CN101724708B - 食品致敏原芥末成分实时荧光pcr检测引物和探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。其上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2，探针序列为SEQ ID NO.3。基于此，本发明公开了包含上述引物和探针序列的食品致敏性芥末成分实时荧光PCR检测试剂盒及相应的检测方法。本发明的探针和引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。

Description

食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品致敏性成分的基因检测方法。尤其是食品致敏原芥末成分的实时荧光PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物、探针和相关试剂盒。

背景技术

芥(mustard)是十字花科(Cruciferae)数种草本植物的统称，或指其辣味种子所制成的调味品。芥株上的叶和肥大的叶梗也用作青菜。主要品种是：白芥(Sinapis alba，或黄芥)，原产于地中海地区；棕芥(Brassica juncea，或芥菜)，原产于喜马拉雅山区。棕芥已几乎完全取代了以往使用的黑芥(Brassicanigra)，黑芥因不适合机械耕作，现在已成为讨人嫌的杂草。食物过敏是一个严重的食品安全问题。食品加工商有责任控制致敏物，并提供正确的信息。产品的主要致敏物必须在标签中标示出来。食物过敏是食物引起对机体对免疫系统的异常反应。主要是因为人体对某些外来食物成分的反应过火或对某些蛋白质以及某些食物成分缺乏消化能力。常见的食物过敏，与免疫球蛋白E有关；而致敏物即为某些蛋白。食物过敏目前是不可治愈，只能避免。目前比较公认并被欧盟认定的主要的致敏物有大概十四种，其中包括芥末及其制品，如芥菜籽，芥末油，芥末浸提树脂油，芥末粉等。芥末含有多种复杂致敏成分。本发明中致敏原芥末成分即指芥末特异性的DNA片段。为了确保对芥末敏感体质的使用者能准确地避免食物引起的过敏，有必要建立针对芥末准确、严格、灵敏的检验方法。

目前针对食品致敏原的检测方法，主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰剂对照激发试验，体外检测的血清IgE试验和组胺释放试验、PCR检测等。传统的体内检测试验直接检测是否存在过敏蛋白质，由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖，造成试验结果假阴性。DNA比蛋白质更耐受热处理和压力作用，尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体。PCR方法中，在热变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物基质的影响较大，它的另一个优点是稳定性，不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。但是常规的PCR特异性较实时荧光PCR低，且存在污染问题。

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异准确、可有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已广泛应用于各种基因的检测。

发明内容

本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测食品中致敏性芥末成分的实时荧光PCR方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列的试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针，所述的针对芥末Sin基因的检测引物和探针序列为：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-TGAGTTTGATTTTGAAGACGATATGG-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-TGTRTAACSGCTTTGGATGCTC-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：

5′-FAM-CAGGGHCCACAGCAGAGGCCACC-Eclipse-3′。

在此基础上，本发明还提供食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测溶液，该检测溶液中含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及芥末Sin基因的检测引物对和探针各10μM；

其中，芥末Sin基因的检测引物对序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，芥末Sin基因的检测探针序列为SEQ ID NO.3。

本发明进一步提供了利用上述试剂盒检测食品致敏原芥末成分的实时荧光PCR检测方法，该方法使用上述试剂盒，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10μl试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul，5000r/min离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环，

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。

本发明方法采用TaqMan探针技术，能够对芥末致敏原基因进行鉴定。实时荧光检测系统能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操作，防止污染，并能够对结果进行快速判定。本方法在测定芥末原料产品时参考的测定低限量(LOD)为1mg/kg，在测定植物源性食品时参考的测定低限量(LOD)为10mg/kg。本发明的应用可实现对芥末致敏原成分的稳定、特异、快速检测。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分试验所用白芥、棕芥、黑芥、大白菜、韭菜、油菜籽、黄大豆、高粱、薏米、黑芝麻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、绿豆、玉米、花生、饭豆等30份样品由大连农业科学院和沈阳农业大学等单位提供。DNA提取试剂盒(货号D9093)购于宝生物工程(大连)有限公司。ABI 7500实时荧光PCR仪(ABI公司，美国)，高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。

实施例1

一、食品致敏性芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针的设计

根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的芥末管家基因Sin基因(SEQ ID NO.4)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通过对检测引物和探针的退火温度的一致性以及GC含量的相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异性引物和探针：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-TGAGTTTGATTTTGAAGACGATATGG-3′；

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-TGTRTAACSGCTTTGGATGCTC-3′；

探针(SEQ ID NO.3)：

5′-FAM-CAGGGHCCACAGCAGAGGCCACC-Eclipse-3′；

二、食品致敏性芥末成分实时荧光PCR检测试剂盒的构建

在获得的上述特异性引物对及探针基础上，设计用于食品致敏性芥末成分实时荧光PCR检测的试剂盒，该检测溶液中含有10mM Tris.Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及芥末Sin基因的检测引物对和探针各10μM；

其中，芥末Sin基因的检测引物对序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，芥末Sin基因的检测探针序列为SEQ ID NO.3。

三、食品致敏性芥末成分实时荧光PCR检测方法的建立

1、DNA样品制备

本实施例的DNA样品制备方法参考《DNA及RNA基本实验技术》(科学出版社，A.J.哈伍德主编，盛小禹等译)，具体为：

(1)制样：称取约200g样品，用研钵或粉碎装置将样品粉碎至粉末状。

(2)DNA提取

①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入600μL CTAB缓冲液(若样品吸水性强适当增加CTAB加入量)和40μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；

②加入500μL由酚、三氯甲烷和异戊醇按体积比为25∶24∶1组成的混合溶液，强烈振荡，12000r/min离心15min，其中所述的酚是由pH8.0的0.5mol/LTris-HCl平衡过的重蒸酚；

③吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min；

④弃去上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；

⑤加入5μL RNA酶溶液，37℃30min；

⑥加入200μL由三氯甲烷和异戊醇按体积比24∶1组成的混合溶液，强烈振荡，12000r/min离心15min；

⑦吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min；

⑧弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12000r/min离心1min；

⑨弃上清液，晾干；加入50μL TE缓冲液，溶解DNA沉淀。

上述DNA提取步骤也可采用等效的商业化核酸提取试剂盒来完成。

(3)DNA浓度和纯度的测定

取5μL由步骤(2)制得的DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照如下公式计算获得：

C＝A×N×50/1000，式中：

C为DNA浓度(μg/μL)；

A为260nm处的吸光值；

N为核酸稀释倍数；

1OD_260nm＝50μg/mL双链DNA；

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

2、实时荧光PCR检测

使用本实施例所建立的试剂盒，采用实时荧光PCR检测方法检测食品中致敏原芥末成分，包括如下步骤：

①反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10μl试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul；

②将以上各组分加入至0.2mL实时荧光PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序；

④实时荧光PCR反应程序为：95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环，每次循环的退火时收集荧光；

⑤检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，其中Ct值(cycle threshold)是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；

⑥每个样品设置两个平行的反应体系；检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照：用已知含芥末成分的样品作阳性对照，用已知不含芥末成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH2O代替模板DNA作空白对照。

3、结果判断

(1)对照结果

空白对照：无荧光增幅现象；

阴性对照：无荧光增幅现象；

阳性对照：有荧光增幅现象；

否则，实验视为无效；

(2)检测结果的判定

①同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品无荧光增幅现象，判断样品中未检出致敏原芥末成分；

②同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35，判断样品中检出致敏原芥末成分；

③同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，若检测样品荧光增幅曲线的Ct值在35～40之间，则应重新进行实时荧光PCR反应，再次扩增后的结果Ct值仍在35～40之间，可判断样品中检出致敏原芥末成分，否则可判断样品中未检出致敏原芥末成分；

④检测中两个平行样中有一个样品检测结果为阳性，即可判断该样品中检出致敏原芥末成分。

检测过程中按照GB/T 27403操作防止交叉污染。

实施例2、特异性试验

采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法检测芥末致敏原样品，即白芥、棕芥和黑芥。同时检测白芝麻、糙米、绿豆、玉米、黑大豆、雪豆、泰国香米、花豆、黑小豆、黄豆、豌豆、饭豆、黑大米、胡萝卜、大白菜、韭菜、油菜、花生米、高粱、薏米等非芥末致敏原样品。以对方法的特异性进行评估。

检测结果：阴性对照检测的FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果的FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；采用本发明检测芥末致敏原样品，即白芥、棕芥和黑芥，结果都出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性；其他非芥末致敏原样品检测结果的FAM通道均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。由上述实验结果可见，本方法具有很好的特异性。

实施例3、灵敏度试验

一、植物源性食品中芥末过敏原检测灵敏度

以浓度分别为50mg/kg和10mg/kg的右旋糖为芥末过敏原参考物质，应用实施例1的方法检测方法灵敏度。检测结果显示，阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；样品检测结果显示，浓度分别为50mg/kg和10mg/kg的芥末过敏原参考物质均能很好检出均能很好检出。

结果表明该标准方法对植物源性食品中芥末致敏原成分的检测灵敏度较高，达到10mg/kg。

二、植物原料产品中芥末过敏原检测灵敏度

应用实施例1的特异性引物和探针，及相关的试剂盒和检测方法，采用过敏原阳性物质添加的方法，进行植物原料产品中芥末过敏原测定低限的研究。

以不同质量的芥末样品，研磨样品处理后，分别添加到不含芥末致敏原的植物为原料的米粉基质中，制备成20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg共5个梯度添加样品，从高到低逐份添加原料。应用实施例1的方法分别进行检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。制备好的样品分别进行检测，结果显示：阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常；植物原料产品中芥末致敏原成分灵敏度检测结果显示，浓度分别为20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg的芥末过敏原添加产物均能很好检出。结果表明该标准方法对植物原料产品中芥末致敏原成分的检测灵敏度较高，可以达到1mg/kg。

实施例4、应用于实际样品检测

采用实施例1的含有特异性引物和探针的检测试剂盒及检测方法，对实际样品进行检测。实际检测样品包括芥菜籽、芥末粉、小食品和调料等共291份。检测结果如下表所示：

表1

结果显示，所检测实际样品共291份，其中：

检测芥菜籽、芥末粉样品90份，测得含芥末致敏原成分阳性率为100％；

检测小食品89份，检测出含有芥末致敏原成分3份，其中有1份样品含有芥末致敏原成分，但样品标识显示为“不含芥末致敏原”，检测结果与样品标识不符；其余86份小食品样品不含芥末致敏原成分；

检测调料112份，检测出含有芥末致敏原成分34份，其中有9份样品含有芥末致敏原成分，与样品标识不符，其余样品与样品标识相符。

对上述检测结果，采用酶联免疫定量快速检测方法进行验证，结果相符。

由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测芥末致敏原成分，具有较好的应用结果。

SEQUENCE LISTING

<110>曹际娟，郑秋月，徐君怡

<120>食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法

<130>N/A

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgagtttgat tttgaagacg atatgg    26

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgtrtaacsg ctttggatgc tc        22

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caggghccac agcagaggcc acc       23

<210>4

<211>147

<212>DNA

<213>Brassica sp.

<400>4

tgagtttgat tttgaagacg atatggagaa cccacaggga ccacagcaga ggccaccact    60

actccagcag tgctgcaacg agctccacca ggaagagcca ctttgcgttt gcccaacctt    120

gaaaggagca tccaaagccg ttaaaca                                        147

Claims (3)

1.食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于：针对芥末Sin基因的检测引物和探针序列为：

正向引物SEQ ID NO.1：5′-TGAGTTTGATTTTGAAGACGATATGG-3′，

反向引物SEQ ID NO.2：5′-TGTRTAACSGCTTTGGATGCTC-3′，

探针SEQ IDNO.3：

5′-FAM-CAGGGHCCACAGCAGAGGCCACC-Eclipse-3′。

2.食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于该检测溶液中含有10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL以及芥末Sin基因的检测引物对和探针各10μM；

其中，芥末Sin基因的检测引物对序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，芥末Sin基因的检测探针序列为SEQ ID NO.3。

3.食品致敏原芥末成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于使用权利要求2所述的试剂盒，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入10μl试剂盒中的检测溶液和14μl灭菌超纯水，总体积25ul，5000r/min离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：

95℃/10s，1个循环；95℃/5s，52℃/10s，72℃/34s，40个循环，

每次循环的退火时收集荧光，检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。