CN111394497B

CN111394497B - 用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111394497B
Application number: CN202010279854.3A
Authority: CN
Inventors: 邓婷婷; 黄文胜; 刘凤轩
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111394497A

Abstract

本发明提供了一种用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法，基于大麦的FDH、GLU2a、RBCL、ACPS和UDPg基因设计了大量的引物，且通过大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物和探针，使用上述引物和探针对待测样品中大麦成分进行检测，能将大麦与其他物种混淆品准确的分开，检测绝对灵敏度达0.2copies/μL，相对灵敏度可达0.5％，鉴定结果准确、稳定、可靠。

Description

用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

随着转基因产品的大量研究及其在日常生活中的广泛应用，转基因产品对人类健康以及生存环境所带来的安全性问题已经引起世人的广泛关注及争论。因此，世界各国在积极研究转基因技术的同时，也对各种转基因食品的检测分析方法进行了大量研究。但由于转基因种类多，数量大，尤其是很多转基因食品经过深加工和各种条件处理保存后，转基因成分大量降解，检测难度加大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新和发展各种转基因食品的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理，减少其商品化可能带来的风险，同时保护公众健康、保护广大消费者知情权和选择权。

特异性基因检测在转基因检测、食品成分检测方法非常重要，食品转基因检测的第一步骤即为食品成分检测。在转基因定性检测中，特异性基因作为质量分数的分母使用。国家标准-转基因产品通用检测方法包括了玉米zSSIIb和Adh1、大豆Lectin、油菜CruA和PEP、水稻SPS和PLD、苜蓿ACC基因、甜菜GluA3、马铃薯UGPase，共7大作物的11个特异性基因实时PCR检测方法。但大麦等重要的禾本科作物都没有成熟的特异性基因检测方法。因此，需要根据科学技术的发展不断更新和发展已经商业化和具有商业化前景的转基因禾本科作物的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理。

例如，中国专利文献CN106636424A中提供了一种原位杂交探针及其对大麦染色体组鉴定的方法，所述的原位杂交探针Oligo-442A01可用于标记大麦染色体，并对该核苷酸进行荧光标记用于构建探针。利用该探针与(AGG)5组成的探针组合在不需进行染色体变性的条件下，能有效识别大麦染色体组，是一种较好的识别、区分大麦染色体组的探针组合方法。中国专利文献CN104593514A公开了提供了一种快速鉴定大麦春化基因VERNALIZATION1(HvVRN1)等位基因的引物、试剂盒及检测方法，该引物包括1条正向引物和3条反向引物形成的3对引物，通过两次普通PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳实现的。第一次PCR反应中用一对引物全部待测材料进行检测，第二次PCR反应中用两对引物第一次PCR反应中不能很好区分及没有扩增的材料进行检测，综合两次PCR结果，可以明确地鉴定全部12种HvVRN1等位基因。然而，以上两个专利的技术均只能用于大麦内部品种或者野生种与栽培种进行鉴定，无法区分大麦与其他物种。因大麦、小麦、黑麦、燕麦、黍等禾本科作物同源性较高，导致植物及其加工品中大麦成分的鉴别难度很大。

因此，亟需一种灵敏度高、特异性强、结果准确可靠且快速简便的用于检测大麦成分的方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种用于检测大麦成分的特异性引物，采用所述引物检测大麦成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中大麦成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种用于检测大麦成分的探针，采用所述探针检测大麦成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中大麦成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于检测大麦成分的试剂盒，采用所述试剂盒检测大麦成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中大麦成分进行快速鉴定，效率高。

本发明要解决的第四个技术问题在于提供一种用于检测大麦成分的方法，采用所述方法检测大麦成分，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高，能够在短时间内对大量待测样品中大麦成分进行快速鉴定，效率高。

为此，本发明提供了一种用于检测大麦成分的引物，所述引物如下：

上游引物：5′-GAGGGCACAATTCCGTGGTAGTA-3′；

下游引物：5′-GCGGATCATACATCCCTGAAGCAAA-3′。

本发明还提供了一种用于检测大麦成分的探针，其特征在于，所述探针的序列为：5′-TCGCGCCATTCAAGCCGTGATACGTC-3′。

进一步地，所述探针的3′端标记有荧光淬灭基团，5′端标记有荧光报告基团。

进一步地，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和MGB；所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE和HEX。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的特异性引物和上述任一项所述的探针。

进一步地，试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。优选地，阴性对照为无菌双蒸水。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。

本发明还提供了一种所述的特异性引物或上述任一项所述的探针或所述的试剂盒在检测样品中大麦成分的的应用；

进一步地，所述样品为植物或者植物加工品。

所述植物加工品为动物食品、植物食品、饮料、保健品、营养补充剂中的至少一种。

本发明还提供了一种检测大麦成分的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；

(2)使用所述的引物对步骤(1)获得的DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70～80bp的DNA片段，则样品中存在大麦成分；反之，则样品中不存在大麦成分。

所述步骤(3)中所述70～80bp的DNA片段为76bp的DNA片段。

所述的76bp的DNA片段序列如SEQ ID NO：4所示，具体为GGAGGGCACAATTCCGTGGTAGTATTCGCGCCATTCAAGCCGTGATACGTCTTTGCTTCAGGGATGTATGATCCGC(Hordeum vulgare beta-ketoacyl-ACP synthase I基因，简称ACPS基因)

本发明还提供了一种检测大麦成分的方法，包括如下步骤：

(1)提取样品中的核酸，得DNA模板；

(2)使用所述的引物和上述任一所述的探针对步骤(1)提取的DNA模板进行实时荧光PCR扩增；

(3)收集荧光信号，得出检测结果。

进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，PCR反应体系包括：

DNA模板，30～60ng；

上游引物，10μM，0.5～1.5μL；

下游引物，10μM，0.5～1.5μL；

探针，10μM，0.25～1μL；

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；

无菌超纯水补至25μL；

进一步地，所述PCR扩增和/或实时荧光PCR扩增过程中，按照如下PCR扩增程序进行：95℃，5min；94℃，15s，48～68℃，1min，进行40～60个循环；然后继续98℃，8～12min。

优选的，所述的PCR扩增条件为95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s；60℃，1min(1℃/s)，共50个循环；98℃，10min(1℃/s)。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明所述的用于检测大麦成分的特异性引物，本发明人是在前期研究中通过对多个检测基因进行筛选分析后，创新性地选择Hordeum vulgare beta-ketoacyl-ACPsynthase I(β-酮酰基ACP合酶I，ACPS)基因作为检测基因，具体地，本发明人前期基于大麦和其他物种的5种基因，包括ACPS基因、甲酸脱氢酶(FDH)基因、GLU2a基因(全称：大麦β-1,3-葡聚糖酶基因)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(rbcl)基因和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶基因(UDPg)基因，设计了大量的引物，且通过对这些引物的筛选研究，筛选出了本发明的具有高种属特异性的引物，使用本发明提供的引物对样品中的大麦成分进行鉴定，具有结果准确、灵敏度高(灵敏度为0.2copies/μL，相对灵敏度可达0.5％)、结果稳定可靠且假阳性率低的优点，并能将大麦成分与其他亲源关系比较近的种属混淆品准确的分开，特异性高，且其PCR扩增产物仅为76bp，分子量小，扩增效率高，保证了其在短时间内进行大量的食品中大麦成分鉴定。

(2)本发明所述的用于检测大麦成分的试剂盒，本发明人通过比对了大量禾本科的众多基因序列(如FDH、GLU2a、RBCL、ACPS、UDPg基因序列)，选取到了种内基因序列同源性高而种间基因序列具有差异的ACPS与UDPg两个基因，并通过软件加手动设计的方法优化引物探针的位置，设计出合适的引物探针并进行了筛选，最终选取了ACPS基因引物及探针，建立了大麦特异性的检测方法，并通过实际样品对已建立的方法进行了验证，该检测方法具有结果准确、稳定、可靠、特异性强、灵敏度高、时间短的优点。

(3)本发明所述的检测大麦成分的方法，采用70～80bp的DNA片段为目的基因的引物进行PCR扩增，保证了其在短时间内进行大量的样品中大麦成分鉴定，鉴定结果准确、稳定、可靠、灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，很显然下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实验例1中采用实施例5和对比例1-4的检测方法检测黑龙江垦啤大麦成分的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实验例2中采用实施例6和对比例5的检测方法检测黑龙江垦啤大麦的实时荧光PCR扩增曲线，曲线1为实施例6，曲线2为对比例4；

图3为实验例3中检测大麦成分的特异性实验结果，基线上方为黑龙江垦啤大麦，基线下方为玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯与空白对照；

图4为实验例4不同品种大麦的种内包容性检测实验结果，曲线1为黑龙江垦啤大麦；曲线2为哈梅林大麦，曲线3为斯特林大麦，曲线4为苏啤大麦，基线下方为阴性对照品和空白对照；

图5为实验例5中检测大麦成分的绝对灵敏度实验结果，曲线1为含200copies/μL的DNA的原液，曲线2为20copies/μL的DNA的稀释液，曲线3为含2copies/μL的DNA的稀释液，曲线4为0.2copies/μL的DNA，基线下方为阴性对照品和空白对照；

图6为实验例6中检测大麦成分的相对灵敏度实验结果。曲线1为含大麦成分含量50％的样品，曲线2为含大麦成分含量5％的样品，曲线3为含大麦成分含量0.5％的样品，基线下方为含大麦成分含量0.05％的样品、阴性对照品和空白对照。

具体实施方式

本发明所使用的主要样品和试剂如下：

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。其中，黑龙江垦啤大麦、哈梅林大麦、斯特林大麦、苏啤大麦为本实验室保存，玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、甘蔗、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯均为市购。

本发明所使用的主要设备如下：

eppendorf微量移液器、AB7500荧光定性PCR仪、高速台式离心机、DYY22C型电泳仪。

实施例1引物

本实施例提供了一种于检测大麦成分的特异性引物，针对大麦的ACPS基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQ ID NO：1-2所示：

上游引物：5′-GAGGGCACAATTCCGTGGTAGTA-3′；

下游引物：5′-GCGGATCATACATCCCTGAAGCAAA-3′。

实施例2探针

本实施例提供了一种于检测大麦成分的探针，针对大麦的ACPS基因设计的探针如下，参见序列表中SEQ ID NO：3所示：所述探针的序列为：5′-TCGCGCCATTCAAGCCGTGATACGTC-3′。

实施例3普通PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种用于检测大麦成分的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液部分为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：

上游引物，10μM，0.5～1.5μL；

下游引物，10μM，0.5～1.5μL；

Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；

10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含10mmol/L Mg²⁺),2.5μL；

dNTPs，2.5mM，0.25～1μL；加无菌双蒸水至总体积为25μL。

实施例4实时荧光PCR检测试剂盒

本实施例提供了一种用于检测大麦成分的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液部分为含所述实施例1中的所述特异性引物和实施例2所述的探针；所述PCR反应液部分含有用于进行实时荧光PCR扩增的含有dNTPs、Taq DNA聚合酶的2×TaqMan Universal PCR Master Mix以及无菌超纯水，每支所述试剂盒的配方为：

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；

上游引物(10μM)1.0μL；

下游引物(10μM)1.0μL；

探针(10μM)0.5μL；

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

实施例5检测方法

本实施例提供了一种利用实施例1的特异性引物或实施例3的试剂盒检测大麦成分的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品的处理与DNA提取

待测样品的处理步骤：取30-40g待测样品，经粉碎仪或研磨机进行研磨至样品粉末颗粒约为0.2mm-0.3mm左右大小，得到样品粉末。

DNA提取步骤：然后取200mg样品粉末置于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，振荡均匀，65℃振荡孵育60min。然后于12000rpm离心10min，小心转移上清液至新的2mL离心管中；加入750μL三氯甲烷后涡旋混匀，12000rpm离心10min。吸取上清至2mL离心管，加入2倍体积的CTAB沉淀液并均匀，室温静置1h后，12000rpm离心10min。弃上清液后向沉淀中加入350μL1.2mol/L NaCl溶液将沉淀充分溶解，再加入350μL三氯甲烷，涡旋混匀，12000rpm离心10min。吸上清液至1.5mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，-20℃静置过夜，12000rpm离心10min。弃上清后用70％乙醇溶液洗涤沉淀2至3次后，12000rpm离心10min。弃上清液后充分晾干；加100μL TE溶液溶解沉淀DNA，立即使用或-20℃保存备用。

(2)PCR扩增

以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：

上游引物：5′-GAGGGCACAATTCCGTGGTAGTA-3′；

下游引物：5′-GCGGATCATACATCCCTGAAGCAAA-3′。

所述PCR反应体系包括：

Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2～1.2μL；

10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含10-20mmol/L Mg²⁺),2.5μL；

dNTPs，2.5mM，0.25～1μL；

上游引物(10μM)1.0μL

下游引物(10μM)1.0μL

模板DNA 50ng，1μL

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

扩增反应在PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s，进行40个循环；然后继续72℃延伸7min，降温至4℃。

(3)取步骤(2)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为2％，核酸染料GelRed浓度为1％，电泳缓冲液为TAE缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为5μL，DNA分子量标记(DNA Marker)上样量为5μL，电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。若所述PCR扩增产物中含有76bp的DNA片段，则所述待测样品存在大麦成分；反之，则所述待测样品中不存在大麦成分。

实施例6检测方法

本实施例提供了一种利用实施例1的特异性引物或实施例2的试剂盒检测大麦成分的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品的处理、纯化与DNA提取，步骤同实施例5

(2)实时荧光PCR扩增

以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物和探针进行PCR扩增：

上游引物：5′-GAGGGCACAATTCCGTGGTAGTA-3′；

下游引物：5′-GCGGATCATACATCCCTGAAGCAAA-3′。

所述探针的序列为：5′-TCGCGCCATTCAAGCCGTGATACGTC-3′。

所述PCR反应体系包括：

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL；

上游引物(10μM)1.0μL；

下游引物(10μM)1.0μL；

探针(10μM)0.5μL；

DNA模板，50ng，1μL；

加无菌双蒸水至总体积为25μL。

扩增反应在实时荧光PCR仪上进行，所述PCR扩增程序如下：

95℃，5min(1℃/s)；94℃15s，60℃1min(1℃/s)，共50个循环；98℃，10min(1℃/s)。

(3)结果判定：若待测样品Ct值≤35并出现特定的扩增曲线说明其含有大麦成分，若待测样品Ct值≥40，说明其不含大麦成分，若Ct值在35～40之间，则重新进行实时荧光PCR扩增，如再次扩增后Ct值≥40，则说明其不含大麦成分，如再次扩增后Ct值<40，则说明其含大麦成分。

对比例1检测方法

本对比例提供了一种用于检测大麦成分的方法，采用FDH基因为目的基因片段，设计用于检测大麦的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-ACAAGCAGGCGTATGCACCATG-3′(SEQ ID No：5)；

下游引物：5′-CATGCAAATCCATTAGCCTGCAC-3′(SEQ ID No：6)。

参见序列表中SEQ ID NO：7所示，所述FDH基因的序列为：ACAAGCAGGCGCATGCACCATGCAGGTGCTAATAATTAAGCGAGACACGTCGCCGCATCCGCGTGGGTAAGTGCAGGCTAATGGATTTGCATG，长度为93bp。

对比例2检测方法

本对比例提供了一种用于检测大麦成分的方法，采用GLU2a基因为目的基因片段，设计用于检测大麦的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-GCTGCGGCCTACCTGGTTA-3′(SEQ ID No：8)；

下游引物：5′-CACCGCTGCAGGAATATTTGC-3′(SEQ ID No：9)。

参见序列表中SEQ ID NO：10所示，所述GLU2a基因的序列为GCTGCGGCCTACCTGGTTACCGTGGCGTTGGCCCTTGGTGTGCTGGCAAATATTCCTGCAGCGGTGC，长度为67bp。

对比例3检测方法

本对比例提供了一种用于检测大麦成分的方法，采用RBCL基因为目的基因片段，设计用于检测大麦的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-GCACCTCTAGGCTTGTATCGAGAG-3′(SEQ ID No：11)；

下游引物：5′-GGTTGCATCGCTTGGGCATG-3′(SEQ ID No：12)。

参见序列表中SEQ ID NO：13所示，所述RBCL基因的序列为

GCACCTCTAGGCTTGTATCGAGAGCGTATGCAGCTACGTACGTACATTATGGCATGATCACGGCACAGGAGGGTTGAGGCATTACCAGGCCATGTTGGTGGGCATGCCCAAGCGATGCAACC，长度为122bp。

对比例4检测方法

本对比例提供了一种用于检测大麦成分的方法，采用UDPg基因为目的基因片段，设计用于检测大麦的引物。本对比例按照实施例5的方法对待测样品进行检测，与实施例5的区别仅在于采用的上游引物和下游引物不同，本对比例采用的引物包括：

上游引物：5′-CTTCGTGGGCGGAAGACG-3′(SEQ ID No：14)；

下游引物：5′-CGGAGACTTCAACCCGCAGA-3′(SEQ ID No：15)。

所对应的目的基因片段为：

参见序列表中SEQ ID NO：16所示，所述UDPg基因的序列为CTTCGTGGGCGGAAGACGGCAGAGCGACTTCGGAGCGTTGGCGTGCCAGAAGCCAGGCCTAAGGCCACTTCCCTGCGTTTAGGCTCTGCGGGTTGAAGTCTCCG，长度为104bp。

对比例5引物及探针

本对比例提供了一种用于检测大麦成分的方法，采用UDPg基因为目的基因片段，设计用于检测大麦的探针。本对比例按照实施例6的方法对待测样品进行检测，与实施例6的区别仅在于采用的上游引物和下游引物以及探针不同，本对比例采用的引物和探针包括：

上游引物：5′-CTTCGTGGGCGGAAGACG-3′(SEQ ID No：14)；

下游引物：5′-CGGAGACTTCAACCCGCAGA-3′(SEQ ID No：15)；

探针：5′-TGGCAGTGCCCAAGAAGGCCAAGGC-3′(SEQ ID No.17)。

参见序列表中SEQ ID NO：16所示，所述UDPg基因的序列为CTTCGTGGGCGGAAGACGGCAGAGCGACTTCGGAGCGTTGGCGTGCCAGAAGCCAGGCCTAAGGCCACTTCCCTGCGTTTAGGCTCTGCGGGTTGAAGTCTCCG(SEQ ID No：16)，长度为104bp。

实验例1

分别按照实施例5和对比例1-4的检测方法检测黑龙江垦啤大麦，取各引物扩增后得到的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1所示，其中M为DNA Marker(50bp)，条带1-5分别是采用目的基因片段为FDH、GLU2a、RBCL、ACPS、UDPg基因所对应的引物的扩增产物，条带6为空白对照。从图1中可以看出，实施例5中ACPS基因与对比例4中UDPg基因对应的引物扩增出清晰唯一的目的条带且长度与预期一致(分别为76bp及104bp)，因此选取实施例5与对比例4中的引物用于后续分析。

实验例2

分别采用实施例6和对比例5的引物及探针，按照实施例6的检测方法，检测黑龙江垦啤大麦，结果见图2所示，从图2中可以看出实施例6的引物及探针的扩增效率明显高于对比例5，因此，采用本发明实施例6中的引物及探针用于大麦特异性的检测方法具有效率高、时间短的优点。

实施例3特异性考察实验

为保证分子鉴别结果的可靠性，以对本实验方法进行适用性验证，确认本方法准确、可靠，本实验收集了黑龙江垦啤大麦、玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、甘蔗、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯为待测样品，均按照实施例6的检测方法对上述待测样品进行分别检测。

结果如图3所示，从图中可以看出，只有大麦样品可出现扩增曲线，空白对照(无菌双蒸水)无扩增曲线，而其他禾本科和其他常见作物如玉米、高粱、黑麦、燕麦、黍、大米、小麦、大豆、马铃薯、番茄、油菜、红薯等均未出现荧光曲线，以上结果充分说明该检测方法对大麦成分具有很好的特异性。

实施例4不同品种的大麦的种内包容性检测

为保证分子鉴别结果的可靠性，分别以黑龙江垦啤大麦、哈梅林大麦、斯特林大麦、苏啤大麦为待测样品，以大米、小麦为阴性对照品，均按照实施例6的检测方法对上述待测样品进行分别检测。

检测结果如图4所示，从图4中可以看出，利用本发明的检测方法检测常见品种大麦，如黑龙江垦啤、哈梅林、斯特林、苏啤时，均能够成功检测出大麦，而阴性对照大米、小麦及空白对照均无扩增，表明该方法不仅具有特异性，且种间包容性也符合要求，即对常见品种的大麦均能有效检测。

实施例5绝对灵敏度实验

大麦样品基因组DNA采用黑龙江垦啤大麦参照实施例5中步骤(1)“待测样品的处理、纯化与DNA提取”的方法制备，该其初始拷贝数为200copies/μL，将大麦样品基因组DNA进行2个梯度的10倍稀释再进行两倍稀释，具体为稀释10倍得到拷贝数为20copies/μL的DNA、稀释100倍拷贝数为2copies/μL的DNA、稀释1000倍得到拷贝数为0.2copies/μL的DNA，以原液和不同稀释梯度的大麦样品基因组DNA作为灵敏度实验的阳性标准品，以无菌双蒸水为空白对照，对阳性标准品和空白对照分别按照实施例6中的检测方法进行检测，每个稀释梯度重复2次，验证该检测方法的绝对灵敏度。

如图5所示，空白对照无扩增信号，原液(200copies/μL)及其稀释10倍(20copies/μL)、100倍(2copies/μL)、1000倍(0.2copies/μL)后，所有浓度梯度均能出现明显的扩增曲线，表明本发明的检测方法可用于检测大麦特异性基因成分，准确性和灵敏度较好，可对含量低至0.2copies/μL的大麦品系特异性基因成分进行精准检测。

实施例6相对灵敏度实验

按照实施例5中步骤(1)中“待测样品的处理”分别采用黑龙江垦啤大麦样品和小麦样品制备阳性对照品粉末(黑龙江垦啤大麦样品)与阴性对照品粉末(小麦样品)，将阳性对照品粉末与阴性对照品粉末按不同质量比例混合，得到一系列混合样品，使混合样品中的大麦成分含量的质量百分数分别为0.05％、0.5％、5％及50％，按照实施例6的检测方法进行DNA提取和检测。

结果见图6所示，其中基线上方为不同浓度的阳性样品的扩增曲线，基线下方为相对灵敏度未达到的含量限度、阴性及空白对照。当样品中大麦成分含量百分数不低于0.5％时，样品的2个重复均出现典型的扩增曲线。表明该方法对于精准检测相对含量低至0.5％的大麦成分时方法灵敏度和重现性均较好。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 用于检测大麦成分的特异性引物、探针、试剂盒及方法

<130> HA202000360-YS

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gagggcacaa ttccgtggta gta 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcggatcata catccctgaa gcaaa 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcgcgccatt caagccgtga tacgtc 26

<210> 4

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggagggcaca attccgtggt agtattcgcg ccattcaagc cgtgatacgt ctttgcttca 60

gggatgtatg atccgc 76

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acaagcaggc gtatgcacca tg 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

catgcaaatc cattagcctg cac 23

<210> 7

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

acaagcaggc gcatgcacca tgcaggtgct aataattaag cgagacacgt cgccgcatcc 60

gcgtgggtaa gtgcaggcta atggatttgc atg 93

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gctgcggcct acctggtta 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

caccgctgca ggaatatttg c 21

<210> 10

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctgcggcct acctggttac cgtggcgttg gcccttggtg tgctggcaaa tattcctgca 60

gcggtgc 67

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcacctctag gcttgtatcg agag 24

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggttgcatcg cttgggcatg 20

<210> 13

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gcacctctag gcttgtatcg agagcgtatg cagctacgta cgtacattat ggcatgatca 60

cggcacagga gggttgaggc attaccaggc catgttggtg ggcatgccca agcgatgcaa 120

cc 122

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cttcgtgggc ggaagacg 18

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cggagacttc aacccgcaga 20

<210> 16

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cttcgtgggc ggaagacggc agagcgactt cggagcgttg gcgtgccaga agccaggcct 60

aaggccactt ccctgcgttt aggctctgcg ggttgaagtc tccg 104

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tggcagtgcc caagaaggcc aaggc 25

Claims

1.一种试剂盒在检测样品中大麦成分的应用，其特征在于，包括特异性引物；所述引物包括：

上游引物：5′-GAGGGCACAATTCCGTGGTAGTA-3′；

下游引物：5′-GCGGATCATACATCCCTGAAGCAAA-3′。

2.根据权利要求1所述的试剂盒在检测样品中大麦成分的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括探针，所述探针的序列为：5′-TCGCGCCATTCAAGCCGTGATACGTC-3′。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在检测样品中大麦成分的应用，其特征在于，所述检测样品为植物或者植物加工品。

4.一种检测大麦成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取样品中的核酸，得DNA模板；

（2）使用权利要求1所述的试剂盒对步骤（1）获得的DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；

（3）测定步骤（2）中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有70~80bp的DNA片段，则所述样品中存在大麦成分；反之，则所述样品中不存在大麦成分。

5.一种检测大麦成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取样品中的核酸，得DNA模板；

（2）使用权利要求2或3所述的试剂盒对步骤（1）提取的DNA模板进行实时荧光PCR扩增；

（3）收集荧光信号，得出检测结果。