CN114250318B - 转基因玉米bbl2-2转化体特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法 - Google Patents

转基因玉米bbl2-2转化体特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因玉米BBL2‑2转化体特异性定量PCR检测引物、检测方法。特异性引物对为：BBL2‑2‑qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；BBL2‑2‑qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。特异性探针为：BBL2‑2‑P，其序列如序列表SEQ ID No.3。采用本发明的引物对与探针进行实时荧光定量PCR反应，可以鉴定样品中是否含有转基因玉米BBL2‑2品系，并能对其含量进行准确定量。

Description

转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、 检测方法
技术领域
本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物及其检测方法。
背景技术
自1983年第一例转基因植物问世以来，随着世界生物技术的迅速发展，全球转基因农作物种植面积逐年扩大，其产品安全性的关注度也不断提升。许多国家和地区颁布实施了转基因生物标识管理制度，针对转基因作物转化体建立特异、灵敏的定量检测方法是保证标识管理制度顺利实施的重要技术支撑。
玉米是全球种植的主要转基因作物之一，据国际农业生物技术应用署(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)资料表明，2018年全球转基因玉米种植面积为14.39亿亩，总种植面积为17.96亿亩，转基因占比80.12％。我国是世界玉米生产和消费大国，对转基因玉米研发也取得了巨大进展，部分转基因材料已经具备商业化应用的潜力。转基因玉米BFL2-2是由中国农业科学院生物技术研究所研发的抗虫耐除草剂玉米，抗草甘膦、抗鳞翅目和鞘翅目昆虫，目前已进入生产性试验阶段，具有极高的产业化应用潜力。到目前为止，国内外还没有用于转基因玉米BFL2-2定量PCR检测的方法，制定转基因玉米BFL2-2检测的定量方法对于我国转基因生物安全监管、促进我国玉米产业的健康发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供用于检测转基因玉米BBL2-2的转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物和探针；
所述特异性检测正向引物为：BBL2-2-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BBL2-2-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
与其匹配的探针为：BBL2-2-P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。
本发明的目的之二是建立一种转基因玉米BBL2-2的转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，按照如下步骤进行：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测；
(3)运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BBL2-2品系；
(4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BBL2-2，根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k×Lg(Copies)+b，分别得到一条外源基因标准曲线方程和一条内标准基因标准曲线方程，再将待测样品的Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因玉米BBL2-2的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数×100。
所述BBL2-2水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8μL，2×TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/L BBL2-2-qF1μL，10μmol/L BBL2-2-qR1μL，10μmol/L BBL2-2-P0.5μL，DNA模板2μL。
所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用实验的方法，对转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物探针进行特异性筛选，并配合使用玉米内标准基因zSSIIb，不仅能够定性检测样品中是否含有转基因玉米BBL2-2，还能定量检测其含量。
附图说明
图1是引物探针优化扩增曲线图。
图2是特异性测试扩增曲线图。
图3是线性区间测试结果：1、标准品S1(20000拷贝)；2、标准品S2(4000拷贝)；3、标准品S3(800拷贝)；4、标准品S4(160拷贝)；5、标准品S5(32拷贝)；6、标准品S6(16拷贝)。
图4是检出限测试结果。
图5是内标准基因zSSIIb定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
图6是BBL2-2转化体特异性序列定量PCR图谱：1、标准品S1；2、标准品S2；3、标准品S3；4、标准品S4；5、标准品S5；6、正确度样品5％；7、正确度样品2％；8、正确度样品0.5％。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
转基因玉米BBL2-2纯合体，非转基因玉米郑58，特异性实验验证样品13种。
特异性实验验证样品设计如下：
1)阴性对照(郑58)。
2)阳性对照(转基因玉米BBL2-2，质量分数为1％)。
3)其他转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427、5307，含量各1％，以非转基因玉米为填充物)；
4)转基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72、DAS81419-2，含量各1％，以非转基因大豆为填充物)；
5)转基因棉花混合物(MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102，含量各1％，以非转基因棉花为填充物)；
6)转基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302、73496，含量各1％，以非转基因油菜为填充物)；
7)转基因水稻混合物(TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1、T1C-19，含量各1％，以非转基因水稻为填充物)；
8)非转基因玉米混合物(5种非转基因玉米，含量各20％)；
9)非转基因大豆混合物(5种非转基因大豆，含量各20％)；
10)非转基因棉花混合物(5种非转基因棉花，含量各20％)；
11)非转基因油菜混合物(5种非转基因油菜，含量各20％)；
12)非转基因水稻混合物(5种非转基因水稻，含量各20％)。
2、酶与试剂
Applied Biosystems的Gene Expression Master Mix，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物及探针由上海生工合成。
3、实验仪器
分光光度计：Thermo ND-1000；
离心机：Thermo Biofuge Primo R；
实时荧光定量PCR仪：BioRad CFX96；
其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。
实施例1引物探针设计
根据转基因玉米BBL2-2的3’端旁侧序列信息，在外源插入片段和玉米基因组连接区设计引物和探针，引物探针信息见表1。
表1 转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光PCR检测引物及探针
实施例2引物探针浓度优化
以100％的转基因玉米BBL2-2基因组DNA为模板，设计了5组引物探针浓度进行PCR反应条件优化(表2)。实验结果显示，引物探针浓度越大，荧光信号值越高(图1、表2)。结合Ct值数据，并参考《农业部1861号公告-3-2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法》，确定组合3为转基因玉米BBL2-2实时荧光PCR方法的引物探针浓度，引物终浓度为0.4μmol/L，探针终浓度为0.2μmol/L。
表2 引物探针优化浓度和实验结果
实施例3方法特异性测试
利用建立的转基因玉米BBL2-2实时荧光PCR检测方法，对引物探针进行特异性检测。
设置转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光PCR反应体系见表3。运行实时荧光PCR反应，反应程序如表4。样品为12种特异性实验验证样品。
表3 实时荧光PCR反应体系
试剂 终浓度 体积
无菌水 - 8μL
2×TaqMan反应缓冲液 1× 12.5μL
10μmol/L BBL2-2-qF 0.4μmol/L 1μL
10μmol/L BBL2-2-qR 0.4μmol/L 1μL
10μmol/L BBL2-2-P 0.2μmol/L 0.5μL
DNA模板(25ng/μL) 2ng/μL 2μL
总体积 - 25μL
表4 实时荧光PCR反应程序
实验结果显示，除在1％的转基因玉米BBL2-2样品得到扩增曲线外，在其他转基因及非转基因混合物中均未获得扩增(图2)，表明该引物探针具有高度特异性。
实施例4线性区间测试
将转基因玉米BBL2-2基因组DNA进行梯度稀释，制备不同浓度的标准品，标准品中DNA量及拷贝数见表5，构建标准曲线，确定标准曲线的线性范围。
表5 标准品中DNA量及拷贝数
标准品编号 DNA(ng)/反应 拷贝数/反应
S1 50 20000
S2 10 4000
S3 2 800
S4 0.4 160
S5 0.08 32
S6 0.04 16
实验结果显示，标准曲线均满足扩增效率90％～110％，斜率为-3.6～-3.1，R2≥0.98(图3、表6)，符合《农业部2259号公告-5-2015转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法制定指南》(以下简称“定量标准”)的相关规定，表明在该方法在拷贝数20000～16范围内具有良好的线性。
表6 标准曲线线性重复测定数据统计
实施例5检出限(LOD)测试
将转基因玉米BBL2-2基因组DNA稀释至10拷贝(相当于质量分数为0.05％的转基因玉米BBL2-2)进行检测极限测试，样品进行60次平行测试。结果表明，60个平行均能获得典型的扩增曲线(图4)，确定检出限为10拷贝或者0.05％(按照PCR检测反应体系中加入50ng DNA模板进行测算)。
实施例6定量极限(LOQ)
将转基因玉米BBL2-2基因组DNA稀释至100拷贝进行定量极限测试，测定结果见表7。
表7 定量极限测试结果
实验结果表明，100拷贝样品测定结果偏差为15.00％，不超过标准值的25％，RSDr为8.90％，小于25％，符合定量标准的要求，确定方法的定量极限为100拷贝。
实施例7正确度与精密度
将转基因玉米BBL2-2粉末与非转基因玉米粉末混合，配制质量分数分别为5％、2％和0.5％的样品，作为测试样品对定量PCR方法的正确度与精密度进行测试。内标准基因采用《农业部1861号公告-3-2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法》标准中的引物探针。
标准曲线标准品的拷贝数分别为20000、4000、800、160、32，根据标准曲线，计算测试样品的拷贝数，并计算转基因含量：转基因含量(％)＝BBL2-2拷贝数/zSSIIb拷贝数×100。统计结果见表8和表9。
两次重复实验的结果显示，转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量PCR方法的标准曲线斜率为-3.6～-3.1，扩增效率为90％～110％，R2≥0.98，均符合定量标准的要求；5％、2％和0.5％样品测定结果偏差分别为4.40％、7.50％和6.00％，RSDr分别为0.14％、4.29％和1.52％，符合定量标准的要求。结果表明，建立的转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量PCR方法可以用于转基因样品中转基因玉米BBL2-2成分含量测定。
表8 转基因玉米BBL2-2定量PCR结果
注：标准曲线公式y＝ax+b，式中以Ct值作为y轴，以拷贝数的对数作为x轴。
表9 转基因成分含量计算结果
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 转基因玉米 BBL2-2 转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgatcttgt tcgttgtatt gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcggcgtta attcagtaca t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccctgagag tcaactgccc c 21

Claims (5)

1.一种转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量PCR检测引物，其特征在于，所述特异性检测正向引物为：BBL2-2-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BBL2-2-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量PCR检测引物，与其匹配的探针为：BBL2-2-P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示。
3.一种转基因玉米BBL2-2转化体特异性的定量检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）提取待测样品DNA；
（2）以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设置玉米内标准基因和转基因玉米BBL2-2转化体特异性实时荧光定量PCR反应体系，对标准梯度样品和待测样品进行检测，所述荧光定量PCR反应体系中特异性检测正向引物为：BBL2-2-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；反向引物为：BBL2-2-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；与引物匹配的探针为：BBL2-2-P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示；
（3）运行实时荧光定量PCR反应，若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明待测样品中不含有转基因玉米BBL2-2品系；
（4）若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号，则证明样品中含有转基因玉米BBL2-2，根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct=k×Lg(Copies)+b，分别得到一条外源基因标准曲线方程和一条内标准基因标准曲线方程，再将待测样品的Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量：样品中转基因玉米BBL2-2的含量%=外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数×100。
4.根据权利要求3所述的转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量检测方法，其特征在于，所述BBL2-2水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8 µL，2 × TaqMan反应缓冲液12.5 µL，10 µmol/L BBL2-2-qF1 µL，10 µmol/L BBL2-2-qR1 µL，10 µmol/L BBL2-2-P0.5 µL，DNA模板2 µL。
5.根据权利要求3所述的转基因玉米BBL2-2转化体特异性定量检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15 s，60℃，60 s，40个循环。
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