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’
富集所用引物：
Aptamer_L：5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’
Aptamer_R：5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’
将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥。用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgCl2，2mg/mLBSA，0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库，取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。
反筛：将250pmol的文库吸入GES-1生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中，用结合缓冲液补足到1mL。4℃摇床振荡1h。取上清液。
正筛：将反筛上清液加入HGC27生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中中，4℃摇床振荡1h。弃上清液。用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mMMgCl2)洗涤HGC27细胞三遍。用细胞刮刮下HGC27细胞，用1mL洗涤缓冲液将HGC27细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变冷后，10000rpm离心5min。上清转移到一干净的EP管中。
富集：配置PCR体系(总体积1000ul)：H2O740ul，10×PCR缓冲液100ul，dNTP80ul，引物混合物25ul(H2O：100uMAptamer_L：100uMAptamer_R＝4∶0.5∶0.5)，DNA模板(正筛上清)50ul，TaqHS酶5ul。
按如下条件，在PCR仪上扩增：94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退火20s，72℃延伸20s，20个循环，72℃延伸4min，4℃保温＜1h。
纯化：纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ulGE的StreptavidinSepharose后PBS洗两遍，加入PCR产物，摇床振荡20min，放出液体，PBS洗两遍后，加0.5mLNaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱盐柱，待液体从脱盐柱几乎流尽时加1mLMilliQ水洗脱，同时开始接洗脱液1mL，该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库，可进行下一轮筛选。
实施例2：核酸适配体TA克隆
在微量离心管中配制下列溶液，全量为5ul：pMD19-TVector1ul，适配体PCR产物1ul，dH2O3ul。加入5ul的SolutionI。16℃反应30分钟。全量(10ul)加入至100ulDH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入890ulLB培养基，37℃振荡培养60分钟。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
实施例3：核酸适配体克隆的菌落PCR与测序
pMD19-T菌落PCR和测序引物：
RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′
M13(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′
用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落加入到4mlLB(Amp50ng/L)液体培养基内，180rpm，37℃摇菌过夜(＜16h).取1ul菌液作PCR模板，进行PCR扩增。以水作为阴性对照。
配置PCR体系：菌液1ul，引物RV-M(10uM)0.5ul，引物M13(-47)0.5ul，2×TaqMix7.5ul，水5.5ul(总体系15ul)。按如下条件，在PCR仪上扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共33个循环；72℃总延伸10min。
反应结束后取3-6ul菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，140V电泳20min。若出现明亮的目的大小条带而阴性对照没有条带，说明该菌液为阳性克隆。
随后行质粒提取：取4ml过夜培养的新鲜菌液，收集菌体，按照Omega的质粒提取试剂盒操作说明进行质粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop对提取的质粒进行浓度和纯度测定。
测序反应：BDTv3.10.5ul，质粒100ng，引物M13(-47)0.5ul，加水至5ul。96℃加热预变性1min后，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，33个循环，4℃保温。反应结束后将5ul测序产物+1.25ulEDTA(125mM，pH8.0)+15ul无水乙醇封好，震荡4次，室温放置15min，立即3860rpm，室温(25℃)离心40min后立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。加60ul70％乙醇，(不需震荡)封好。随后室温下3860rpm，离心15min。立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。避光室温干燥15min，加10ulHi-Di，封好盖。95℃变性4min，立刻冰上静置4min，短暂离心，上3730xl测序仪。测序结果显示，19个克隆中都存在同一个特征序列TTGGTT；结果证实，本发明获得了具有特异结合HGC27核心抗原的特征序列，该段特征序列为TTGGTT。

Claims (3)

1.一种胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如序列1所示。
2.权利要求1的胃癌细胞的核酸适配体在用于制备抗胃癌的药物或制剂中的用途。
3.权利要求1的胃癌细胞的核酸适配体在制备检测胃癌的分子探针中的用途。
CN201210057620.XA 2012-03-06 2012-03-06 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用 Active CN103305521B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210057620.XA CN103305521B (zh) 2012-03-06 2012-03-06 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210057620.XA CN103305521B (zh) 2012-03-06 2012-03-06 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103305521A CN103305521A (zh) 2013-09-18
CN103305521B true CN103305521B (zh) 2016-06-08

Family

ID=49131242

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210057620.XA Active CN103305521B (zh) 2012-03-06 2012-03-06 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103305521B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105891478A (zh) * 2015-11-29 2016-08-24 卢美珍 一种用于胃病检测的试剂盒
CN105385691B (zh) * 2015-12-28 2019-02-19 湖南大学 用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101538570A (zh) * 2009-04-28 2009-09-23 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN101914542A (zh) * 2009-04-28 2010-12-15 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的一种核酸适体及其筛选方法
CN101914543A (zh) * 2009-04-28 2010-12-15 中国科学院化学研究所 一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN101955939A (zh) * 2009-04-28 2011-01-26 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101538570A (zh) * 2009-04-28 2009-09-23 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN101914542A (zh) * 2009-04-28 2010-12-15 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的一种核酸适体及其筛选方法
CN101914543A (zh) * 2009-04-28 2010-12-15 中国科学院化学研究所 一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法
CN101955939A (zh) * 2009-04-28 2011-01-26 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A cell-based single-stranded DNA aptamer specifically targetsgastric cancer;Xiaojiao Zhang et al.;《The International Journal of Biochemistry & Cell Biology》;20131024;第46卷;1-8 *
SELEX法体外筛选胃癌细胞适配子方法的建立;李真真 等;《生物技术》;20090615;第19卷(第3期);42-46 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103305521A (zh) 2013-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102839181B (zh) 一种胃癌细胞的核酸适配体序列及用途
Wu et al. DNA aptamer selected against pancreatic ductal adenocarcinoma for in vivo imaging and clinical tissue recognition
Liu et al. An aptamer-based probe for molecular subtyping of breast cancer
JP5603933B2 (ja) 膵臓癌細胞または組織に特異的に結合できる核酸アプタマー及びその用途
CN103205431B (zh) 一种核酸适配体及其衍生物、核酸适配体的筛选方法及在检测人胆管癌细胞株中的应用
CN104593372B (zh) 一种检测胰腺导管癌的核酸适配体、试剂盒及方法
CN103374573B (zh) 肝癌细胞核酸适配体序列及其用途
Almasi et al. Development of a single stranded DNA aptamer as a molecular probe for lncap cells using cell-selex
CN108753780A (zh) 一种重组小rna的生产方法及应用
CN113481204B (zh) 一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用
CN103374572B (zh) 一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及应用
CN109337909A (zh) 一种检测肝癌耐药细胞株的核酸适体及其应用
CN107190052B (zh) Loc101928926基因的用途
CN103911379B (zh) 核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用
CN103305521B (zh) 一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用
CN106929577A (zh) 一种与肺腺癌相关的lncRNA生物标志物
CN107190005B (zh) lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用
CN102226185A (zh) 靶向肝细胞的rna适配子及其核苷酸序列
CN106032534A (zh) 一种与人非小细胞肺癌细胞特异结合的核糖核酸适配体及其筛选方法
CN108034655A (zh) 一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用
CN102876681B (zh) 一种用于靶向药物载体的核酸适体
CN106282194B (zh) 人乳腺癌细胞株特异性核酸适配体及其在制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用
CN106520776B (zh) 一种乳腺癌筛查试剂盒
CN105457041B (zh) miR-26a在非小细胞肺癌中的应用
CN108148836A (zh) 一种肝再生相关长链非编码rna及其抑制剂和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant