CN106755488A - 应用rpa技术对转基因玉米bt11品系特异性鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法。该方法首先提取待测样品的DNA作为模板,利用筛选的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT11成分。本发明根据外援插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物,从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT11成分的引物及探针组合,首次提供了转基因玉米BT11品系特异性的RPA检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种品系鉴定方法,特别涉及一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定。
背景技术
PCR技术是DNA扩增最常用的方法,但这一方法有其自身的弊端,如需要精密的仪器以及繁琐的试验流程、不能用于现场检测等。核酸等温扩增技术(isothermal nucleicacid amplification technology)是一种新型的扩增技术,只需在恒定温度条件下即可进行反应,且具有简便、快速、灵敏等优点,相对于PCR技术来说有很大的优势。目前等温扩增技术主要有四种,包括环介导的等温扩增(LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASDA)、链置换扩增(SDA)以及重组酶介导的等温扩增(RPA)。
RPA技术模拟了生物体内DNA复制的过程,重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合,形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子,对模板DNA序列进行比对,搜索出与之匹配的序列。在单链结合蛋白的帮助下,双链模板DNA解链,引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端,在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸,并形成新的DNA。RPA的引物长度在35nt左右,在设计引物时应避免前后引物之间形成二级结构、GC含量尽量控制在40%-60%之间以及尽量避免引物出现重复序。RPA反应的探针也需具有特殊的结构和修饰方式,在探针的中后部选择两个T碱基,各标记一个荧光集团(FAM和BHQ1),在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer),该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割,使两个荧光集团分离产生荧光信号,且特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果,RPA荧光检测技术在20分钟内就可以完成,因此在短时间内就可以快速扩增出目的片段。
转基因玉米BT11是先正达种子有限公司研发的产品,具有抗虫和耐除草剂特性,是目前用于加工食品和饲料较多的转基因玉米品系之一。BT11转基因玉米已经在美国(1996)、欧盟(1998)、中国(2004)等国家和地区进行大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。在已报道的对转基因玉米BT11检测方法中,主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测,也有应用于环介导的等温扩增(LAMP)技术对其进行检测,目前还没有利用RPA技术对其进行基因特异性鉴定。
发明内容
针对上述领域的空白,本发明提供了准确、快速、简便检测转基因玉米BT11品系特异性的检测方法。
一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的引物和探针,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种鉴定转基因玉米BT11品系的试剂盒,包含上述的引物和探针。
一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法,提取待测样品的DNA作为模板,利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT11成分;如果得不到扩增曲线,则证明所检样品不含有转基因玉米BT11成分。
所述RPA快速扩增的反应体系为50μl,包括10μmol/L的引物各2μl,10μmol/L的探针0.5μl,模板DNA 50ng,缓冲溶液Buffer 29.5μl,其余用去离子水补齐。
所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟;同时进行实时荧光检测。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明根据外援插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物,从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT11成分的引物及探针组合。以转基因玉米BT11为模板,利用该对引物和探针进行荧光检测,可以得到明显的扩增曲线,以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线。将模板DNA用水稀释至2000,1000,500,100,50,10个拷贝,结果只有10拷贝时未能扩增,其它都有扩增曲线,具有较高的灵敏度。本发明首次提供了转基因玉米BT11品系特异性的RPA检测方法。
附图说明
图1为BT11引物筛选Basic电泳图,其中,1:100bp Maker;2:BT11-F1与BT11-R1;3:BT11-F2与BT11-R2;4:BT11-F3与BT11-R3;5:BT11-F4与BT11-R4;6:100bp Maker;7:BT11-F5与BT11-R5;8:BT11-F6与BT11-R6;9:BT11-F7与BT11-R7;10:BT11-F8与BT11-R8;11:100bp Maker。
图2为BT11引物筛选实时荧光检测图,其中,1:BT11-F1与BT11-R1;2:BT11-F2与BT11-R2;3:BT11-F3与BT11-R3;4:BT11-F4与BT11-R4;5:BT11-F5与BT11-R5;6:BT11-F6与BT11-R6;7:BT11-F7与BT11-R7;8:BT11-F8与BT11-R8。
图3为BT11特异性检测图,其中,1:转基因玉米BT11;2:转基因玉米MON810;3:转基因玉米MON863;4:转基因玉米MON89034;5:转基因玉米NK603;6:转基因玉米BT176;7:非转基因玉米;8:水。
图4为灵敏度检测图,从1到8模板拷贝数依次为2000;1000;500;100;50;10;0。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件,或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1
首先根据转基因玉米BT11转化体特异性区域设计引物及探针。引物长度为35nt左右,RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选,个别碱基的增减或替换都会对实验结果产生重要影响。本实验中设计了大量的引物,并从中筛选出来有一对灵敏度高且特异性好的引物用于RPA荧光检测。引物和探针序列见表1。
表1
注:FAM:发光集团;dSpacer:脱碱基位点;BHQ1:淬灭集团;block:封闭集团,本次使用的碳酸化。
1.实验材料
1.1植物材料
转基因玉米BT11标准物质,转基因玉米MON810标准物质,转基因玉米MON89034标准物质,转基因玉米MON863标准物质,转基因玉米NK603标准物质,转基因玉米BT176标准物质,非转基因玉米等材料。
1.2酶与试剂
分子生物学试剂,TwistAmp DNA amplification Exo Kits购自TwistDX公司,TwistAmp DNA amplification Basic Kits购自TwistDX公司,其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。
1.3实验仪器
DNA处理仪器:低温混合球磨仪ΜM400(Retsch)
荧光检测仪:RPA扩增检测仪(Twista)
其它仪器包括:恒温水浴锅、电子天平、离心机、纯水仪等。
2.实验方法和过程
2.1玉米基因组DNA的提取
以转基因玉米标准品粉末为材料,依照TianGen Plant Genomic DNA Kit试剂盒的操作手册,进行玉米DNA的提取。
1.取充分碾磨新鲜玉米粉末150mg,加入700μl 65摄氏度预热的缓冲液GP1,64℃水浴60min,期间颠倒离心管数次以混合样品。
2.加入1:1的酚/氯仿进行抽提,12000rpm离心5min。
3.取上清加入700μl氯仿充分混匀,12000rpm离心5min。
4.取上清加入700μl缓冲液GP2,充分混匀。
5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12000rpm离心30sec,弃废液
6.向吸附柱中加入500μl缓冲液GD,12000rpm离心30sec,弃废液
7.向吸附柱中加入600μl漂洗液PW,12000rpm离心30sec,弃废液
8.重复7
9.将吸附柱CB3放入收集管,12000rpm空转2min,弃废液,室温放置10分钟
10.将吸附柱CB3转入干净收集管,滴加50μl水,室温放置10min,12000rpm收集到离心管中。
2.2DNA浓度和纯度测定
使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度,并用去离子双蒸水调节DNA浓度至50ng/μl。
2.3引物的筛选
本实施例中用于RPA方法扩增的靶标序列为玉米基因组与外援插入DNA的5’端部分序列。针对这一转化体特异性序列,设计RPA探针并在探针上游与下游分别设计了8条正向引物、8条反向引物。筛选过程中,首先使用RPA-Basic试剂盒进行扩增并进行电泳,筛选能够扩增正确条带的引物再进行RPA-EXO实验。
2.4引物的扩增
RPA扩增体系为:总体系50μl,Rehydration Buffer 29.5μl,280μm MagnesiumActate 2.5μl,引物各2.4μl(10uM),玉米DNA 1μl(50ng/μl),剩余用水补足。
引物扩增程序:RPA扩增检测仪39摄氏度反应30分钟,酚:氯仿1:1抽提,电泳。
2.5特异性检测
将筛选出的较好引物对进行特异性检测,检测材料分别为转基因玉米BT11标准物质,转基因玉米MON810标准物质,转基因玉米MON89034标准物质,转基因玉米MON863标准物质,转基因玉米NK603标准物质,转基因玉米BT176标准物质,非转基因玉米。相同50μl体系,进行RPA-EXO实验。
2.6灵敏度检测
将BT11基因组DNA分别稀释如下的拷贝数:400,200,100,20,10,2。相同50μ反应体系各加入5μl的DNA进行RPA-EXO实验测试灵敏度。
3.实验结果
根据转化体特异性序列设计的正向引物和反向引物及探针,运用RPA-Basic试剂盒首先确定能够扩增正确片段的引物(图1),其中7孔道引物对BT11-F5与BT11-R5扩增条带较好,后改名为BT11-RPA-F(序列如SEQ ID NO.1)与BT11-RPA-R(序列如SEQ ID NO.2)运用RPA-EXO试剂盒进行特异性实时荧光筛选(图2),其中5号线起飞时间以及扩增效果较好,其引物对与Basic实验7孔道引物对一致。
从上述中筛选出的引物,以转基因玉米BT11为模板可以得到明显的扩增曲线,以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线(图3)。模板DNA拷贝数分别为2000,1000,500,100,50,10个拷贝,结果只有10拷贝未扩增其它都有扩增曲线(图4),说明本发明设计引物和方法鉴定转基因玉米BT11具有较高的灵敏度和准确性。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定
<130> 1111
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT11-RPA-F
<400> 1
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttct 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT11-RPA-R
<400> 2
tcgatgataa atggccacac aacccccatt tttga 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BT11-RPA-P
<400> 3
aaatctgtag gtgttagcct ctagtattga aaatggt 37
Claims (5)
1.一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的引物和探针,其特征在于,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种鉴定转基因玉米BT11品系的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的引物和探针。
3.一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法,其特征在于,提取待测样品的DNA作为模板,利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测,如果得到扩增曲线,则证明所检样品含有转基因玉米BT11成分;如果得不到扩增曲线,则证明所检样品不含有转基因玉米BT11成分。
4.根据权利要求3所述的应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法,其特征在于,所述RPA快速扩增的反应体系为50μl,包括10μmol/L的引物各2μl,10μmol/L的探针0.5μl,模板DNA 50ng,缓冲溶液Buffer 29.5μl,其余用去离子水补齐。
5.根据权利要求4所述的应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法,其特征在于,所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为:RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟;同时进行实时荧光检测。
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