CN114959089A

CN114959089A - 一种转基因大豆mon89788品系的实时荧光pcr检测引物探针、试剂盒及方法

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Publication number: CN114959089A
Application number: CN202210147270.XA
Authority: CN
Inventors: 于海燕; 杨茹梦; 李想; 尹璐; 钱昌元; 左翠花
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针、试剂盒及方法。本发明的实时荧光PCR检测引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；本发明的实时荧光PCR检测探针为：MON89788‑P1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明针对大豆MON89788品系的特点设计了效果优异的引物探针、优化了检测方法，检测效率非常高，本发明的实时荧光PCR检测方法经验证具有较高的特异性、灵敏性以及可重复性，能够满足口岸对于转基因大豆检得快、检得准的要求。

Description

一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针、试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

大豆不仅含有丰富的植物蛋白和食用油脂，还含有异黄酮、卵磷脂等有益营养物质，是重要的食用、饲用和油料作物。转基因大豆MON89788品系是美国孟山都公司研发的具有草甘膦除草剂耐受性的转基因大豆品系。

为了满足口岸检得快、检得准的要求，需开发针对转基因大豆MON89788 品系的高效率检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何实现对转基因大豆MON89788品系的高效率检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针，包括正向引物MON89788-F1、反向引物 MON89788-R1和探针MON89788-P1；

所述正向引物MON89788-F1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述反向引物MON89788-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针MON89788-P1 的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述探针MON89788-P1的5’端标记有荧光基团，3’端标记有与荧光基团对应的淬灭基团。

优选地，所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、 Texas Red、VIC、HEX或ROX；所述淬灭基团为BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、Dabcyl、 Eclipse或TAMRA。

更优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ-1。

本发明还提供了一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测试剂盒，包括HR qPCR Master Mix预混液、DNA提取试剂以及上述的转基因大豆 MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针。

本发明还提供了一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤1：DNA模板制备：提取待检测大豆样品的DNA；

步骤2：DNA浓度及纯度测定：采样紫外分光光度计测定所提取的DNA浓度及纯度；

步骤3：待测样品实时荧光PCR反应：以提取的大豆样品的DNA为模板，利用上述的转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针配置反应体系，并进行实时荧光PCR扩增；

步骤4：对照实时荧光PCR反应：在待测样品进行实时荧光PCR反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照，以水作为空白对照：以非转基因大豆材料中提取的DNA作为阴性对照：以转基因大豆MON89788作为阳性对照；

步骤5：实时荧光PCR扩增分析：若待测样品发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因大豆MON89788品系的成分；若待测样品不发生特异性扩增，则表明待测样品不包含转基因大豆MON89788品系的成分。

优选地，所述步骤3中的反应体系包括：2×HR qPCR Master MixⅠ12.5μL、 10μmol/L正向引物1μL、10μmol/L反向引物1μL，10μmol/L探针0.5μL、DNA 模板2μL，双蒸水8μL，总体系为25μL。

优选地，所述步骤3中实时荧光PCR反应的程序为：50℃预变性2min，95℃ 预变性10min；95℃变性15s，59℃退火延伸1min，所述变性和退火延伸过程共进行45个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明针对大豆MON89788品系的特点设计了效果优异的引物探针、优化了检测方法，检测效率非常高，本发明的实时荧光PCR检测方法经验证具有较高的特异性、灵敏性以及可重复性，能够满足口岸对于转基因大豆检得快、检得准的要求。

附图说明

图1为引物探针筛选实时荧光PCR扩增结果：①为F1/R1/P1引物探针组合时的扩增结果；②为F2/R2/P2引物探针组合时的扩增结果；

图2为反应体系反应条件优化结果：A为退火温度57℃时的扩增结果；B 退火温度58℃时的扩增结果；C退火温度59℃时的扩增结果；D退火温度60℃ 时的扩增结果；

图3为方法特异性扩增结果。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明的实施例中采用的试验材料、试剂和试验仪器如下所示：

1、试验材料

转基因大豆MON89788品系标准样品(100％)购自欧盟联合研究中心标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)，非转基因大豆、特异性实验验证的12种样品为实验室储备样品。

特异性实验验证样品设计如下：

(1)阳性对照样品：转基因大豆MON89788品系标准样品，含量1％；

(2)阴性对照样品：非转基因大豆；

(3)其他转基因大豆：GTS40-3-2、MON87705、81419，A2704-12、356043、 305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、FG72，11个品系混合制成1个DNA样品，含量各1％；

(4)转基因玉米：Bt11、Bt176、MON810、TC1507、MON89034、MON8801、 759122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9，12个品系混合制成为1个DNA样品，含量各1％

(5)非转基因玉米：由3批非转基因玉米等量混合提取1个DNA样品；

(6)转基因水稻：M12、KF-8、KF-2、G6H1、TT51-1、KF-6、KMD-1、 7个品系混合制成1个DNA样品，含量各1％；

(7)非转基因水稻：3批非转基因水稻等量混合制成1个样品；

(8)转基因油菜：MS1、MS8RF1、RF2、MON88302，4个品系混合制成 1个DNA样品，含量各1％；

(9)非转基因油菜：3批非转基因油菜等量混合提取1个DNA样品；

(10)转基因棉花：MON1445、MON531、MON15985、MON88913、GHB614， 5个品系混合制成1个DNA样品，含量各1％；

(11)非转基因棉花：3批非转基因棉花等量混合提取1个DNA样品:

(12)转基因苜蓿：J163，含量1％。

2、试剂

食品基因组DNA提取试剂盒(DNeasy mericon Food Kit)购自德国QIAGEN GmbH公司，引物探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

3、试验仪器

分光光度计：GE，Nano vue Plus；

离心机：Eppendorf，Centrifuge 5424；

实时荧光PCR仪：ViiA7；

其他仪器包括冷冻研磨机、超净工作台、恒温振荡孵育器、生物安全柜等。

实施例1植物基因组DNA的提取与检测

取各转基因植物品系和常规非转基因棉花品种标准物质约200mg粉末，采用食物核酸提取试剂盒Dneasy mericon Food Kit(50)，根据试剂盒中的说明书，提取各植物材料基因组DNA。用微量分光光度计测定提取的DNA溶液的浓度，并通过OD₂₆₀/OD₂₈₀比值确定提取的DNA的纯度。提取的DNA溶液置于-20℃ 保存。

实施例2检测方法的建立

(1)引物探针设计：根据抗虫转基因大豆的3’端旁侧序列，在外源插入序列与大豆染色体连接区设计相应的实时荧光PCR引物探针。正向引物位于大豆染色体上，反向引物和探针位于外源插入序列上，正、反向引物和探针各设计2条引物：

正向引物MON89788-F1:5’-CTTCCTTTTGGGCTTTTTTG-3’(SEQ ID No.1)；

反向引物MON89788-R1:5’-GATGGGGATCAGATTGTCGT-3’(SEQ ID No.2)；

探针MON89788-P1：FAM-AGCGCTTCAATCGTGGTTATCA-BHQ1(SEQ ID No.3)；

正向引物MON89788-F2:5’-CTGCTCCACTCTTCCTTTTGGGC-3’ (SEQ ID No.4)；

反向引物MON89788-R2:5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTT-3’(SEQ ID No.5)；

探针MON89788-P2：FAM-TTTTTGTTTCCCGCTCTAGCGCTTC-BHQ1 (SEQ ID No.6)；

(2)引物探针筛选：采用常规检测中的实时荧光PCR体系及扩增程序进行 PCR扩增，对设计的4条引物和2条探针进行组合，如表1所示，采用试验方法进行评价，筛选出最适合的引物，实时荧光PCR扩增结果如图1所示。

表1筛选序列信息

(3)PCR反应体系和反应程序优化：引物终度设置为0.1μmol/L、0.2 μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L4个梯度处理，探针均为引物的1/2；退火温度设置为57℃、58℃、59℃、60℃等4个梯度处理。用二因子正交试验确定 PCR反应体系中的引物探针终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果确定最适合的实时荧光PCR反应本系和反应程序，如图2所示。

(4)方法特异性测试：根据优化好的实时荧光PCR反应体系和反应程序，选取特异性实验验证样品12种对方法进行特异性测试。若仅从含有转基因大豆 MON89788材料中获得预期扩增曲线，而从其他样品中未获得预期扩增曲线，表明方法特异性符合要求。测试结果如图3所示，方法具有高度特异性。

(5)方法可重复性测定：采用优化好的实时荧光PCR反应体系与反应程序，对5份转基因大豆MON89788品系样品进行扩增，测定Ct值，每个样品设置4次平行重复，分别计算标准偏差(standard deviation，SD)和相对标准偏差 (relative standard deviation，RSD)来判断检测方法的可重复性。若SD和RSD 均小于25％，则说明方法可重复性良好，若SD和RSD大于25％，则说明方法可重复性差。测试结果如表2所示，方法具有良好的重复性。

表2可重复性结果

(6)方法灵敏度测定：采用优化好的实时荧光PCR反应体系与反应程序，对质量分数分别为1％、0.5％、0.1％、0.05％，0.01％、0％的样品进行扩增，测定Ct值。测定结果如表3所示，方法灵敏度为0.01％。

表3灵敏度测定结果

样品含量	阳性扩增/测定次数	平均Ct值	SD	RSD
					1％	20/20	23.01	0.05	0.23％
0.5％	20/20	23.23	0.12	0.53％
					0.1％	20/20	23.53	0.23	0.98％
0.05	20/20	23.89	0.32	1.33％
					0.01％	20/20	24.58	2.43	9.87％

(7)本发明还提供了一种转基因大豆MON89788品系实时荧光PCR定性检测试剂盒，包括：HR qPCR Master Mix预混液、大豆DNA的提取试剂以及 PCR检测引物探针；所述PCR检测引物探针包括正向引物MON89788-F1、反向引物MON89788-R1和探针MON89788-P1，所述正向引物MON89788-F1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述反向引物MON89788-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针MON89788-P1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttccttttg ggcttttttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatggggatc agattgtcgt 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcgcttcaa tcgtggttat ca 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgctccact cttccttttg ggc 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtcgtttcc cgccttcagt tt 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttttgtttc ccgctctagc gcttc 25

Claims

1.一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针，其特征在于，包括正向引物MON89788-F1、反向引物MON89788-R1和探针MON89788-P1；

所述正向引物MON89788-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物MON89788-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针MON89788-P1的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

2.一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括HRqPCR Master Mix预混液、DNA提取试剂以及权利要求1所述的转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针。

3.一种转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：DNA模板制备：提取待检测大豆样品的DNA；

步骤3：待测样品实时荧光PCR反应：以提取的大豆样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测引物探针配置反应体系，并进行实时荧光PCR扩增；

4.根据权利要求3所述的转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3中的反应体系包括：2×HR qPCR Master Mix Ⅰ 12.5μL、10μmol/L正向引物1μL、10μmol/L反向引物1μL，10μmol/L探针0.5μL、DNA模板2μL，双蒸水8μL，总体系为25μL。

5.根据权利要求3所述的转基因大豆MON89788品系的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3中实时荧光PCR反应的程序为：50℃预变性2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，59℃退火延伸1min，所述变性和退火延伸过程共进行45个循环。