CN109337959A

CN109337959A - 一种转基因玉米mon810的rpa检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109337959A
Application number: CN201811222808.9A
Authority: CN
Inventors: 汪小福; 陈笑芸; 徐俊锋; 彭城; 徐晓丽; 魏巍
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米MON810的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法。引物组由2条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。检测试剂盒包括检测引物与探针溶液、Buffer A、Buffer B和阳性对照。检测方法是采用特异性引物及探针在重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶和核酸外切酶的作用下，在37～42℃对样品DNA模板进行扩增，通过对探针荧光信号收集的方法，判断样品是否含有转基因玉米MON810成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点，适合现场检测。

Description

一种转基因玉米MON810的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification， RPA)快速检测转基因玉米MON810的引物与探针组合、试剂盒和检测方法。

背景技术

2016年全球转基因作物种植面积高达1.851亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜。转基因玉米MON810是孟山都公司研发的一种抗虫转基因玉米，已被我国批准进口用作加工原料。针对转基因玉米MON810开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。

转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长 (约3～4h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。

RPA技术是一种新型的基因扩增技术，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸 (寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并在链置换DNA聚合酶作用下启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件(37～42℃)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在30分钟内完成；③高特异性：重组酶与引物形成复合体，特异的寻找靶标序列，再加上探针的特异识别与信号收集，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：通过扩增荧光曲线的有无，对扩增产物进行便捷的检测。

RPA方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用RPA方法检测转基因玉米MON810的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种RPA检测转基因玉米MON810的引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测转基因玉米MON810的方法和试剂盒。

本发明具体通过以下技术方案实现：

根据转基因玉米MON810的转化体特异性的核苷酸序列，设计转基因玉米 MON810的RPA检测引物，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，其核苷酸序列具体如下所示：

正向引物F：TCAACGTGCCCGGTACTGGTTCCCTCTGGC(SEQ ID NO： 1)；

反向引物R：CTATTGTAAAGCCAAACTCAGATGAATCAA(SEQ ID NO：2)。

上述引物在RPA检测转基因玉米MON810种质资源中的应用。

本申请另一方面提供了RPA检测转基因玉米MON810种质资源的探针，该探针与上述引物配合使用，所述的探针核苷酸序列为：

P：GGCTGCACCGACCTGAACGAGGACTTTCGG[FAM-dT]A[THF]CC[BH Q1-dT]TCTTTCATTTCCG-C3-Spacer(SEQ ID NO：3)。

一种转基因玉米MON810的RPA检测试剂盒，包括上述正向引物F、反向引物R和探针P。

所述的RPA检测试剂盒具体包括以下组分：

1)检测引物与探针溶液：正向引物F(10μmol/L)，反向引物R(10μmol/L)，探针P(10μmol/L)；

2)Buffer A：包含50mmol/L Tris-HCl、pH 8.4，80mmol/L KAc，2mm ol/L DTT，3mmol/L ATP，200μmol/L dNTPs，20mmol/L C₄H₁₀N₃O₅P，100 ng/μL creatine kinase，5％20mol/L PEG，600ng/μL SSB，125ng/μL uvsX， 25ng/μL uvxY，30ng/μL Bsu和96ng/μL ExoⅢ；

3)BufferB：10mmol/L MgAc；

4)阳性对照，转基因玉米MON810粉末(含量为0.1％)。

在上述试剂盒的基础上，本发明另一方面公布了一种转基因玉米MON810 的RPA检测方法，具体包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)配制待测样品的RPA检测反应体系：在200μL PCR反应管内加入模板 DNA 2μL、检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0.5μL、Buffer A溶液23.5μL、Buffer B溶液2μL，总体积为30μL；

3)运行RPA扩增与结果判断：将PCR反应管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育20min，根据荧光曲线扩增的有无，实时分析扩增结果。

本发明的有益效果：

本发明基于重组酶聚合酶扩增技术检测转基因玉米MON810种质资源，通过实验证明，本发明提供的转基因玉米MON810的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。

附图说明

图1是本发明实施例4中进行特异性和灵敏度检测的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1转基因玉米MON810 RPA检测引物和探针的设计及筛选

本发明中MON810 RPA检测的目标区域为MON810的转化体特异性序列，即外源插入片段与玉米基因组的连接区序列，其中的正反向引物分别位于连接点的两侧，而探针则覆盖了连接区域。

(1)引物设计

分别在连接点的两侧各设计5条引物，引物长度为30-32bp,本发明筛选引物序列如下：

F1:TCAACGTGCCCGGTACTGGTTCCCTCTGGC；

F2:CGCTGAGCGCCCCCAGCCCGATCGGCAAGT；

F3:GTGCCCACCACAGCCACCACTTCTCCTTGG；

F4:CAGCCACCACTTCTCCTTGGACATCGATGT；

F5:CCCCAGCCCGATCGGCAAGTGTGCCCACCA；

R1:GCTGCAGGTGGTCTTACATCTAAGAAGGAT；

R2:TTCTCATGATGAAAGCACTAGTACTGCCAA；

R3:CAAAAGGACCTGACTGCTCGCAAGCAAATT；

R4:GTCTTACATCTAAGAAGGATTCTCATGATG；

R5:CTATTGTAAAGCCAAACTCAGATGAATCAA。

(2)探针设计

设计原则：探针序列覆盖连接区域，探针的长度为46-52bp，在中间相距1 -5个碱基的胸腺嘧啶(T)上分别标记荧光基团，在5’端T上标记荧光基团(如 FAM)，在3’端T上标记猝灭基团(如BHQ1)，在两个荧光基团的中间位置设计脱碱基位点类似物，如四氢呋喃(THF)，在探针的3’末端用C3标记，阻止其延伸扩增。当探针与目标区域配对，核酸外切酶(exo III)识别THF位点并切割探针，使荧光基团和猝灭基团分离，从而产生荧光。

MON810-P:GGCTGCACCGACCTGAACGAGGACTTTCGG[FAM-dT]A[THF] CC[BHQ1-dT]TCTTTCATTTCCG-C3-Spacer。

(3)引物与探针的筛选策略

选择一条正向引物与所有的反向引物配对，分别结合探针进行RPA扩增，选择出扩增效果最佳的一条反向引物，现利用最佳的反向引物与其它的正向引物配对扩增，从而选择出最佳的正向引物，本发明中最佳引物对为F1/R5。

实施例2RPA反应体系的优化

(1)扩增温度的确定

在RPA其它扩增条件一致的情况下，在30-45℃的温度区间内进行RPA扩增，根据不同温度下荧光信号强度的强弱确定RPA的最佳扩增温度，最终确定最佳扩增温度为39℃。

(2)引物与探针的浓度确定

引物与探针的配制浓度一样，均为10μmol/L，RPA其它扩增条件一致，在 39℃的最佳扩增温度下扩增，分别对不同浓度引物与探针组合进行扩增，根据不同组合下荧光信号强度的强弱确定RPA的最佳引物与探针浓度，最终确定最佳浓度为，在总体积为30μL的RPA扩增体系中，检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0.5μL。

实施例3试剂盒及其检测方法的建立

按下列配方制备转基因玉米MON810的RPA检测试剂盒，每个试剂盒的规格为50次反应：

(1)检测引物与探针溶液：合成正向引物F、反向引物R和探针P，将引物和探针干粉用灭菌去离子水或超纯水分别配成浓度为10μmol/L的母液，其中引物序列分别为：

正向引物F：TCAACGTGCCCGGTACTGGTTCCCTCTGGC(SEQ ID NO： 1)；

反向引物R：CTATTGTAAAGCCAAACTCAGATGAATCAA

(SEQ ID NO：2)；

探针P：GGCTGCACCGACCTGAACGAGGACTTTCGG[FAM-dT]A[THF]C C[BHQ1-dT]TCTTTCATTTCCG-C3-Spacer(SEQ ID NO：3)。

(2)BufferA(1.5mL)：包含50mmol/L Tris-HCl、pH 8.4，80mmol/L KAc， 2mmol/LDTT，3mmol/L ATP，200μmol/L dNTPs，20mmol/L C₄H₁₀N₃O₅P，100 ng/μL creatine kinase，5％20mol/L PEG，600ng/μL SSB，125ng/μL uvsX，25 ng/μL uvxY，30ng/μL Bsu和96ng/μLExoⅢ。

(3)Buffer B(120μL)：10mmol/L MgAc。

试剂盒中还包括阳性对照：转基因玉米MON810粉末(含量为0.1％)。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

(1)提取待测样品的基因组DNA：传统DNA提取方法或其它同效商品化试剂盒，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25ng/μL；

(2)配制待测样品的RPA检测反应体系：采用30μL的反应体系，200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2μL、检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0. 5μL、Buffer A溶液23.5μL、Buffer B溶液2μL

(3)运行RPA扩增与结果判断：将PCR反应管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育20min，根据荧光曲线扩增的有无，实时分析扩增结果，若有典型的荧光扩增曲线出现则为阳性，若无扩增曲线则为阴性。

实施例4试剂盒及检测方法的特异性与灵敏度

对实施例3所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品既包括转基因玉米样品，也包括一些常见的转基因大豆、水稻、棉花、油菜样品，分别为：

(1)S1：转基因玉米MON810(含量为1％)；

(2)S2：转基因玉米MON810(含量为0.1％)；

(3)S3：转基因玉米MON810(含量为0.05％)；

(4)S4：转基因玉米混合样品(含有Bt11、Bt176、MON863、NK603、GA21、 TC1507、T25，每种转基因成分的含量为1％)；

(5)S5：转基因大豆混合样品(含有GST40-3-2、A5547-127、A2704-12、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、356043，每种转基因成分的含量为1％)；

(6)S6：转基因水稻混合样品(含有M12、KF-8、KF-2、TT51-1、KF-6、KMD-1、 G6H1，每种转基因成分的含量为1％)；

(7)S7：转基因棉花混合样品(含有MON1445、MON531、MON15985、MON88913、GHB614，每种转基因成分的含量为1％)；

(8)S8：转基因油菜混合样品(含有MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45，每种转基因成分的含量为1％)；

(9)S9：非转基因玉米对照；

(10)S10：非转基因作物对照(含有非转基因大豆、水稻、棉花、油菜)；

(11)S11：超纯水空白对照。

结果如图1所示，本实施例中仅在含有转基因玉米MON810的样品中有曲线扩增曲线，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对转基因玉米MON810具有很好的特异性，同时，在含有转基因玉米MON810含量分别为1％，0.1％及0.05％的样品中都有良好扩增曲线，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对转基因玉米 MON810具有很好的灵敏度，至少达到0.05％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种检测转基因玉米MON810的引物、探针及试剂盒和方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaacgtgcc cggtactggt tccctctggc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctattgtaaa gccaaactca gatgaatcaa 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgcaccg acctgaacga ggactttcgg acctctttca tttccgc 47

Claims

1.一种转基因玉米MON810的RPA检测引物，其特征在于，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，所述的正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的RPA检测引物在检测转基因玉米MON810种质资源中的应用。

3.一种RPA检测转基因玉米MON810种质资源的探针，其特征在于，所述的探针与权利要求1所述的引物配合使用，所述的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种转基因玉米MON810的RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的正向引物F和反向引物R。

5.根据权利要求4所述的一种转基因玉米MON810的RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的探针。

6.一种转基因玉米MON810的RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)配制待测样品的RPA检测反应体系：在200μL PCR反应管内加入模板DNA 2μL、检测正反引物溶液各1μL、探针溶液0.5μL、Buffer A溶液23.5μL、Buffer B溶液2μL，总体积为30μL；

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的正反引物和探针溶液的浓度为10μmol/L。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的Buffer A包含：50mmol/LTris-HCl、pH 8.4，80mmol/L KAc，2mmol/L DTT，3mmol/L ATP，200μmol/L dNTPs，20mmol/LC₄H₁₀N₃O₅P，100ng/μL creatine kinase，5％20mol/L PEG，600ng/μL SSB，125ng/μL uvsX，25ng/μL uvxY，30ng/μL Bsu和96ng/μL ExoⅢ。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的Buffer B为10mmol/L MgAc。