CN101724707B - 食品中四种致敏原麸质成分实时荧光pcr检测引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。该引物和探针分别是序列为SEQ ID NO.1～3的大麦Hordein基因的检测引物和探针、序列为SEQ ID NO.4～6的小麦Gliadin基因的检测引物和探针、序列为SEQ ID NO.7～9的黑麦Sec1基因的检测引物和探针和序列为SEQ ID NO.10～12的燕麦Avenin基因的检测引物和探针。基于此，本发明公开了包含上述引物和探针序列的食品致敏原麸质成分实时荧光PCR检测试剂盒及相应的检测方法。本发明的探针和引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。

Description

食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品致敏原成分的基因检测方法。尤其是食品致敏原麸质成分的实时荧光PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物、探针和相关试剂盒。

背景技术

食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6％～8％的儿童和2％的成人的过敏反应，严重的会危及生命。其中，麸质是大麦、小麦、燕麦、黑麦等粮食中存在的天然成分，也是最主要、最常见的致敏原成份之一。麸质是谷物特别是小麦中的一组蛋白质。小麦与黑麦、大麦，还有燕麦十分相近。因此这些谷类也含有麸质。麸质使面团具有坚固的结构。在面包加工时的醒发过程中麸质蛋白形成网状结构，如果没有麸质就不能形成这样的结构，面包也就不能发酵。对于大多数人来说麸质是很普通的蛋白质，容易被胃肠道消化。然而少部分人却不能消化麸质蛋白。这些人有麸质蛋白不适应症——最常见的病症是乳糜泻。麸质是一系列单一蛋白质的混合物，这些蛋白质可被划分为两组——醇溶谷蛋白和谷蛋白。主要的醇溶谷蛋白，也就是麸朊，似乎是乳糜泻或麸质蛋白不适应症的主要原因，通常在患有这种病症的免疫体中能够发现麸朊抗体。患有这种疾病的人食用含有麸质蛋白的食物时，他们的免疫系统就会通过损害小肠来做出反应。特别是对小肠内层的茸毛的破坏。食物中的营养成分都是经过这些茸毛被吸收并进入血液循环的，没有它们的帮助，不管吃进去多少食物，人都会营养不良。因为人体自身免疫系统造成的损害，乳糜泻被认为是自身免疫功能紊乱，也可以看作是一种吸收障碍性疾病，因为营养物质不能被吸收。乳糜泻还被称为自发性吸收不良综合症、非热带性口炎性腹泻和谷蛋白敏感性肠病。该疾病无法治愈，但避免食用麸质可以消除其症状，减轻并可能逆转其损害，并降低相关的健康风险。为了确保患有乳糜泻的人获得应有的警示和不被误导，以及为食品的“无麸质”类标签的使用提供真实和准确的信息，准确严格的检验方法是必不可少的。

目前针对食品致敏原的检测方法，主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰剂对照激发试验，体外检测的血清I，试验和组胺释放试验、PCR检测等。传统的体内检测试验直接检测是否存在过敏蛋白质，由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖，造成试验结果假阴性。DNA比蛋白质更耐受热处理和压力作用，尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体。PCR方法中，在热变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物基质的影响较大，它的另一个优点是稳定性，不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。但是常规的PCR特异性较低，且存在污染问题。

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异准确、可有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已广泛应用于各种基因的检测。

发明内容

本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测食品中致敏性麸质成分的实时荧光PCR方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列的试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针，它们分别是：

①大麦(Barley)Hordein基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：

5′-FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3′；

②小麦(Wheat)Gliadin基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-CCCAAAGTACGACGCAACGAC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-GGATTCGGTTATGCCTTCGTG-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：

5′-FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3′；

③黑麦(Rye)Sec1基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AAAAGAACAATCATATCCGCAGCA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-GAATTGGCTGTTGGGGCTGG-3′，

探针(SEQ ID NO.9)：

5′-FAM-TCACACCAACCATTTCCCACACCGC-Eclipse-3′；

④燕麦(Oat)Avenin基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.10)：5′-CGGCGATGTGCGATGTATACG-3′，

反向引物(SEQ ID NO.11)：5′-AGCCCTTGTAGTGTTCTTAGAAGC-3′，

探针(SEQ ID NO.12)：

5′-FAM-CCCACCGCAGTGCCCTGTCGC-Eclipse-3′。

在此基础上，本发明还提供食品中这四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测溶液，该检测溶液中含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及上述四种致敏原麸质成分检测引物对和探针，它们分别是：

大麦Hordein基因的检测引物对(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2)和探针(SEQ ID NO.3)各10μM；

小麦Gliadin基因的检测引物对(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)和探针(SEQID NO.6)各10μM；

黑麦Sec1基因的检测引物对(SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8)和探针(SEQID NO.9)各10μM；

燕麦Avenin基因的检测引物对(SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11)和探针(SEQ ID NO.12)各10μM。

本发明进一步提供了利用上述试剂盒检测食品中四种致敏原麸质成分的实时荧光PCR检测方法，该方法使用上述试剂盒，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10μl上述试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul；将以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

本发明是采用TaqMan探针技术，对麸质致敏原基因进行鉴定。实时荧光检测系统能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操作，防止污染，并能够对结果进行快速判定，显著提高了检测效率及灵敏度，降低检测成本。本发明所述的上述检测引物和探针、试剂盒及检测方法适用于食品(酱油、酒精等精加工食品除外)及其原料中致敏原麸质(大麦、小麦、燕麦、黑麦)成分的检测。本方法在测定植物源性食品时参考的测定低限量(LOD)为50mg/kg，在测定植物原料产品时参考的测定低限量(LOD)为1mg/kg。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分试验所用大麦、燕麦、小麦、黑麦、白芝麻、高粱、绿豆、玉米、花生、饭豆等25份样品由大连农业科学院和沈阳农业大学等单位提供；DNA提取试剂盒(货号D9093)购于宝生物工程(大连)有限公司；ABI7500实时荧光PCR仪(ABI公司，美国)，高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。

实施例1

一、食品致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针的设计

根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的大麦管家基因Hordein(SEQ ID NO.13)、小麦管家基因Gliadin(SEQ ID NO.14)、黑麦管家基因Sec1(SEQ ID NO.15)及燕麦管家基因Avenin(SEQ ID NO.16)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通过对检测引物和探针的退火温度的一致性以及GC含量的相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异性引物和探针：

①大麦(Barley)Hordein基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-AAC AGC TAA ACC CAT GCA AGG TA-3′

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-GTT CGG GGA TTT GGG GTA GTT G-3′

探针(SEQ ID NO.3)：5′-FAM-TCC TCC AGC AGC AGT GCA GCC CT-Eclipse-3′

②小麦(Wheat)Gliadin基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-CCC AAA GTA CGA CGC AAC GAC-3′

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-GGA TTC GGT TAT GCC TTC GTG-3′

探针(SEQ ID NO.6)：5′-FAM-CAT GCC GAC ACA CAT CAA GGT TGAC-Eclipse-3′

③黑麦(Rye)Sec1基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-AAA AGA ACA ATC ATA TCC GCA GCA-3′

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-GAA TTG GCT GTT GGG GCT GG-3′

探针(SEQ ID NO.9)：5′-FAM-TCA CAC CAA CCA TTT CCC ACA CCGC-Eclipse-3′

④燕麦(Oat)Avenin基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.10)：5′-CGG CGA TGT GCG ATG TAT ACG-3′

反向引物(SEQ ID NO.11)：5′-AGC CCT TGT AGT GTT CTT AGA AGC-3′

探针(SEQ ID NO.12)：5′-FAM-CCC ACC GCA GTG CCC TGTCGC-Eclipse-3′

二、食品致敏原麸质成分实时荧光PCR检测试剂盒的构建

在获得的上述特异性引物对及探针基础上，设计用于食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒检测溶液中含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及四种致敏原麸质成分检测引物对和探针，分别为：

大麦Hordein基因的检测引物对(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2)和探针(SEQ ID NO.3)各10μM；

小麦Gliadin基因的检测引物对(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5)和探针(SEQID NO.6)各10μM；

黑麦Sec1基因的检测引物对(SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8)和探针(SEQID NO.9)各10μM；

燕麦Avenin基因的检测引物对(SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11)和探针(SEQ ID NO.12)各10μM。

三、食品致敏原麸质成分实时荧光PCR检测方法的建立

1、DNA样品制备

本实施例基因组DNA的抽提采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA提取试剂盒(货号D9093)并按其操作说明进行抽提样品DNA。

DNA浓度和纯度的测定：取5μL制得的DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照如下公式计算获得：

C＝A×N×50/1000，式中：

C为DNA浓度(μg/μL)；

A为260nm处的吸光值；

N为核酸稀释倍数；

1OD_260nm＝50μg/mL双链DNA；

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

2、实时荧光PCR检测

使用本实施例所建立的试剂盒，采用实时荧光PCR检测方法检测食品中四种致敏原麸质成分，包括如下步骤：

①反应体系：取1μl步骤1制得的模板DNA溶液，加入10μl试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul；

②将以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序；

④实时荧光PCR反应程序为：95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光；

⑤检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，其中Ct值(cycle threshold)是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；

⑥每个样品设置两个平行的反应体系；检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照：用已知含麸质成分的样品作阳性对照，用已知不含麸质成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH2O代替模板DNA作空白对照。

3、结果判断

(1)对照结果

空白对照：无荧光增幅现象；

阴性对照：无荧光增幅现象；

阳性对照：有荧光增幅现象；

否则，实验视为无效；

(2)检测结果的判定

①同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品无荧光增幅现象，判断样品中未检出致敏原麸质成分；

②同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35，判断样品中检出致敏原麸质成分；

③同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，若检测样品荧光增幅曲线的Ct值在35～40之间，则应重新进行实时荧光PCR反应，再次扩增后的结果Ct值仍在35～40之间，可判断样品中检出致敏原麸质成分，否则可判断样品中未检出致敏原麸质成分；

④在四组引物与探针中，任何一组的检测结果为阳性，以及上述实时荧光PCR检测步骤⑥的两个平行样中有一个样品检测结果为阳性，即可判断该样品中检出致敏原麸质成分。

检测过程中按照GB/T 27403操作防止交叉污染。

实施例2、特异性试验

采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法检测大麦、小麦、燕麦和黑麦等麸质致敏原成分的样品。同时检测白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米等非麸质致敏原成分DNA样品，以对方法的特异性进行评估，检测结果如下。

阴性对照结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染。阳性对照结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常。

对大麦中麸质致敏原基因进行检测结果显示，在Ct值为15.5左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对小麦中麸质致敏原基因进行检测结果显示，在Ct值为16左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对黑麦中麸质致敏原基因进行检测结果显示，在Ct值为16.5左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

对燕麦中麸质致敏原基因进行检测结果显示，在Ct值为16左右时，出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。

其他非麸质致敏原基因检测结果显示，FAM通道均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

由上述实验结果可见，本发明具有很好的特异性。

实施例3、灵敏度试验

一、植物源性食品中麸质过敏原检测灵敏度

以米粉(麸质浓度为50mg/kg)为麸质过敏原参考物质，应用实施例1的方法检测方法灵敏度。检测结果显示，阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；样品检测结果显示，浓度为50mg/kg的麸质过敏原参考物质均能很好检出。

结果表明该标准方法对植物源性食品中麸质致敏原成分的检测灵敏度较高，达到50mg/kg。

二、植物原料产品中麸质过敏原检测灵敏度

应用实施例1的特异性引物和探针，及相关的试剂盒和检测方法，采用过敏原阳性物质添加的方法，进行植物原料产品中麸质过敏原测定低限的研究。

以不同质量的麸质样品，研磨样品处理后，分别添加到不含麸质致敏原成分的植物为原料的米粉基质中，制备成20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg共5个梯度添加样品，从高到低逐份添加原料。应用本发明方法分别进行检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。制备好的样品分别进行检测，结果显示：阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；植物原料产品中麸质致敏原成分敏感度检测结果显示，浓度分别为20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg的麸质过敏原添加产物均能很好检出。结果表明该标准方法对植物原料产品中麸质致敏原成分的检测灵敏度较高，可以达到1mg/kg。

实施例4、应用于实际样品检测

采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法，对实际样品进行检测。实际检测样品包括面粉、麦片、面条及小食品等共432份。检测结果如下表所示：

表1

结果显示，所检测实际样品共432份，其中：

检测面粉样品79份，检测麸质致敏原阳性率为100％；

检测麦片、面条等含麸质制品样品157份，检测出含有麸质致敏原成分157份，检测麸质致敏原成分阳性率为100％；

检测小食品196份，检测出含有麸质致敏原成分45份，其中有11份样品含有麸质致敏原成分，但样品标识显示为“不含麸质致敏原”，检测结果与样品标识不符；其余151份样品不含有麸质致敏原成分，与样品标识相符。

对上述检测结果，采用麸质的酶联免疫定量快速检测方法检测进行验证，结果相符。

由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测麸质致敏原成分成分，具有较好的应用结果。

SEQUENCE LISTING

<110>曹际娟，郑秋月，徐君怡

<120>食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法

<130>N/A

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aacagctaaa cccatgcaag gta    23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gttcggggat ttggggtagt tg     22

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcctccagca gcagtgcagc cct    23

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cccaaagtac gacgcaacga c      21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggattcggtt atgccttcgt g        21

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

catgccgaca cacatcaagg ttgac    25

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aaaagaacaa tcatatccgc agca     24

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gaattggctg ttggggctgg          20

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tcacaccaac catttcccac accgc    25

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cggcgatgtg cgatgtatac g    21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cccaccgcag tgccctgtcg c    21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cccaccgcag tgccctgtcg c    21

<210>13

<211>150

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare L.

<400>13

aacagctaaa cccatgcaag gtattcctcc agcagcagtg cagccctgtg ccagtgccac    60

aacgtattgc taggtcgcaa atgttgcagc agagcagttg ccatgtgttg cagcaacaat    120

gttgccagca actaccccaa atccccgaac                                     150

<210>14

<211>108

<212>DNA

<213>Triticum aestivum

<400>14

cccaaagtac gacgcaacga cgtcttcttg tcctcgttcc atgccgacac acatcaaggt    60

tgacaagtca ccatctaaaa ggttatccac gaaggcataa ccgaatcc                 108

<210>15

<211>230

<212>DNA

<213>Secale cereale

<400>15

aaaagaacaa tcatatccgc agcaaccata tccctcacac caaccatttc ccacaccgca    60

acaatattcc ccctatcaac cacagcaacc atttccccaa ccccaacaac cagcccccat    120

acaaccacaa caaccattcc cccagcaacc ccaacaacct ttcccccagc cccaacaaca    180

attacccttg caaccacaac aaccatttcc ccagccccaa cagccaattc               230

<210>16

<211>84

<212>DNA

<213>Avena Sativa L.

<400>16

cggcgatgtg cgatgtatac gtcccaccgc agtgccctgt cgccaccgcc cctctcggtg    60

gcttctaaga acactacaag ggct                                           84

Claims (2)

1.食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于该检测溶液中含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及四种致敏原麸质成分检测引物对和探针各10μM，分别是：

①大麦Barley的Hordein基因的检测引物和探针序列：

正向引物SEQ ID NO.1：5′-AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA-3′，

反向引物SEQ ID NO.2：5′-GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG-3′，

探针SEQ ID NO.3：

5′-FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3′；

②小麦Wheat的Gliadin基因的检测引物和探针序列：

正向引物SEQ ID NO.4：5′-CCCAAAGTACGACGCAACGAC-3′，

反向引物SEQ ID NO.5：5′-GGATTCGGTTATGCCTTCGTG-3′，

探针SEQ ID NO.6：

5′-FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3′；

③黑麦Rye的Sec1基因的检测引物和探针序列：

正向引物SEQ ID NO.7：5′-AAAAGAACAATCATATCCGCAGCA-3′，

反向引物SEQ ID NO.8：5′-GAATTGGCTGTTGGGGCTGG-3′，

探针SEQ ID NO.9：

5′-FAM-TCACACCAACCATTTCCCACACCGC-Eclipse-3′；

④燕麦Oat的Avenin基因的检测引物和探针序列：

正向引物SEQ ID NO.10：5′-CGGCGATGTGCGATGTATACG-3′，

反向引物SEQ ID NO.11：5′-AGCCCTTGTAGTGTTCTTAGAAGC-3′，

探针SEQ ID NO.12：

5′-FAM-CCCACCGCAGTGCCCTGTCGC-Eclipse-3′

2.食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10μl试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul；将以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环；

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。