CN110872590B - 转录因子OsTBP2.1的应用 - Google Patents

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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Abstract

本发明公开了转录因子OsTBP2.1的应用。转录因子OsTBP2.1在提高水稻的产量中的应用；所述的水稻基因OsTBP2.1的ORF序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。作为本发明的一种优选，超表达转录因子OsTBP2.1以提高转基因水稻产量。本发明公开水稻基因OsTBP2.1超表达后提高了水稻的产量以及改变了OsNRT2.3a/b的表达模式。(图1和图2)本发明公开水稻蛋白OsTBP2.1与基因OsNRT2.3启动子83bp关键位点相结合。

Description

转录因子OsTBP2.1的应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及突变的基因OsNRT2.3启动子及其应用。
背景技术
启动子是基因的重要组成部分，它的主要功能是控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。
然而，如果一个基因的启动子或者转录序列发生SNP，所启动基因的表达程度会因此而受到影响，从而会影响到植物的生长。(Huang Z,Gan Z,He Y,et al.Functionalanalysis of a rice late pollen-abundant UDP-glucose pyrophosphorylase(OsUgp2)promoter[J].Molecular Biology Reports,2011,38(7):4291-4302.Vandana J,Vijay G,Saloni M,et al.Identification of Novel SNP in Promoter Sequence of TaGW2-6AAssociated with Grain Weight and Other Agronomic Traits in Wheat(Triticumaestivum L.)[J].PLOS ONE,2015,10(6):e0129400-.)有研究表明，控制基因转录的关键作用位点发生突变会降低对非生物胁迫的抗逆性。(Lee B H,Mai T T,Song J T,etal.The Arabidopsis thaliana NGATHA1transcription factor acts as a promoter ofa general differentiation program and a carpel identity factor[J].Journal ofPlant Biology,2017,60(4):352-357.)
发明内容
本发明的目的是提供一种含水稻基因OsTBP2.1的重组表达载体以及在水稻中的应用。
本发明还发现了能与OsNRT2.3启动子关键位点结合的转录因子，OsTBP2.1。
本发明另一个目的是提供了该转录因子的ORF和氨基酸序列。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
转录因子OsTBP2.1在提高水稻的产量中的应用；所述的水稻基因OsTBP2.1的ORF序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
作为本发明的一种优选，超表达转录因子OsTBP2.1以提高转基因水稻产量。
一种重组表达载体，含有水稻基因OsTBP2.1；所述的水稻基因OsTBP2.1的ORF序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体的出发载体为pTCK303载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的重组表达载体中所述的水稻基因OsTBP2.1通过相应酶切位点到pTCK303载体上。
本发明所述的重组表达载体在提高水稻的产量中的应用。
有益效果：
1.本发明公开水稻基因OsTBP2.1超表达后提高了水稻的产量以及改变了OsNRT2.3a/b的表达模式。(图1和图2)
2.本发明公开水稻蛋白OsTBP2.1与基因OsNRT2.3启动子83bp关键位点相结合。(图3)
附图说明
图1：OsTBP2.1超表达和突变体田间表型及OsTBP2.1和OsNRT2.3a/b的表达
(A)OsTBP2.1超表达和突变体田间表型
(B)OsTBP2.1超表达和突变体OsTBP2.1和OsNRT2.3a/b的表达；
其中WT-W27和WT-HY为野生型,OE198和OE200为OsTBP2.1超表达株系,1A-19324为OsTBP2.1突变体株系,下同
图2：OsTBP2.1超表达和突变体的产量
图3：酵母单杂验证蛋白OsTBP2.1和OsNRT2.3启动子关键位点关系
AbA表示金担子素
具体实施方案：
实施例1-83bp(OsNRT2.3编码区前(即ATG前)83bp)突变的获得及鉴定
1)总RNA的提取
水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，立即取叶迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右叶，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen,USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。
2)OsTBP2.1基因全长的克隆及超表达载体的构建
通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的
OsTBP2.1(AK108240)基因的启动子，用软件Primer 5.0设计引物序列(如下)，从水稻基因cDNA中扩增OsTBP2.1基因编码序列。
P1:5’-ATGGCTGCCGCGGCGGTGGA-3’(SEQ ID NO.3)
P2:5’-TCAGCGCTGCTGAGTTTTCC-3’(SEQ ID NO.4)
以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，以其为模板，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻基因OsTBP2.1序列(SEQ ID NO.1)。将得到的基因OsTBP2.1序列通过同源重组的方法构建到pTCK303表达载体上。
3)基因OsTBP2.1超表达和突变体材料的获得
将得到的pUbi::OsTBP2.1的表达载体通过农杆菌介导的方法转入到水稻中；其突变体则是T-DNA插入的突变体，通过二轮PCR鉴定得到纯合株系并进行下一步生物学实验。在得到超表达株系OE198和OE200和突变体株系1A-19324后鉴定其基因OsTBP2.1以及OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的表达效果；并且在田间测其单株产量，以观测基因OsTBP2.1对水稻生长发育以及其他基因表达的影响。结果见图1和图2。
4)酵母单杂系统验证
按照Clontech公司的
Figure GDA0003498568630000031
Gold Yeast One-Hybrid LibraryScreening System User Manual的使用说明进行操作。
诱饵序列为：tttccgctatgctataagagctgac(OsNRT2.3编码序列前83bp处)，结果见图3。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 转录因子OsTBP2.1的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 627
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atggcggcgg cggaggcggc ggcggaggcg gcggcggcgc tggaggggag cgagcccgtg 60
gacctggtca agcacccctc cggcatcatc cccacgctcc aaaacatcgt gtcgacggtc 120
aatttggatt gcaaattaga cctcaaagct atagctttgc aagcacgcaa tgcagaatat 180
aatccaaagc gttttgctgc agttatcatg agaataagag aaccgaaaac tacagctctg 240
atatttgcat cgggtaaaat ggtatgtact ggggcaaaga gcgaacaaca atcaaagctt 300
gcagcaagaa agtatgctcg tattatccaa aagcttggct ttgctgctaa gtttaaggac 360
ttcaagattc agaacattgt tggttcttgt gatgttaaat ttccaatcag gctggaggga 420
cttgcatatt ctcatggtgc tttctcaagt tatgagcctg aactctttcc tggtctgata 480
tatcggatga agcaaccgaa gattgttctt ctgatttttg tttcaggcaa gattgttttg 540
accggagcaa aggtgaggga tgagacgtat accgcctttg agaacatata ccctgtgcta 600
acagagttca gaaaagtcca gcaatga 627
<210> 2
<211> 208
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
Met Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Leu Glu Gly
1 5 10 15
Ser Glu Pro Val Asp Leu Val Lys His Pro Ser Gly Ile Ile Pro Thr
20 25 30
Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Asp Cys Lys Leu Asp Leu
35 40 45
Lys Ala Ile Ala Leu Gln Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro Lys Arg
50 55 60
Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Lys Thr Thr Ala Leu
65 70 75 80
Ile Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala Lys Ser Glu Gln
85 90 95
Gln Ser Lys Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg Ile Ile Gln Lys Leu
100 105 110
Gly Phe Ala Ala Lys Phe Lys Asp Phe Lys Ile Gln Asn Ile Val Gly
115 120 125
Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly Leu Ala Tyr Ser
130 135 140
His Gly Ala Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly Leu Ile
145 150 155 160
Tyr Arg Met Lys Gln Pro Lys Ile Val Leu Leu Ile Phe Val Ser Gly
165 170 175
Lys Ile Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Asp Glu Thr Tyr Thr Ala
180 185 190
Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Val Leu Thr Glu Phe Arg Lys Val Gln Gln
195 200 205
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctgccg cggcggtgga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcagcgctgc tgagttttcc 20

Claims (3)

1.转录因子OsTBP2.1在提高水稻的产量中的应用；所述的转录因子 OsTBP2.1的ORF序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于超表达转录因子OsTBP2.1以提高转基因水稻产量。
3.含有转录因子 OsTBP2.1的重组表达载体在提高水稻的产量中的应用，所述的转录因子 OsTBP2.1的ORF序列为SEQ ID NO.1。
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