CN108753780A

CN108753780A - 一种重组小rna的生产方法及应用

Info

Publication number: CN108753780A
Application number: CN201810595579.9A
Authority: CN
Inventors: 骞爱荣; 田野; 程群燕; 喻译锋; 罗晓庆; 裴佳伟; 王雪; 杨超飞
Original assignee: Xi'an Rong Qing Chang Biotechnology Co Ltd; Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Xi'an Rong Qing Chang Biotechnology Co Ltd; Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-06-11
Also published as: CN108753780B

Abstract

本发明公开了一种重组小RNA的生产方法，该方法以tRNA为支架，嵌合miRNA前体，在大肠杆菌中表达目标小RNA。另外，本发明还公开了采用该方法生产的重组小RNA的应用。本发明设计制备的重组小RNA为通过生物工程技术获得，具有设备简便、生产快速、产量高、成本低、功能性好等优势；经多种技术手段检测表明，本发明的方法能方便快捷地制备多种miRNA/siRNA/RNA适配体，生产制备的重组小RNA满足科学研究及药物研发的需求。

Description

一种重组小RNA的生产方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及医学技术领域，具体涉及一种重组小RNA的生产方法及应用。

背景技术

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)在生物学相关领域的研究和疾病治疗中有着广阔的应用前景。在过去的二十年中，小ncRNA作为基因调控的关键表观遗传因素已经得到了充分的证实。这些小ncRNA主要是通过RNAi途径参与沉默复合物(RISC)的形成，从而诱导基因的沉默。对ncRNA功能的研究，催生了新型治疗方法，即RNA疗法的诞生。例如，重建抑癌miRNA水平可显著减慢肿瘤疾病进程。

然而，ncRNA的功能、药理活性及治疗学研究依赖于相关RNA原料的获取。目前RNA原料主要通过化学合成或利用重组DNA质粒，在细胞中表达相应RNA的方法获取。这些方法合成的小RNA，不仅价格昂贵，而且为了提高其稳定性可能带有过多的人工基团修饰，或缺少必要的的转录后修饰。因此，小RNA的折叠、生物活性及安全性都可能受到影响。例如，化学法合成小RNA通常会对其磷酸骨架中的氧原子进行硫取代，或对核糖基中的基团进行修饰(2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧乙基修饰等)以提高小RNA的代谢活性过对靶分子的亲和力。但是，人工修饰可能引起比较严重的免疫反应。由于不良免疫反应的高发生率，化学合成的miR-34a模拟物的I期临床试验已经被终止，化学合成siRNA药物Revusiran也因为相同的原因被终止了III期临床试验。目前，高昂的成本及生产的RNA原料功能的不确定性使得RNA疗法的发展严重受限。也提示我们，活细胞中产生的ncRNAs可能更好地应用于生物、医学研究以及小核酸药物的开发中，以避免严重免疫反应。

近来，tRNA已被成功地用作支架在大肠杆菌中生产小ncRNA(Luc Ponchon,etal.,Recombinant RNA technology:the tRNA scaffold[J].Nature Methods,2007,4(7):571-576；Luc Ponchon,et al.,A generic protocol for the expression andpurification of recombinant RNA in Escherichia coli using a tRNA scaffold[J].Nature Protocols,2007,4(6):947-959)。Ponchon et.al.的方法是使用甲硫氨酰tRNA和人赖氨酸tRNA直接嵌合小ncRNA前体进行表达，再用RNase H对所表达的重组RNA进行切割之后，用离子交换色谱纯化成熟小ncRNA片段。然而，此种生物表达方法，已被证明其适用范围有限，多种小RNA在该策略下无法表达或表达量过低。加州大学戴维斯分校Ai-Ming Yu等人发明了用大肠杆菌甲硫氨酰tRNA嵌合前体microRNA表达短片段RNA的方法(WO2015183667A1)。Yu et.al.的方法较Luc Ponchon,et.al.方法普适性更强。以tRNA直接嵌合前体小RNA无法表达的多个小RNA，使用Yu et.al.的方法均可表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组小RNA的生产方法。该方法以人丝氨酸tRNA嵌合hsa-miR-34a前体，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好，因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA，但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA，因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性及免疫原性均可能更低；本发明缩短了所表达的重组tRNA的长度，从而降低了细胞毒性，提高了表达量；本发明对hsa-miR-34a前体中的序列进行改造(105ΔG)，改善互补配对情况，形成更完美的“茎”，提高重组小RNA稳定性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，以tRNA为支架，嵌合miRNA前体，在大肠杆菌中表达目标小RNA。

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为长度小于400nt的RNA。

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述tRNA的序列为与人丝氨酸tRNA序列(SEQ ID NO.1)相似度达90％以上的序列，人丝氨酸tRNA序列如下：

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述miRNA前体的序列为与hsa-miR-34a前体(SEQ ID NO.2)序列相似度达90％以上的序列，hsa-miR-34a前体序列如下：

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述miRNA前体嵌合于tRNA反密码子环处，嵌合序列为与SEQ ID NO.3序列相似度达90％以上的序列，SEQ ID NO.3序列如下：

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA的生产方法包括以下步骤：

步骤一、设计合成miR-34a前体引物；

步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将hsa-miR-34a前体的表达序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；

步骤三、将构建的表达载体中miR-34a的成熟序列部分替换为目标小RNA序列，构建嵌合目标序列的表达载体；

步骤四、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；

步骤五、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标小RNA。

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为shRNA、miRNA、siRNA或RNA适配体。

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤四中所述大肠杆菌为HST08菌株。

上述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤五中大肠杆菌采用LB培养基或2XYT培养基培养。

另外，本发明还提供了一种采用上述的方法生产的重组小RNA在制备诊断试剂中的应用。

进一步的，本发明提供了一种采用上述的方法生产的重组小RNA在制备前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明以人丝氨酸tRNA嵌合hsa-miR-34a前体，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好，因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA，但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA，因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性及免疫原性均可能更低；本发明缩短了所表达的重组tRNA的长度，从而降低了细胞毒性，提高了表达量；本发明对hsa-miR-34a前体中的序列进行改造(105ΔG)，改善互补配对情况，形成更完美的“茎”，提高重组小RNA稳定性。

2、本发明设计制备的重组小RNA为通过生物工程技术获得，具有设备简便、生产快速、产量高、成本低、功能性好等优势。

3、经多种技术手段检测表明，本发明的方法能方便快捷地制备多种miRNA/siRNA/RNA适配体，生产制备的重组小RNA满足科学研究及药物研发的需求。

下面结合附图和实施例，对本发明技术方案做进一步的详细说明。

附图说明

图1是本发明对pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。

图2是本发明利用菌液PCR鉴定重组miR-27b表达质粒。

图3是本发明利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-27b的表达。

图4是本发明利用Bio-Rad NGC^TM Chromatography System纯化重组miR-27b，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。

图5是本发明利用qPCR技术检测重组hsa-miR-27b在LS180细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示)。

图6是本发明利用qPCR技术检测重组hsa-miR-27b可有效下调靶基因VDR及VDR调控的CYP3A4表达结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用t检验，*P<0.05)。

图7是本发明利用Western blot技术检测重组hsa-miR-27b可有效下调靶蛋白VDR及VDR调控的CYP3A4表达结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用t检验，*P<0.05)。

图8是本发明利用液相色谱串联质谱系统检测重组hsa-miR-27b通过调控靶分子VDR影响其下游CYP3A4酶代谢活性的结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用t检验，*P<0.05)。

图9是本发明利用qPCR技术检测重组si-lnc-DIF在原代成骨细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示)。

图10是本发明利用qPCR技术检测重组si-lnc-DIF可有效下调靶基因lnc-DIF的表达结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用t检验，*P<0.05)。

具体实施方式

实施例1：以PCR技术扩增hsa-mir-34a前体，构建pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体。

(1)根据miRBase中hsa-mir-34a(MI0000268)前体的序列，设计引物扩增其前体。同时在引物两端加上1～15nt载体插入位点两侧的同源序列。序列见表1(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)。同源序列的加入可采用网站http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do辅助设计。

表1 hsa-mir-34a引物序列

(2)miR-34a前体插入片段的合成

以人基因组DNA为模板，采用表1中的引物进行PCR反应，反应体系如表2：

表2聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)

混合均匀后加入PCR管，按照表3所示反应条件进行PCR反应。

表3聚合酶体外扩增链反应过程

(3)pBSKrnaSeph载体的双酶切

用Eag I-HF^TM，Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切，反应体系如表4所示。

表4 10μL双酶切体系

(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化

将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。在凝胶成像系统中用365nm的紫外光观察琼脂糖凝胶电泳后的DNA分离结果，用刀片小心切下带有所需DNA区带的凝胶，尽可能切下更少的胶，放入1.5mL的EP离心管中；称取凝胶的质量；按照1:1的体积比向装有琼脂糖凝胶的离心管中中加入Binding Buffer结合缓冲液，并将混合物放于50℃～55℃水浴中7min，期间每隔两到三分钟振荡混合一次，直至凝胶完全融化；将3中融化得到的溶液放于室温中冷却，然后将溶液转移到DNA Mini Column离心柱中，并将离心柱放入2ml的Collection Tube收集管中；10000rpm离心1min。每次离心的溶液体积最多为700μL，可将溶液分多次离心，直至全部离心完，并弃去收集管中的滤液，重复利用收集管；在离心柱中加入700μL的添加过无水乙醇的SPW Wash Buffer。放于离心机中10000rpm，室温离心1min；弃去滤液，将离心柱以13000rpm的转速室温下离心2min，以彻底除去纯化柱中的乙醇；将离心柱置于全新干净的离心管中。向离心柱中央悬空滴加30～100μL的Elution Buffer洗脱液，静置2min使DNA完全溶解在洗脱液中。放于离心机中以13000rpm的转速室温离心1min，回收管底的洗脱液。取少量洗脱液进行DNA凝胶电泳测定是否为目的产物，贮存于-20℃。

(5)插入片段与载体的连接

胶回收片段用Ligation-Free Cloning System进行连接，反应体系如表5所示。

表5无缝连接反应体系(20μL)

混匀后，置于冰上孵育30分钟；转化大肠杆菌HST08感受态细菌；对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。

(6)菌液PCR与DNA测序鉴定pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体

挑取单克隆菌落，于含有氨苄的LB培养基中培养约3h。取20μL菌液，加入180μL水，95℃放置10min，作为模板。用测序引物M13Fow-GTAAAACGACGGCCAGT，Rev-CAGGAAACAGCTATGAC进行菌液PCR鉴定。反应体系和反应条件如表2和表3。另取100uL菌液，用相同的引物进行DNA测序鉴定。

图1是本发明对pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。图中M代表DL2000DNA marker；1代表pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒；2代表双酶切后的pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒。结果表明，pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体构建成功。

实施例2：以pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体表达重组miR-27b

(1)根据miRBase中hsa-mir-27b成熟序列(MIMAT0000419)以及pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体上的序列设计引物。

(2)插入片段的合成

以两条引物互为模板，进行PCR合成插入片段，反应体系如表6所示，反应条件同表3。

表6聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)

其余构建步骤同上。

图2是本发明利用菌液PCR鉴定重组miR-27b表达质粒，含有插入片段的质粒扩增出～500bp的条带，如图中箭头示处。结果表明，重组miR-27b表达质粒构建成功。

实施例3：tRNA支架重组hsa-miR-27b的表达

(1)小量提取重组miR-27b表达质粒

100ng重组hsa-miR-27b表达质粒转化HST08感受态细菌后，加入5mL2XYT培养基在37℃，200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后，收集沉淀。于沉淀中加入180uL10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬，再加入200uL的饱和苯酚，室温振摇20～60min。10000g离心10min后收集水相，加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇，10000g离心10min后，弃掉上清。吸水纸吸弃残留乙醇，待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，测定浓度，-80℃冰箱保存。

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

将0.5～2μg RNA样品与RNA上样缓冲液混合，加入变性胶样品孔内。80-100V电泳50～80min后，放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇10～30min，于凝胶成像系统下观测，拍照保存。

图3是本发明利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-27b的表达。图中M表示RNA marker；1表示重组miR-27b表达质粒转化的HST08E.coli；2表示野生型HST08E.coli。与未转化重组hsa-miR-27b表达质粒的细菌RNA相比，转化后的细菌在150-300nt之间多了一条条带。结果表明，重组hsa-miR-27b表达质粒可高表达重组miR-27b。

实施例4：FPLC纯化重组hsa-miR-27b

(1)采用Bio-Rad NGC^TM Chromatography System，以离子交换柱(ENrich^TMQ10×100Column)纯化重组hsa-miR-27b。

流动相A：10mM NaH₂PO₄溶液，pH7.0。

流动相B：10mM NaH₂PO₄溶液，1MNaCl溶液，pH7.0。

流速为2.0mL/min。以DEPC水，流动相A，流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。

运行以下程序对总RNA进行分离：0-8.9min(0％B)，8.9-13.7min(55％B)，13.7-53.7min(55-75％B)，53.7-73.7min(75-85％B)，73.7-83.7min(100％B)，83.7-93.7min(0％B)。以260nm的吸光度检测RNA，并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。

(2)RNA样品处理方法

总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃13000rpm离心10min后，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，每次进样5～10mg。

(3)FPLC组分收集及浓缩去盐

以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA，-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解，用Ultra-2mLCentrifugal Filters 4℃7500g离心10min，去滤液，重复此步骤直至所有溶液离心完，再将Filters倒置，2000g离心2min，收集所得溶液，测定浓度后于-80℃保存。

图4是本发明利用Bio-Rad NGC^TM Chromatography System纯化重组miR-27b，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明，经FPLC纯化后，可得到纯的重组hsa-miR-27b。

实施例5：重组hsa-miR-27b在细胞内的加工成熟

(1)LS-180细胞的转染

将细胞以10000个/孔接种于24孔板。按照lipofectamine 2000操作说明书进行细胞转染。重组hsa-miR-27b的转染浓度为40nM。

(2)RNA的提取(E.Z.N.A miRNA Kit,OMEGA miRNA提取试剂盒)

按照试剂盒说明书进行操作。所得miRNA测定浓度后，于-80℃冰箱保存备用。

(3)荧光定量PCR(q-PCR)检测重组hsa-miR-27b在细胞内的加工成熟

使用TAKARA逆转录试剂盒将所提RNA反转录为cDNA。反转录条件为：37℃ 15min；80℃ 15s。取各组的cDNA为模板，以U74为内参，采用qPCR检测hsa-miR-27b在细胞中的表达量。qPCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s，44个循环。所用引物序列如表7(SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)。

表7重组hsa-miR-27b逆转录及Q-PCR检测中所用引物序列

图5是本发明利用qPCR技术检测重组hsa-miR-27b在LS180细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示)。与阴性对照(NC相比)，成熟miR-27b表达水平显著升高。说明重组miR-27b在细胞内可被正确加工为成熟miR-27b。

实施例6：重组miR-27b对靶分子的调控活性

维生素D受体是(VDR)是miR-27b的靶分子之一。且VDR调控药物代谢酶CYP3A4的表达。因此检测VDR、CYP3A4的表达，以及CYP3A4的活性可反应重组miR-27b对靶分子VDR的调控活性。

(1)qPCR检测重组miR-27b对靶分子的调控

LS-180细胞转染、RNA提取、逆转录及qPCR过程同上。qPCR中使用的引物序列如表8(SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16)。

表8重组miR-27b调控靶分子的Q-PCR检测中所用引物序列

(2)Western blot检测重组miR-27b对靶分子蛋白表达的调控

用2μM 1α-VD3处理72小时以诱导CYP3A4的表达。然后用40nM重组miR-27b/阴性对照(Neg)转染LS-180，细胞转染方法同上。48h后，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液制备裂解细胞用于Western blot分析。通过BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。在10％SDS-PAGE上分离30μg/泳道全细胞蛋白并转移到PVDF上。将膜在5％脱脂牛奶中在TBST缓冲液中封闭2小时。在4℃下将膜与相应的一抗(anti-VDR，anti-CYP3A4，anti-GAPDH)孵育过夜。PVDF膜用TBST洗涤三次后，与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体在室温下孵育2小时。通过增强化学发光检测系统(Bio-Rad)检测蛋白质条带，并通过ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)分析结果。

(3)CYP3A4活性测定

使用液相色谱串联质谱法(LC-MS)来测定LS-180细胞中CYP3A4的代谢活性。CYP3A4的经典底物咪达唑仑及其代谢物1'-OH-咪达唑仑用于测定其活性。LS180细胞诱导及转染方法同上。转染48h后，将细胞与1μM咪达唑仑在37℃孵育90min。然后收集100μL培养基上清，用1mL含有10nMharmaline(内标)的乙酸乙酯萃取，将提取物于氮气流下挥干，用100μL甲醇-水(20:80，v/v)复溶。在阳离子模式下分析样品。

配备LC-20AD二元泵，在线脱气机，自动进样器和柱温箱的ShimadzuHPLC系统用于所有分析。ZORBAX Eclipse plus C18(50×2.1mm，3.5μm)分析柱(Aglient Technologies，Santa Clara，CA，USA)用于色谱分离目标分子和内标。流动相流速设定为0.4mL/min。柱温保持在35℃。流动相A是水，流动相B是甲醇。A相和B相均含有0.1％甲酸。运行以下程序对样品进行分离：0-0.5min(10％B)，0.5-2.0min(10-25％B)，2.0-7.0min(25-45％B)，7.0-7.1min(45-90％B)，7.1-9.0min(90％B)，9.0-9.1min(90-10％B)，12.0min停止。自动进样器在8℃条件下进样，进样量为5μL。

LC系统与配备有电喷雾电离(ESI)源的QTRAP4000质谱仪(Applied Biosystems/MDS SCIEX，USA)串联。数据由Analyst软件(Applied Biosystems/MDS SCIEX，版本1.6.2)收集和分析。定量测定通过多反应监测(MRM)方法进行。咪达唑仑326.7/292.1,1'-OH-咪达唑仑342.0/203.0。电喷雾电离电压设定为5400V。涡轮喷雾温度保持在500℃。雾化器气体(气体1)和加热器气体(气体2)分别设定为50和50。帘式气体保持在30℃，界面加热器打开。

参照图6至图8，结果表明，重组hsa-miR-27b可有效下调靶分子表达，抑制CYP3A4代谢活性。

实施例7：以pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体表达重组siRNA，重组si-lnc-DIF

(1)根据LncRNA-DIF的有效siRNA序列，以及pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体上的序列设计引物；

(2)其余表达载体构建步骤同实施例2；

(3)tRNA支架重组si-lnc-DIF的表达步骤同实施例3；

(4)tRNA支架重组si-lnc-DIF的纯化步骤同实施例4。

实施例8：重组si-lnc-DIY在原代成骨细胞内的加工成熟

(1)原代成骨细胞的转染

将细胞以10000个/孔接种于24孔板。按照lipofectamine 2000操作说明书进行细胞转染。重组si-lnc-DIF的转染浓度为50nM。

(2)RNA提取及逆转录步骤同实施例5。茎环法q-PCR检测重组si-lnc-DIF在细胞内的加工成熟。q-PCR检测使用的引物序列如表9(SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)。

表9重组si-lnc-DIF逆转录及Q-PCR检测中所用引物序列

图9是本发明利用qPCR技术检测重组si-lnc-DIF在原代成骨细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示)。与阴性对照(NC相比)，成熟si-lnc-DIF表达水平显著升高。说明重组si-lnc-DIF在细胞内可被正确加工为成熟si-lnc-DIF。

实施例9：重组si-lnc-DIF对靶分子lnc-DIF的调控活性

(1)qPCR检测重组si-lnc-DIF对lnc-DIF的调控

原代成骨细胞转染、RNA提取、逆转录及qPCR过程同表3。qPCR中使用的引物如表10(SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25)。

表10重组si-lnc-DIF调控靶分子lnc-DIF的Q-PCR检测中所用引物序列

参照图10，结果表明，重组si-lnc-DIF可有效下调靶分子表达。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

SEQ ID NO.1

<110>西安荣清畅生物科技有限公司/西北工业大学

<120>一种重组小RNA的生产方法及应用

<160>25

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>104

<212>RNA

<213> homo sapiens

<223> tRNAser

<400>1

nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacunnnn nnnnnnnnnn 50

nnaauccaau ggggucuccc cgcgcagguu cgaacccugc ucgcugcgcc 100

annn 104

SEQ ID NO.2

<160>25

<210>2

<211>109

<212>RNA

<213> homo sapiens

<223> hsa-miR-34a

<400>2

ggccagcugu gaguguuucu uuggcagugu cuuagcuggu uguugugagc 50

aauaguaagg aagcaaucag caaguauacu gcccuagaag ugcugcacgu 100

uguuggccc 109

SEQ ID NO.3

<160>25

<210>3

<211>197

<212>RNA

<213>人工序列

<223> tRNAser -hsa-miR-34a嵌合序列

<400>3

nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacuggcc agcugugagu 50

guuucuuugg cagugucuua gcugguuguu gugagcaaua guaaggaagc 100

aaucagcaag uauacugccc uagaagugcu gcacguuguu ggcccaaucc 150

aauggggucu ccccgcgcag guucgaaccc ugcucgcugc gccannn 197

SEQ ID NO.4

<160>25

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<223> hsa-mir-34a上游引物

<400>4

cggtagagca gcggccgggc cagctgtgag tgtttct 37

SEQ ID NO.5

<160>25

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<223> hsa-mir-34a下游引物

<400>5

gaaccctgga cccgcggggg ccccacaacg tgcagcactt ct 42

SEQ ID NO.6

<160>25

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223> Universal rev引物

<400>6

gcgctaaggc acgcggtg 18

SEQ ID NO.7

<160>25

<210>7

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<223> U74逆转录引物

<400>7

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaattgt 50

SEQ ID NO.8

<160>25

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223> U74上游引物

<400>8

cctgtggagt tgatcctagt ctgggtg 27

SEQ ID NO.9

<160>25

<210>9

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<223> hsa-miR-27b逆转录引物

<400>9

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgcagaa 50

SEQ ID NO.10

<160>25

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223> hsa-miR-27b上游引物

<400>10

gcccttcaca gtggctaag 19

SEQ ID NO.11

<160>25

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>18S上游引物

<400>11

gtaacccgtt gaaccccatt 20

SEQ ID NO.12

<160>25

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>18S下游引物

<400>12

ccatccaatc ggtagtagcg 20

SEQ ID NO.13

<160>25

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> CYP3A4上游引物

<400>13

gcctggtgct cctctatcta 20

SEQ ID NO.14

<160>25

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223> CYP3A4下游引物

<400>14

ggctgttgac catcataaaa g 21

SEQ ID NO.15

<160>25

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> VDR上游引物

<400>15

gacatcggca tgatgaagga 20

SEQ ID NO.16

<160>25

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<223> VDR下游引物

<400>16

ctagggtcac agaagggtca tc 22

SEQ ID NO.17

<160>25

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> 茎环法q-PCR通用下游引物

<400>17

ccagtgcagg gtccgaggta 20

SEQ ID NO.18

<160>25

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> U6下游引物

<400>18

aacgcttcac gaatttgcgt 20

SEQ ID NO.19

<160>25

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<223> U6上游引物

<400>19

ctcgcttcgg cagcaca 17

SEQ ID NO.20

<160>25

<210>20

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<223> si-lnc-DIF逆转录引物

<400>20

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagctgg 50

SEQ ID NO.21

<160>25

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223> si-lnc-DIF上游引物

<400>21

catgcacggc ctgattca 18

SEQ ID NO.22

<160>25

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223> GADPH上游引物

<400>22

tgcaccacca actgcttag 19

SEQ ID NO.23

<160>25

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223> GADPH下游引物

<400>23

ggatgcaggg atgatgttc 19

SEQ ID NO.24

<160>25

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> Lnc-DIF上游引物

<400>24

cctgtggagg aaggaagatg 20

SEQ ID NO.25

<160>25

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223> Lnc-DIF下游引物

<400>25

tcagaaggct ggagagatgg 20

Claims

1.一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，以tRNA为支架，嵌合miRNA前体，在大肠杆菌中表达目标小RNA。

2.根据权利要求1所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为长度小于400nt的RNA。

3.根据权利要求1或2所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述tRNA的序列为与人丝氨酸tRNA序列(SEQ ID NO.1)相似度达90％以上的序列，人丝氨酸tRNA序列如下：

4.根据权利要求3所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述miRNA前体的序列为与hsa-miR-34a前体(SEQ ID NO.2)序列相似度达90％以上的序列，hsa-miR-34a前体序列如下：

5.根据权利要求4所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述miRNA前体嵌合于tRNA反密码子环处，嵌合序列为与SEQ ID NO.3序列相似度达90％以上的序列，SEQ IDNO.3序列如下：

6.根据权利要求5所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA的生产方法包括以下步骤：

步骤一、设计合成miR-34a前体引物；

步骤四、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；

7.根据权利要求1、2、4、5或6所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，所述小RNA为shRNA、miRNA、siRNA或RNA适配体。

8.根据权利要求6所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤四中所述大肠杆菌为HST08菌株。

9.根据权利要求6所述的一种重组小RNA的生产方法，其特征在于，步骤五中大肠杆菌采用LB培养基或2XYT培养基培养。

10.一种采用如权利要求1、2、4、5或6所述的方法生产的重组小RNA在制备诊断试剂中的应用。

11.一种采用如权利要求1、2、4、5或6所述的方法生产的重组小RNA在制备前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。