CN107091929A

CN107091929A - 一种启动子批量捕获方法

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Publication number: CN107091929A
Application number: CN201610103879.1A
Authority: CN
Inventors: 杨剑波; 王常霖; 魏鹏程; 李娟�; 李�浩; 杨亚春; 李莉; 许蓉芳
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences; Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2036-02-25
Also published as: CN107091929B

Abstract

本发明提供一种启动子批量捕获方法，所述方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA‑蛋白因子”的复合体，应用改进的染色体免疫共沉淀技术，把包含有未知植物基因启动子片段的DNA分拣出来。本发明利用蛋白因子OsTBP2和OsTFIIB紧密结合启动子上的TATA盒短链保守序列启动转录这一特性，通过生成这两种因子的特异性抗体，结合染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，专向捕捉未知植物基因启动子片段的技术。本技术利用大多数启动子都含有的一段TATA盒短链保守序列这一特点，结合近年来新开发的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)来分离未知的植物基因启动子片段的技术，比较容易实现植物启动子的大规模捕获，具有较高的商业价值。

Description

一种启动子批量捕获方法

技术领域

本发明涉及到生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种能够批量地从植物中捕获启动子的方法，该方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA-蛋白因子”的复合体，通过改进的染色体免疫共沉淀技术，使用复合体中蛋白因子的特异性抗体，从植物基因组分离未知的基因启动子片段。

背景技术

在植物的生长发育过程中，基因的调控序列即启动子对植物在不同的生长阶段里特定组织结构的形成和生长发育，以及对外界生物、非生物因子的胁迫应答都起着决定性的作用。启动子区域中的保守序列是转录因子的靶标，两者的特异结合是促进下游编码基因表达的重要环节，因此研究特定基因的调控首先要了解它的启动子。

大多数启动子都含有一些短链的保守序列，也叫做顺式作用元件。启动子上的TATA box，是许多通用转录因子的装配位点。TFIID因子对TATA box的识别是转录起始的第一步，转录因子TFIID的亚基TBP(TATA-binding protein)特异性识别和结合TATA box，然后促进其他转录因子结合，从而形成多因子的全酶-RNA聚合酶II。转录因子TFIIB是TFIID和RNA聚合酶的桥梁因子，能够富集高浓度的RNA聚合酶到启动子的周围，转录因子TFIID与TATA box结合后，转录因子TFIIB不对称的结合于TATA box的下游，决定转录起始位点，并保护起始位点附近的DNA模板链。同样地，在植物基因转录过程中，RNA聚合酶和一些转录因子，通过一系列复杂过程识别并结合到启动子区域中的保守序列上，组成转录起始复合物，由此推动目的基因以适当的强度，在特定的时间和空间表达基因产物。

自从进入21世纪以来，基因组的研究取得了长足的进步，基因数据库信息不断丰富，促进了功能基因和启动子的研究的发掘。然而相对于其它生物，对植物的基因发掘，在数量和质量方面还相当有限，远远不能满足作物分子育种的需求。尤其是对启动子的研究和发掘，大都基于对个别基因的分析认识，分离和表达等，难以做到规模化和系统化的开发。

现有技术中也存在着一些寻找植物基因中的启动子的方法，但是，现有技术中的方法往往是通过软件测算的估计启动子的可能存在，并不能直接一次性获得大量的启动子。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种能够批量捕获植物中各种未知启动子的方法。

本发明的目的是提供一种随机分离植物基因启动子片段的有效技术方法。

具体而言，本发明开发了水稻基因转录装置中的RNA聚合酶II型(Pol II)里面的DNA结合蛋白OsTBP2抗体和它的增强子OsTFIIB抗体。所述抗体能够有效结合到水稻基因启动子的转录调控位点TATA盒上。通过多聚甲醛对活体水稻幼苗的固定，用超声波对植物细胞的破碎，使用染色体免疫共沉淀手段，把DNA结合蛋白和含有TATA盒序列的启动子片段分拣出来。由于大部分的启动子都含有TATA盒序列，可以在分拣的DNA中获得多个启动子。然后克隆出分拣的启动子，在植物体内进行功能验证。本发明改变了常规手段对单个启动子的分离和获取。

植物基因启动子的高效获取手段通过如下方法实施：

所述OsTBP2和OsTFIIB抗体在ChIP新技术应用中，采取以下方案实施：

步骤(1)以水稻品种日本晴为材料，通过1％多聚甲醛交联植物细胞，固定蛋白与核酸的结合物；

步骤(2)将蛋白核酸复合物用研钵碾碎，加进缓冲液抽提，再将染色质片段通过超声波，打断成200bp到800bp的小片段；

步骤(3)用离心机离心沉淀，取上清，将上清液加到制好的OsTBP2抗体亲和柱上孵育；

步骤(4)通过清洗将没有和抗体结合的物质洗去，再将目标蛋白核酸复合体洗脱收集；

步骤(5)用蛋白酶K酶解，除去核酸结合蛋白，给核酸溶液在65℃中加热两个小时，解除交联；

步骤(6)给解交联后的核酸溶液用苯酚、氯仿萃取，离心，取上清液加上两倍的酒精沉淀，浓缩核酸分子(DNA)；

步骤(7)对所获得的DNA片段进行Chip-seq测序，通过对测序结果进行生物学分析，筛选出其中可能的启动子片段。

步骤(8)从水稻基因组中克隆出启动子片段，构建启动子与报告基因(GUS或GFP)的融合表达载体，在烟草中进行瞬时转化或水稻中的稳定遗传转化，通过检测报告基因的表达模式，验证启动子的功能，以及在其基础上进行启动子优化设计。

需要说明的是，本文中“DNA-蛋白因子”复合体指的是：蛋白质(包括聚合酶、转录因子等蛋白)结合到DNA上形成的复合物。DNA和蛋白的相互作用，在生命过程中起着至关重要的作用。比如，核小体由DNA和组蛋白(histone)构成，是染色质(染色体)的基本结构单位。又如，DNA聚合酶结合到DNA上启动DNA复制过程，转录因子和RNA聚合酶结合到启动子DNA序列上是基因转录的第一步。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

染色质免疫共沉淀技术是目前基因组研究中在体内寻找特定蛋白质与DNA序列结合的有效方法，这一技术的应用便于研究细胞核内蛋白质和核酸相互作用的过程。通过对活体染色质的固定、破碎，然后用亲和纯化过的特异抗体来检出相应的蛋白质-核酸结合体，进而分离出与特定蛋白相结合的核酸分子。

目前有将免疫共沉淀技术应用到某种特定性质DNA片段的捕获中，但很少应用到植物中关于某种特定性质DNA片段的捕获，本发明中应用到与植物启动子中的TATA box结合的OsTBP2蛋白，以及增强两者相互作用的转录因子OsTFIIB，将植物起始转录原理及染色质免疫共沉淀技术巧妙结合，从而更高效准确的分离出植物启动子。

技术效果

本发明提供的规模化随机分离植物基因启动子片段的技术方法。特别适用于差异比较植物在生物，非生物胁迫条件下，辨认哪些基因启动子在起主导作用，进而实现有效分离和获取，找出那些可以帮助实现高产、优质、抗逆的调控因子，为水稻分子育种和基因工程改良提供服务。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表示在E.coli里表达并纯化的OsTBP2，该图表明了洗脱的OsTBP2蛋白纯化度较高。(图中：1、诱导；2、流出；3、清洗；4、洗脱1；5、洗脱2；6、洗脱3；7、蛋白分子量标记。)

图2表示在E.coli里表达并纯化的OsTFIIB，该图表示了OsTFIIB蛋白的纯化度也有较明显的提高。(图中：1、蛋白分子量标记；2、未诱导；3、诱导；4、流出；5、清洗1；6、清洗2；7、洗脱1；8、洗脱2。)

图3表示DNA结合蛋白OsTBP2/OsTFIIB与pal基因启动子的凝胶迁移实验(EMSA)。图3-1表示以pal基因启动子上包含TATA盒的-59～-3位置的序列作为探针；图3-2表示OsTBP2/OsTFIIB与pal基因启动子探针的凝胶迁移实验(EMSA)，该图显示了OsTBP2蛋白和TATA盒DNA的结合，以及OsTBIIB的增强效果。(图中：1、探针与OsTBP2结合；2、无探针对照；3、探针与OsTBP2/OsTFIIB结合；4、非特异性竞争；5、特异性竞争。)

图4表示OsTBP2抗体在水稻植株抽提液中的表现，该图说明了OsTBP2蛋白在水稻植株体内绝大多数以二聚体的形式存在，而单体的存在较少。(图中：1、重组蛋白OsTBP2作为对照；2、水稻植株抽提液；M、蛋白分子量标记(kDa)。右下的箭头为OsTBP2的单体；右上的箭头为OsTBP2的二聚体。)

图5表示用磁珠蛋白A对水稻植株OsTBP2纯化分离，该图则表明磁珠蛋白A通过对抗体的结合，可以大量地收集水稻植株内的OsTBP2蛋白。(图中：1、水稻植株的粗提蛋白；2、磁珠蛋白A的流出液；3、清洗液；4、洗脱纯化的OsTBP2二聚体；M、蛋白分子筛标准样(kDa)。)

图6表示用半定量PCR方法检测ChIP的产物，图中的半定量PCR做了28个循环处理。该图显示在一定的条件下，加入和不加入外源pal重组基因片段都同样能够检测到ChIP产物，表明有基因组DNA存在于ChIP分离物中。同时，重组TATA盒的结合蛋白OsTBP2和重组增强蛋白OsTFIIB能明显提高基因组DNA的收集。(引物pal-755和pal-492的序列参见试验用材料和方法，这对引物的PCR产物大小为263bp。)

图7表示克隆了2个chip-seq测序分析为启动子的DNA片段P1和P2。(图7A表示的是克隆三个启动子的电泳图，大小分别为350bp和682bp。分别将这2个启动子片段连接至1391载体上，构建启动子与GUS的融合表达载体(P1-1391和P2-1391)。图7B表示的是融合表达载体的酶切电泳结果。

图8表示P1和P2三个启动子在烟草叶片中的活性表现。通过烟草瞬时转化实验，测定这3个启动子逆境处理前后的活性变化。结果显示，P1启动子经冷(4℃)诱导后活性上升明显，说明P1是一个冷诱导启动子；P2启动子则是盐(200mM NaCl)处理后,活性提高了3～4倍，这说明P2是盐诱导启动子。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明主要利用改进的染色质免疫共沉淀技术。使用染色质免疫共沉淀技术分离植物基因启动子片段，首先需要一个能持续有效启动转录的核酸结合蛋白，本发明使用的核酸结合蛋白是基因转录装置中的RNA聚合酶II型(Pol II)里面的OsTBP2(ACCESSION code:AF464907，其核苷酸序列如SEQ ID No.1中所示)及其转录因子OsTFIIB(其核苷酸序列如SEQ ID No.2中所示)。通过对水稻幼苗染色质的固定，粉碎，和对OsTBP2的免疫分离，就可能大量分离植物基因启动子片段。我们以水稻为例，说明应用染色质免疫共沉淀技术对植物启动子片段分离的过程及前景。

1、植物材料

日本晴成熟种子，由安徽省农科院水稻所生技室保存。

2、菌株及质粒

本研究所用大肠杆菌菌株为XL1-blue；根瘤农杆菌为EHA105，安徽省农科院水稻所生物技术室保存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。

3、试剂与药品

次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉素B购自Roche公司；PEASY-T simple和DNA marker-Trans2K购自Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；DNA片段回收试剂盒购自TIANGEN公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒。引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。

4、基因克隆

(1)克隆水稻基因OsTBP2和OsTFIIB；所用的引物，其核苷酸序列如下表；

引物名称	引物序列
		TBP2-168f	5'-CAAGACC-ATGGCGGCGGAGGCGGCAG-3'
TBP2-776C	5'-GACGAGCTC-CTGCTGGACTTTTCTGAAC-3'
		TFIIB-83f	5'-CAAGACC-ATGAGCGACTCGTTCTGC-3'
TFIIB-1018C	5'-GACGAGCTC-TGGTGTGCACAGATTCTTC-3'
		X16099-493f	5'-GCCTTACCTACCTACACCCG-3'
X16099-630r	5'-CGAGGAGAAGAGAGGATTCG-3'
		X16099-437f	5'-GATCCACCATACAAGCCACAACC-3'
X16099-755r	5'-CACCATGCGCTTCACCTC-3'

表1

以水稻品种日本晴的cDNA序列为模板，利用步骤(1)中所述引物，用DNA聚合酶对水稻DNA中OsTBP2和OsTFIIB扩增。PCR扩增条件为一个循环的98℃，3分钟；然后进行30个循环的扩增(98℃，30秒；60℃，30秒；72℃，90秒)和一个循环的延伸72℃，10分钟，所得产物切胶回收。

连接：先将OsTBP2及OsTFIIB的PCR回收产物末端加上dATP(A mix 1.825μl+PCR产物3.175μl，72℃30min)，取4μl产物和1μl的T载体链接，室温反应10分钟；

转化：①将连接产物加入50μl的XL-blue感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20-30分钟；②42℃热激90秒，立即置于冰上2分钟；③加入250μl平衡至室温的LB培养基，37℃，120转/分钟孵育1小时；④4000转/分钟离心1分钟，去除上清，保留150μl菌液均匀的涂在含有卡那霉素抗性的LB板上37℃放置30分钟后倒置过夜；

鉴定：①挑取阳性克隆菌斑，37℃培养3小时后取1μl菌液作为模板，分别以OsTBP2及OsTFIIB的正向引物(TBP2-168f和TFIIB-83f)和M13F作为反向引物，做菌液PCR鉴定，条件如上所述；②取菌液送英潍捷基生物科技有限公司测序。

(2)蛋白表达与纯化

取鉴定为阳性的克隆，接种培养过夜，用质粒提取试剂盒(天根公司)提取质粒，得到pTA-OsTBP2质粒和pTA-OsTFIIB质粒。随后用SacI/NcoI把OsTBP2和OsTFIIB分别连接到表达载体PET30a中表达重组蛋白。重组和对照大肠杆菌菌落分别接入50ml卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中，在250ml摇瓶中于37℃培养过夜；取5ml过夜培养的菌液接入500ml含卡那霉素的LB培养基中，在2L摇瓶中于37℃振荡培养至对数中期(0D600＝0.6)；加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4mmol/L，30℃诱导表达4小时；诱导结束后，离心5000g，15min收集菌体，然后再用4℃预冷的磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，清洗后同样以5000g离心15min收集菌体，在-20℃冻存备用。

蛋白纯化采用镍柱亲和层析法：

取500ml菌液离心后的菌体加入4℃预冷的10ml结合缓冲液，间隔1小时按1:100加入蛋白酶抑制剂(1mg/ml PMSF)，振荡混匀后超声破碎菌体(超声约7分钟，每次15秒，间隔1分钟，50％功率)；随后离心15分钟，10000rpm/min，4℃，取上清液，用0.45mm滤膜过滤后放置在冰上；将处理后Ni-NTA转移至小摇瓶中，加入已过滤的裂解的蛋白提取液，4℃摇床摇1小时；将裂解液和镍柱的多孔珠子全部转移至柱中，收集流出部分(镍柱提前用Binding缓冲液平衡好)；用10ml的清洗液洗3次；用洗脱液洗脱，得到纯化的目的蛋白。蛋白的浓度用电泳和分光光度计测定。所得结果如图1，图2所示，其中洗脱的OsTBP2蛋白纯化度较高，并且OsTFIIB蛋白的纯化度也有较明显的提高。

(3)凝胶迁移(EMSA)试验

试验使用了Roche(罗氏)的DIG Gel Shift Kit 2nd Generation，货号为03353591910。

探针选择：探针设计选取了pal基因上游(pal-59和pal-3)的一段序列，大小为56bp，TATA Box位于探针的中间(探针序列的两条寡核苷酸片段如下)。

5'-CGCCCACCCCGTCCACCGCGCCACTATTTAAGCGCCCCCTCCGCCTCCATTTCCCT-3'

5'-AGGGAAATGGAGGCGGAGGGGGCGCTTAAATAGTGGCGCGGTGGACGGGGTGGGCG-3'

探针标记：

将序列互补的寡核苷酸片段在TEN-buffer(10mM Tris,1mM EDTA,0.1M Nacl,pH8.0)中按摩尔比1：1混合。水浴95℃，10min使核苷酸片断充分解离，然后，将样品缓慢冷却至室温。用TEN-缓冲液将核酸稀释至3-4pmol/μl，取100ng稀释好的核苷酸加入小离心管中，并加入ddH₂O使终体积达到10μl，然后按顺序加上4μl 5×Labeling缓冲液，4μl CoCl₂溶液，1μl DIG-ddUTP溶液，1μl末端转移酶(400U)。将以上溶液混匀并迅速进行离心。在37℃反应15min，之后置于冰上。加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0)终止反应。再加入3μl ddH₂O，使终体积达到25μl，标记好的寡核苷酸浓度达到4ng/μl或0.155pmol/μl。

配制EMSA反应体系：

	1	2	3	4
					Binding Buffer	4μl	4μl	4μl	4μl
poly[d(L-C)]	1μl	1μl	1μl	1μl
					poly L-Lysine	1μl	1μl	1μl	1μl
标记探针	1μl	-	1μl	1μl
					ddH₂O	13μl	12μl	10μl	9μl
竞争探针	-	-	-	1μl
					TBP2蛋白	-	2μl	2μl	2μl
TFIIB蛋白	-	-	1μl	1μl

表2

将配好的反应体系混合均匀，在室温中温育15min。将反应体系转移至冰上并在每管中加入5μl无溴酚蓝的上样缓冲液，上样电泳。6％非变性胶配方如下；

6％非变性胶配方：

H₂O	14.34ml
		5*TBE	2ml
30％arcylamide	4ml
		Glycerol(50％)	500μl
TEMED	10μl
		10％APS	150μl
总体积	20ml

表3

转膜：

小心地分开两块胶板，将尼龙膜在转膜缓冲液(0.5×TBE)中平衡5min后贴在胶上，赶尽胶与膜之间的气泡。将8层滤纸在转膜缓冲液中平衡后铺于尼龙膜两边。置整个体系于转膜设备中，在400mA的条件下转膜30min。转膜结束后，将膜取出，在紫外灯下交联10分钟。

检测：

将膜在清洗缓冲液中漂洗，在100ml封闭缓冲液中孵育30min。用20ml抗体溶液中孵育30min。在100ml清洗缓冲液漂洗两次，每次15min。在20ml显色缓冲液中平衡2-5min后，将膜转有DNA的一面向上平放于保鲜膜上，在上面均匀加上1ml显色底物(CSPD)反应液，立即将保鲜膜折起，盖在尼龙膜上，使显色底物(CSPD)反应液能均匀分布于膜表面，室温孵育5min。挤出多余的液体，用保鲜膜将尼龙膜包好，在37℃再孵育10min，然后在室温下用X胶片曝光15-25min。结果如图3所示，其中图3-1示列探针标记在pal基因启动子上的位置；图3-2示列结合蛋白和TATA盒DNA在凝胶迁移试验中的表现，该图显示了OsTBP2蛋白和TATA盒DNA的结合，以及OsTBIIB的增强效果。

Western Blots：

Western Blots主要验证重组蛋白OsTBP2与抗体之间的结合效果，以及抗体与水稻提取液里面的OsTBP2结合效果。

将煮沸后的蛋白样品按顺序上样12％的聚丙烯酰胺胶；首先以100V的初始电压进行电泳，待电流平稳后，将电压调至120V，电泳至溴酚蓝跑出胶的下沿时结束电泳；电泳结束后，将上层的浓缩胶切去，按海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序铺好，施以100V电泳，转膜1小时；转膜结束后，将膜从电泳槽中取出，在封闭液中预处理30分钟，然后加OsTBP2抗体(1：1，000稀释)培养过夜；次日将封闭液倒去，用三羟甲基氨基甲烷-吐温20缓冲液(TBST)清洗3次，再加入二抗(goat anti-rabbit,1：5，000稀释)，室温孵化1小时；将清洗后的膜置于干净的一次性塑料皿中，加入预先混合好的500μl鲁米诺增强溶液和500μl过氧化物溶液，暗处理1min，在显影夹中显影。结果如图4和图5所示；其中图4说明了OsTBP2蛋白在水稻植株体内绝大多数以二聚体的形式存在，而单体的存在较少；图5则表明磁珠蛋白A通过对抗体的结合，可以大量地收集水稻植株内的OsTBP2蛋白。

5、ChIP及chip-seq测序实验流程

甲醛固定植物组织以及超声条件的预备试验：

收集三份水稻幼苗(10天左右)样品，约一克一份，纯水清洗3次后沥干；每管加入1％多聚甲醛溶液，在管口放置一个尼龙网，让幼苗浸泡在甲醛溶液以下；将管放置在干燥器内，用真空泵抽真空，三份样品的抽真空时间分别为3min、5min、8min；打开管子，每管加入1.25ml的2M甘氨酸溶液，继续用真空泵抽真空5min，然后倒掉甲醛溶液，用20ml的纯水洗3次后充分沥干水；将固定后的样品加入液氮充分研磨，超声10次，每次15秒，间隔1min，功率80％，后将样品DNA电泳，发现固定8min的样品DNA片段大小在200-800bp之间，符合CHIP实验要求。

分离的DNA片段混合池，送去测序公司，进行chip-seq测序及后续的生物信息学分析，筛选出其中可能的启动子序列。

CHIP实验步骤：

1)收集新鲜水稻幼苗1g，甲醛固定如上所述。

2)将超声破碎后的样品中加入2μl的OsTBP2抗体和2μl的OsTFIIB抗体，室温孵化4℃过夜；

3)向样品中加入带有Protein A磁珠，室温孵化1小时；分离磁珠，弃上清；

4)用500μl的清洗缓冲液清洗3次；1ml的ddH₂O清洗一次；

5)加入20μl的洗脱缓冲液洗脱，室温放置10分钟后吸取上清；

6)加入3μl中和缓冲液(1M Tris PH8.5)平衡体系；

7)加入蛋白酶K后65℃水浴2小时来解交联，加入终浓度1mM的糖原后用酒精沉淀脱盐，将样品重新溶解在20μl的ddH₂O中，得到CHIP产物。对CHIP产物采用定量和半定量PCR的方法检测，使用的引物是pal-755和pal-492(序列参见表1)。

图6中的半定量PCR做了28个循环处理。在一定的条件下，加入和不加入外源pal重组基因片段都同样能够检测到ChIP产物，表明有基因组DNA存在于CHIP分离物中。同时，重组TATA盒的结合蛋白OsTBP2和重组增强蛋白OsTFIIB能明显提高基因组DNA的收集。

通过对分离的DNA进行chip-seq测序和生物信息学分析，发现启动子达到总的DNA片段的60％以上。其中包括已知的启动子，如组成型启动子Actin1、β-Tubulin、EF1α；典型的诱导型启动子，如受干旱诱导的OsDREB1A启动子、受盐诱导的OsNHX1启动子等；而大部分的序列为功能未知基因的启动子。通过分析基因芯片数据库中这些未知基因的表达模式，来预测启动子的功能。

为研究这些未知启动子的功能，我们以其中的两个启动子(P1和P2)为例，根据测序序列，设计扩增引物，构建启动子与GUS的融合表达载体，通过烟草瞬时转化，在植物体内检测这两个启动子的活性和功能。

6、启动子的克隆及融合表达载体构建

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子P1和P2，按常规PCR体系，扩增程序采用如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后(图7A)，回收PCR扩增的目的片段，连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和BamHI进行双酶切验证。经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子。

回收SalI和BamHI双酶切后的启动子片段，同时SalI和BamHI线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的两个片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子与GUS基因融合的植物表达载体P1-1391和P2-1391，利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，提取阳性质粒，用SalI和BamHI进行酶切验证如图7B。

7、烟草瞬时转化及GUS酶活测定

烟草种子播种后，于25℃14h光照/20℃10h黑暗条件培养一个月用于农杆菌瞬时表达分析。挑取农杆菌单菌落接种至10ml YEP液体培养基，28℃210r/min培养过夜；按照1:100比例接种于培养液，28℃210r/min培养过夜；集菌后用重悬液(MS，10mmol/L MES medium(pH 5.6)，150μmol/L AS)调至OD600＝0.5～0.6；用微型注射器将重悬菌液注射到烟草叶片背面，将整株置于35℃处理不同时间后(12～48h)用于提取蛋白进行GUS活性测定。

GUS蛋白能催化底物4-MUG成荧光物质4-MU。4-MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。以每min水解4-MUG成1pmol的4-MU的酶量为一个单位；GUS蛋白的表达活性以每mg总蛋白的酶活力表示即4-MU pmol/min/mg protein。具体操作步骤如下：

1)取1.5mL的离心管，加入300μL GUS提取缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 7.0、10mMβ-巯基乙醇、l mM EDTA)，1％蛋白抑制剂，1％PMSF，置于冰上。取100mg样品在液氮中研磨成粉末，并将粉末转入离心管中，在冰上放置。震荡，室温3min；12,000rpm，4℃离心10min；取上清4℃保存备用。

2)蛋白质含量：采用Bradford法以一系列BSA标准蛋白建立标准曲线。取植物样品提取液10μL测定OD595，根据标准曲线查出蛋白浓度。

3)在111.2μL GUS提取缓冲液(无蛋白抑制剂)中加入125μL的4-MUG溶液中，37℃预热。

4)上述液体中加入12.5μL蛋白上清，立即取30μL加入到270μL Na₂CO₃反应终止液中(0时的空白对照)，37℃温浴，严格定时，5、15、30、45和60min各取30μL，加入270μL反应终止液，同时制备空白对照(GUS提取缓冲液与4-MUG溶液的混合液)。每个样品重复三次。

5)用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值(RFU)。去除空白值，根据标准曲线，换算成4-MU的浓度。

6)酶活力计算：以酶反应时间点对4-MU含量作图，所获方程的斜率即为GUS酶活反应的初始速度。酶活力单位定义为每分钟水解4-MUG生成1pmol 4-MU的酶为一个活力单位，计算各样品的酶活力(单位为4-MU pmol/min/mg protein)。

由图8所示的P1和P2的启动子活性可知，P1启动子经冷(4℃)诱导后活性上升明显，说明P1是一个冷诱导启动子(图8A)；P2启动子则是盐(200mM NaCl)处理后,活性提高了3～4倍，这说明P2是盐诱导启动子(图8B)。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.一种启动子批量捕获方法，其特征在于，所述方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA-蛋白因子”的复合体，应用改进的染色体免疫共沉淀技术(ChIP)，把包含有未知植物基因启动子片段的DNA分拣出来，实现启动子片段的有效富集。

2.根据权利要求1所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

1)取预定量待提取的植株材料，对植株材料中的植物细胞进行交联；

2)对所述植物细胞进行粉碎；

3)对所得产物进行离心沉积，获得含有“DNA-蛋白因子”复合体的清液；

4)将含有“DNA-蛋白因子”复合体的清液与所述蛋白因子的蛋白因子抗体接触，使所述蛋白因子与蛋白因子抗体相结合形成目标蛋白核酸结合体；

5)收集所述目标蛋白核酸结合体并对所述目标蛋白核酸结合体进行酶解，除去所述蛋白因子抗体；

6)从酶解产物中提取出所述DNA碎片。

7)对上述释放出的DNA片段进行测序和生物信息学比对，初步确定启动子片段的富集程度。

8)通过实验验证富集的启动子片段的功能，以及在其基础上进行启动子优化设计。

3.根据权利要求2所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述步骤1)包括：通过1％多聚甲醛交联植物细胞；所述步骤2)包括：对待提取植株材料进行超声粉碎；所述步骤4)包括：在含有DNA碎片的清液中加入Protein A磁珠，室温孵化预定时间。

4.根据权利要求2所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述方法还包括步骤7)，对所获得的DNA碎片进行定量或半定量PCR扩增。

5.根据权利要求2所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述蛋白因子包括OsTBP2及增强OsTBP2与TATA盒结合的OsTFIIB蛋白。

6.根据权利要求5所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤4)中添加OsTBP2及OsTFIIB蛋白的抗体。

7.根据权利要求5所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，所述步骤4)包括：所述的OsTBP2和OsTFIIB抗体，采取以下方法获得：

步骤(4.1)制备用于克隆OsTBP2和OsTFIIB的引物；

步骤(4.2)以水稻品种日本晴的cDNA序列为模板，利用步骤(4.1)中制备的所述引物，用DNA聚合酶对OsTBP2和OsTFIIB的编码序列进行扩增，并且将该扩增片段链接在TA载体(Invitrogen)上，将链接有基因片段的载体转化到大肠杆菌XL-Blue感受态细胞中，实现基因的克隆；

步骤(4.3)将正确克隆的基因片段再引入到pET30a载体上，随后转化进入大肠杆菌BL2(DE3)感受态细胞中，通过1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导表达，获得OsTBP2和OsTFIIB的重组蛋白；

步骤(4.4)利用OsTBP2和OsTFIIB重组蛋白生产相应抗体，对所获得的抗体进行亲和纯化。

8.根据权利要求5所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，

步骤1)包括：采用1％多聚甲醛溶液对生长10天左右的水稻幼苗进行固定，用超声波细胞破碎仪对幼苗提取液作破碎处理；

所述步骤4)包括：用OsTBP2和OsTFIIB重组蛋白抗体与含有“DNA-蛋白因子”复合体的清液混合，进而与其结合；用磁珠蛋白A收集结合有抗体的复合体，然后用蛋白酶K(10mg/ml)降解结合蛋白，释放出含有TATA盒的DNA片段；用水稻pal基因启动子作为模板通过半定量PCR来检测释放出的DNA片段中TATA盒的存在。

9.根据权利要求5所述的启动子批量捕获方法，其特征在于，

步骤7)包括：对所获得的DNA片段进行Chip-seq测序，通过对测序结果的生物学分析，筛选出其中可能的启动子片段。

步骤8)包括：从水稻基因组中克隆出启动子片段，构建启动子与报告基因(GUS或GFP)的融合表达载体，在烟草中进行瞬时转化或水稻中的稳定遗传转化，通过检测报告基因的表达模式，进一步确定分离的启动子的功能。