CN111944882B - 转基因抗虫玉米gab-3转化体的定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

转基因抗虫玉米gab-3转化体的定量pcr检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定量PCR检测引物对、检测探针和试剂盒，以及它们在转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定量PCR检测中的应用。本发明还公开了一种转基因抗虫玉米GAB‑3转化体的定量PCR检测方法。

Description

转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中转基因植物的分子生物学检测方法，特别是涉及转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测方法，以及相关的引物对、探针和试剂盒。
背景技术
近年来，随着基因工程技术的飞速发展，转基因作物种植面积和转基因作物品种都大量增加，同时转基因植物及其产品安全性也引起全球范围内的关注和担忧。为了有效监管转基因植物及其产品，保障消费者的合法权益，目前，包括中国在内的全世界50多个国家颁布并实施了转基因生物安全标识制度和配套的管理规定。中国的基因工程育种技术发展迅速，近年来育成了一系列的转基因品种作物，因此制定相关的转基因生物安全评价方法显得尤其重要。
在转基因作物及其产品安全检测方法中，PCR技术以其灵敏度高、稳定性好、准确性强、操作简便成为国际上转基因植物及其产品检测的主要方法，中国近年来颁布的转基因生物及其产品安全评价方法也是以PCR检测方法为主。根据检测目的基因的不同，PCR检测方法分为筛查、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测；其中，转化体特异性检测方法的特异性最高，筛查检测和转化体特异性检测方法是实际检测中应用最广泛的方法。筛查检测方法主要用于初步检测样品中是否含有转基因成分，转化体特异性检测方法可以准确确定转基因植物的身份。
转基因抗虫玉米GAB-3是由杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学联合研发的转基因抗虫玉米。该转化体于2008年利用农杆菌介导法转化栽培玉米品系Hi-II中获得的，转基因抗虫玉米GAB-3产生Cry1Ab和Cry2Ab两种杀虫蛋白，对玉米螟、棉铃虫及黏虫高抗，可以满足玉米种植者对鳞翅目害虫的有效地防治。2012年5月在农业农村部备案开展了中间试验(农基安办字2012-T088)，2015年获得批准在浙江省开展环境释放试验(农基安审字(2014)第005号)，2019年获得批准在浙江省开展生产性试验(农基安审字(2019)第033号)。经过连续多年多点的安全性评价研究，转基因抗虫玉米GAB-3的分子特征、环境安全性和食用安全性已十分明确。
在分子特征方面，转基因抗虫玉米GAB-3的目的基因和标记基因以单位点单拷贝的方式插入在第7号染色体上，实际插入序列全长为11064bp，T-DNA中其余各元件均保持完整，并且与转化质粒中T-DNA序列完全一致。目的基因cry1Ab、cry2Ab和标记基因g10evo-epsps在不同世代之间整合、表达稳定。
到目前为止，中国尚未发布专门针对转基因抗虫玉米GAB-3转化体及其衍生品种检测的方法，迫切需要尽快制定相关检测方法，为中国转基因生物安全管理部门实施各项安全管理制度提供科学方法和技术支撑。
发明内容
为此，本发明的一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测探针，其序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测试剂盒，其中包括上述的定量PCR检测引物对和/或定量PCR检测探针。
本发明的另一个目的是提供上述的定量PCR检测引物对和/或定量PCR检测探针在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述的定量PCR检测试剂盒在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入包含上述的PCR检测引物对和定量PCR检测探针的PCR反应液进行荧光PCR反应；
(3)反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因抗虫玉米GAB-3：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因抗虫玉米GAB-3；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因抗虫玉米GAB-3。
进一步地，在上述定量PCR检测方法中，所述的步骤(2)的PCR反应体系以25μL反应体积为例表示如下：
Figure BDA0002633262390000021
Figure BDA0002633262390000031
进一步地，在上述的定量PCR检测方法中，所述的步骤(2)的PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，共进行40次循环；在第二阶段的60℃退火延伸时段收集荧光信号。
本发明的优点或有益效果：转基因抗虫玉米GAB-3是由杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学联合研发的转基因抗虫玉米，拥有自主知识产权。此方法的开发为该产品提供了可靠的定量检测方法，为保护该产品提供了强有力的技术支撑。
附图说明
图1是实时荧光PCR引物的适用性测试。
图2是实时荧光PCR引物反应体系优化测试。
图3-1定量PCR标准曲线-重复1。
图3-2定量PCR标准曲线-重复2。
图3-3定量PCR标准曲线-重复3。
图4是实时荧光PCR方法特异性测试。
图5是实时荧光PCR方法检出限测试。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细描述本发明，不能将其解释为限制本发明的范围。
实施例1.引物和探针的序列和位置，扩增片段序列和大小
玉米内标准基因，参考国家标准《转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法》(农业部1861号公告—3—2012)中规定的zSSIIb基因作为抗虫耐除草剂玉米GAB3的内标准基因，引物信息如下：
zSSIIb-3F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′
zSSIIb-4R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′
zSSIIb-P：5′-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3′
预期扩增片段大小88bp。
根据研发单位提供的序列信息，进行转化体引物设计，引物序列信息见表3。
定量检测的引物设计位置(下划线)和探针位置(斜体+下划线)如下：
Figure BDA0002633262390000042
表3 GAB3玉米转化体定性PCR方法引物序列
Figure BDA0002633262390000041
以质量分数为1％的玉米GAB3模板进行PCR扩增筛选引物。采用内参基因标准中所述的实时荧光PCR扩增体系和反应条件对特异性引物和探针进行测试，每个反应设置三个平行。经过适用性测试，4组引物探针组合的均能得到典型性扩增，其中RB-F2/R2/P2(RB2)效果最好(见图1)，因此将RB2作为候选的实时荧光PCR引物进行进一步测试。
实施例2.反应体系和反应程序
为了获得最优的引物和探针反应浓度，我们将引物/探针的浓度设置为0.2/0.2、0.4/0.2、0.4/0.3、0.6/0.3μmol/L 4个浓度梯度。结果表明，随着引物和探针浓度的增加，扩增曲线呈现上升的趋势，但Ct值变化无显著差异。因此，综合考虑体系配制的因素以及试剂成本因素，最终确定检测的引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L(图2)。
实施例3.标准曲线绘制和计算(标准曲线的决定系数≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1)
取含量为100％的转基因玉米GAB3提取DNA，基因组DNA浓度稀释成为47.6ng/ul，依次按5倍梯度稀释配制成了5个含量的标准样品。
每个PCR反应设置3个平行，重复3次实验。根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板拷贝数的对数分别绘制GAB3和zSSIIb的标准曲线(图3-1～3-3)。结果显示，三次重复实验中GAB3和zSSIIb检测反应标准曲线的回归系数R2、效率E、斜率、截距等所有指标全部满足了标准制定的要求范围，GAB3和zSSIIb检测体系的Ct值与模板拷贝数间均具有良好的线性关系。
实施例4.特异性
以1％的抗虫玉米GAB3、其他不同作物的转基因混合样(与普通PCR方法样品相同)、非转基因玉米混合样以及GAB3受体材料的基因组DNA为模板，利用优化好的PCR反应体系进行检测，每个样本做6次平行。检测结果表明，仅抗虫玉米GAB3获得了典型的扩增曲线，表明建立的实时荧光PCR方法具有很好的特异性(图4)。
特异性测试样品
设置以下样品，每种转化体在样品中的质量分数为1％，包括：
1)其他转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、双抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307)；
2)转基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1)；
3)转基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102)；
4)转基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496)；
5)转基因水稻混合物(TT51-1、科丰6号、克螟稻、M12、科丰8号、科丰2号、G6H1、T1C-19)。
实施例5.检测极限和定量极限(定量误差Bias、实验室内重复性RSD r、实验室间再现性RSD R)
5.1检测极限
设置了反应体系中含有10拷贝(相当于GAB3转化体含量为0.025％)GAB3转化体特异性序列对方法的LOD进行测试了。结果显示，当反应体系中含有10个拷贝的GAB3转化体成分时，60个平行反应均有扩增信号，因此由实验室内的验证估测GAB3检测方法的检测极限(LOD)不高于10个拷贝(图5)，本方法的LOD设定为10拷贝。
5.2定量极限
LOQ测试结果见表4，当反应体系中含有100拷贝GAB3转化体特异性序列(相当于GAB3含量为0.25％)时，12次测试结果的偏差为4.16％，小于25％；RSD为12.00％，小于25％。因此由实验室内的验证估测本检测方法的LOQ不高于100拷贝，本方法LOQ设定为100拷贝。
表4 GAB3检测方法的LOQ测试
Figure BDA0002633262390000051
Figure BDA0002633262390000061
实施例6.实验的重复性和再现性
设置转基因玉米含量为5％、1％、0.5％的玉米基因组DNA样品，每次设3个平行样，重复3次实验，计算多次测试的偏差(Bias)和相对标准偏差(RSD)，评价测试方法的正确度和精密度。
3次重复测试结果显示3个浓度的偏差(Bias)均小于25％，相对标准偏差(RSD)均小于25％(表5)，说明GAB3检测方法的正确度与精密度均符合相关标准的要求，重复性较好。
表5 GAB3检测方法的正确度和精密度测试
Figure BDA0002633262390000062
以上以具体实施方式描述了本发明，本领域技术人员在不背离本发明精神的情况下，可以做出等同的修改或变型，其同样在权利要求的范围之内。
                         序列表
<110>  浙江省农业科学院
<120>  转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测方法及试剂盒
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
cccttatctg ggaactactc acaca                                        25
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atggcgaatg ctagagcagc                                              20
<210>  3
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
ccgccttcag tttaa                                                   15

Claims (7)

1.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测试剂，该检测试剂包括引物对和探针，引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测试剂盒，其中包括权利要求1所述的检测试剂。
3.权利要求1所述的定量PCR检测试剂在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测中的应用。
4.权利要求3所述的定量PCR检测试剂盒在转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测中的应用。
5.一种转基因抗虫玉米GAB-3转化体的定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的检测试剂的PCR反应液进行荧光PCR反应；
(3)反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因抗虫玉米GAB-3：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因抗虫玉米GAB-3；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因抗虫玉米GAB-3。
6.权利要求5所述的定量PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的PCR反应体系以25μL反应体积为例表示如下：
;
“-”表示体积不确定，如果PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 TaqDNA 聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整 ddH2O 的体积，使反应体系总体积达到25.0μL；
若采用定量 PCR 试剂盒，则按试剂盒的推荐用量配制反应体系，但上/下游引物及探针的用量按本表执行。
7.权利要求6所述的定量PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸60s，共进行40次循环；在第二阶段的60℃退火延伸时段收集荧光信号。
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