CN104962623A - 转基因成分的数字pcr检测方法 - Google Patents

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朱水芳
朱鹏宇
王晨光
许文涛
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Abstract

本发明提供了一种转基因成分的数字PCR检测方法，所述方法包括利用CaMV35s启动子引物序列和探针序列以及NOS终止子引物序列和探针序列进行数字PCR扩增反应。利用本发明所提供的数字PCR检测方法可以实现对转基因动植物样品的精准检测，灵敏度可以达到0.1％。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测转基因成分的有效方法。

Description

转基因成分的数字PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种转基因成分的数字PCR检测方法。
背景技术
1988年，全球首例转基因作物耐草甘膦品系转基因大豆由Hinchee等人(Hinchee,1988)研发。自此之后转基因作物得到了飞速的发展，已经对传统的农业技术产生了很大的冲击。转基因作物的迅猛发展使得转基因食品更多地流入了商品市场，这一方面极大地满足并丰富了人们的物质生活需求；另一方面，人们对转基因食品食用安全性的关注也越来越多，其中最核心的关注在于外源基因是否会对人体和环境产生影响。世界各国针对转基因食品出台了严格的管理制度以预防转基因生物可能存在的安全担忧。食品转基因成分检测是转基因食品标识以及监管的首要工作，检测技术的发展直接影响转基因生物安全管理的成败。目前对于转基因作物及食品的研究，既有常规的定性检测技术和定量检测技术，也有近几年比较关注的安全分析技术。
数字PCR(Digital-PCR)是一项检测和定量核酸的新技术，其基本原理是通过将微量样品作大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松概率分布公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。该技术不依赖于扩增曲线的循环阈值，也不需要看家基因和标准曲线，是DNA绝对定量方法。在基因拷贝数变化分析(copy number variation,CNV)(Qin etal.,2008)、遗传突变检测(Yung et al.,2009)、基因分型(Lo et al.，2007)、基因定量(Warren et al.，2010)、单细胞基因表达(Guo et al.,2010)等方面的研究取得了突破性的发展，在临床方面为癌症、肿瘤等疾病检测提供了新的诊断工具。在转基因检测方面，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR在转基因检测中检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，文章表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。总体而言，数字PCR技术目前更多地应用于医学诊断方面，已成为临床应用方面最具潜力的诊断技术之一，其在转基因检测的研究方面还处于起始阶段。现行的数字PCR检测方法都是需要经过样品前处理过程的，但是在实际检测中，前处理过程往往会导致实验结果产生偏差。所以现有的数字PCR检测方法是不适合直接作为转基因成分检测方法的。
为了对样品中的转基因成分进行准确的定量有必要提供一种不需要进行样品前处理过程的数字PCR检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种不需要进行样品前处理步骤的转基因成分的数字PCR检测方法。
本发明提供了一种转基因成分的数字PCR检测方法，所述方法包括利用以下引物和探针进行数字PCR扩增反应：
(1)CaMV35s启动子引物序列和探针序列：
CaMV35s-F：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
CaMV35s-R：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
CaMV35s-P：FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1；
(2)NOS终止子引物序列和探针序列：
NOS-F：ATCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-R：ATTGCGGGACTCTAATCATA
NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1。
本发明所提供的方法选取转基因作物中的CaMV35s启动子和NOS终止子为靶序列进行数字PCR扩增反应。
优选的，所述数字PCR扩增的扩增程序为：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
优选的，所述数字PCR扩增的反应体系包括：
所述反应体系适合于从任何动植物组织中提取得到的基因组样品，可以实现对转基因作物的精准检测。
优选的，所述方法包括使用数字PCR芯片将数字PCR反应体系分割成单独的体系，对每个单独的体系进行荧光定量PCR扩增并收集每个单独的体系中的荧光信号，获得荧光值和扩增曲线。
本发明所提供的方法将每一个加样孔作为一个整体，加入转基因作物数字PCR扩增体系，使用数字PCR扩增平台进行实时荧光扩增，通过监测每一个反应孔中的荧光信号，获得所有反应孔中的总体扩增曲线和热点图。
在本发明所提供的方法中，检测结果的判定按照以下方式进行：
(1)在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测基因组中含有转基因作物成分；
(2)阳性质控品反应孔中产生阳性结果以及阴性质控品反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则实验无效，需要重新更换反应试剂，并重新进行；
(3)当待测样品反应管中为阴性结果时，则说明未检测到转基因作物成分；待测样品反应管中为阳性结果，则说明待测样品中含有转基因作物成分。
在本发明所提供的方法中，可以利用本领域常规的数字PCR检测芯片和仪器完成检测过程。
本发明所提供的方法可以直接对待检测样品的基因组提取物进行检测，从而省略了现有的数字PCR方法中的样品预处理步骤，使得检测过程简便易行，避免了预处理步骤对检测结果准确性的不良影响。
本发明还提供了一种转基因成分的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)CaMV35s启动子引物序列和探针序列(SEQ ID No.1-3所示的核苷酸序列)：
CaMV35s-F：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
CaMV35s-R：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
CaMV35s-P：FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1；
以及(2)NOS终止子引物序列和探针序列(SEQ ID No.4-6所示的核苷酸序列)：
NOS-F：ATCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-R：ATTGCGGGACTCTAATCATA
NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1。
本发明还提供了所述的数字PCR检测方法在转基因作物成分检测中的应用，以及本发明所述试剂盒在转基因作物成分检测中的应用。
利用本发明所提供的数字PCR检测方法和试剂盒可以实现对转基因动植物样品的精准检测，灵敏度可以达到0.1％。此外，该方法步骤简便易于操作，因此在实际应用中具有很大的灵活性，是一种检测转基因成分的有效方法。
附图说明
图1为芯片法数字PCR结果扩增热点图。
图A为玉米ZssIIb内参基因扩增曲线与热点图；图B为CaMV35s启动子扩增曲线与热点图；图C为NOS终止子扩增曲线与热点图。
图2为不同转基因品系CaMV35s启动子和NOS终止子的检测拷贝数。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
1.实验材料和方法
1.1实验材料：本实验用到的转基因玉米样品：Bt176阳性样品和MIR162阳性样品，以及其各自的亲本非转基因样品均储存于中国检验检疫科学研究院。芯片厂家为Fluidigm，型号为48.770 Digital ArrayChip，仪器为Fluidigm公司的BioMark系统。
1.2引物设计：反应用的引物和探针如表1所示。
表1
引物、探针名称 引物、探针序列(5’-3’)
CaMV35s-F SEQ ID No.1
CaMV35s-R SEQ ID No.2
CaMV35s-P SEQ ID No.3
NOS-F SEQ ID No.4
NOS-R SEQ ID No.5
NOS-P SEQ ID No.6
1.3转基因作物基因组提取
(1)将作物组织样品研磨并彻底风干；
(2)用分析天平称取100mg样品，加入400μL AP1缓冲液以及4μL的RNase A，剧烈震荡混匀后，65℃下水浴20min，期间震荡混匀2-3次；
(3)将上述体系从水浴锅中去除，加入130μL P3缓冲液，混匀置于冰上冰浴5min；
(4)将上述体系从冰上取出，置于离心机中14000rpm离心5min；
(5)将上述体系中的上清液用枪头取出，置于QIAshredderMini spin column中，14000rpm离心2min；
(6)将上一步的滤液转入到新的离心管中，加入1.5倍体积的AW1缓冲液，用枪头充分混匀；
(7)将上一步的混合溶液转移至DNeasy Mini spin column中，每一次转移700μL，多出的体系分多次转移，将DNeasy Mini spincolumn置于离心机中8000rpm离心1min，离心完成后弃滤液；
(8)将上一步的DNeasy Mini spin column转移至新的2mL离心管中，加入500μL AW2缓冲液，14000rpm离心1min，弃滤液；
(9)重复步骤8；
(10)将上一步得到的DNeasy Mini spin column放入新的离心管中，14000rpm离心2min，彻底除去滤膜上的AW2缓冲液，并彻底晾干滤膜；
(11)将50μL无菌去离子水点在滤膜上，充分溶解基因组样品10min，8000rpm离心1min收集滤液。通过紫外分光光度法测定所得基因组的浓度和纯度，将基因组稀释至50ng/μL待用。
1.4数字PCR扩增反应
(1)将蓝色保护膜从芯片上取下，将control line fluid注入芯片上下两侧的孔中，放入IFC controller MX中，执行Prime(167×)操作；
(2)数字PCR加样孔中的每一个体系为4μL，4μL的体系中包括2×MasterMix 2μL，芯片20×Loading Reagent 0.4μL，引物探针混合液0.2μL，50ng/μL基因组模板1μL，无菌去离子水0.4μL。阴性对照孔中以无菌去离子水代替模板。
(3)将上述体系加入芯片的加样孔中，并在结合孔中加入10μL1×GE Sample Loading Reagent，加样过程中不能产生气泡；
(4)上样完成后，将芯片放回Controller中执行Load(167×)操作。Load完毕后除去芯片上的灰尘；
(5)将芯片放入Biomark HD System中，采用FAM-MGB单荧光通道，设置如下反应程序：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
(6)出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，这个反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法：在同一组的三个平行组里面，至少出现一个组还有阳性扩增孔，就说明检测基因组中含有转基因作物成分。芯片法数字PCR结果扩增曲线图和热点图如图1所示。
1.5数字PCR引物探针组特异性与稳定性验证实验
在反应体系中加入不同品系的模板(MON810、MON863、TC1507、BT176、MIR604、MIR162、GA21、T25、NK603和阴性样品(即玉米非转基因)，通过1.2-1.4给出的数字PCR检测方法对不同模板的筛选元件进行扩增，图2的结果说明本文所述的引物探针组特异性和稳定性良好；
1.6数字PCR扩增体系灵敏度验证实验
本实验采用Bt176作为CaMV35s启动子的模板，MIR162作为NOS终止子的模板。用亲本阴性基因组对转基因阳性样品进行梯度稀释，稀释后的转基因作物的相对含量为50％，10％，1％，0.5％，0.1％。通过1.2-1.4给出的数字PCR检测方法进行验证。
结果显示本体系在0.1％转基因作物相对浓度的下，可以产生稳定的扩增，即本数字PCR扩增体系的灵敏度为0.1％。
1.7数字PCR扩增体系重复性验证实验
本实验采用实验室内重复验证本文所述体系的重复性。通过1.2-1.4给出的数字PCR检测方法进行实验，通过不同人员分批次进行实验，得到实验结果。实验结果表明，该反应体系可重复性良好。结果如表2-4所示。其中A，B代表不同的操作人员；转基因含量表示各实验样品的质量百分比。
表2
表3
表4
转基因含量2(％) 5％ 1％ 0.5％ 0.4％ 0.3％ 0.2％ 0.1％
不同操作人员的CaMV 35s相对标准差 3.02 10.18 17.41 10.10 35.95 20.00 44.72
不同操作人员的NOS相对标准差 6.16 12.37 13.13 16.97 33.17 38.49 35.36
1.8数字PCR扩增体系盲样验证实验
以实验室配置的样品进行双盲实验。本部分实验配置了八组成分不同的双盲样品，通过1.1-1.4给出的数字PCR检测方法进行转基因成分筛查实验。实验结果表明，本文所述反应体系可以准确的鉴定盲样中的转基因作物成分。结果如表5所示。
表5
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种转基因成分的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括利用以下引物和探针进行数字PCR扩增反应：
(1)CaMV35s启动子引物序列和探针序列：
CaMV35s-F：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
CaMV35s-R：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
CaMV35s-P：FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1；
(2)NOS终止子引物序列和探针序列：
NOS-F：ATCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-R：ATTGCGGGACTCTAATCATA
NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的数字PCR检测方法，其特征在于，所述数字PCR扩增的扩增程序为：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
3.根据权利要求2所述的数字PCR检测方法，其特征在于，所述数字PCR扩增的反应体系包括：
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的数字PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括使用数字PCR芯片将数字PCR反应体系分割成单独的体系，对每个单独的体系进行荧光定量PCR扩增并收集每个单独的体系中的荧光信号，获得荧光值和扩增曲线。
5.转基因成分的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)CaMV35s启动子引物序列和探针序列：
CaMV35s-F：ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT
CaMV35s-R：CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT
CaMV35s-P：FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1；
以及，
(2)NOS终止子引物序列和探针序列：
NOS-F：ATCGTTCAAACATTTGGCA
NOS-R：ATTGCGGGACTCTAATCATA
NOS-P：FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1。
6.权利要求1-4中任意一项所述的数字PCR检测方法或权利要求5所述的试剂盒在转基因作物成分检测中的应用。
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