CN101921876B

CN101921876B - 小麦黄矮病毒的多重pcr检测方法

Info

Publication number: CN101921876B
Application number: CN2010102676453A
Authority: CN
Inventors: 吴云锋; 杨洋
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2030-08-31
Also published as: CN101921876A

Abstract

本发明涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其中逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。应用本发明的多重PCR检测小麦黄矮病的方法对田间复合侵染的小麦材料检测具有快速、省时、节约成本等优势。

Description

小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法。

背景技术

小麦是全世界最主要的粮食作物之一，我国的种植面积居世界首位。但是，病毒病及其它病害严重影响了小麦的产量和质量。大麦黄矮病毒病(Barleyyellow dwarfvirus，BYDV)是一种全球性的病毒病害。每年对世界粮食生产造成一定程度的危害，大发生时会造成严重减产。在我国，该病主要流行于北方麦区，引起的小麦黄矮病是重要的流行病害。1987年仅陕西和甘肃两省就因该病害的流行损失5亿多公斤小麦，1998年大面积流行发生范围遍及陕西、山西、宁夏、内蒙和河北等多个省(自治区)。为了保证小麦生产的产量和质量，准确鉴定小麦病害，了解其流行动态，以尽早做好防范措施。因此小麦生产上急需一种较为灵敏、准确和快速的病害检测方法。

早期的检测方：生物学、血清学、电镜观察、核酸杂交和PCR技术都先后用于检测小麦病毒，但是一些传统的检测方法灵敏度不是很高，而且都只针对单一病毒的检测，对多种病毒混合检测时，需要耗费较多的时间和试剂。

多重PCR(M-PCR)是在普通PCR(polymerase chain reaction)的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害，极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内有单重和荧光PCR检测BYDV-PAV、GPV、GAV，而在田间经常表现为多种病害复合侵染；并且其症状极其相似，需要用分子方法进行区分。利用单一PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大，因而多重RT-PCR在小麦病害的检测中的优越性更为明显。

发明内容

本研究针对我国小麦病害发生的现状，利用设计的特异性引物对，摸索和优化多重PCR反应体系的条件参数等，建立了能从小麦叶片组织中同时检测BYDV种群PAV、GPV、GAV三种病毒的复合侵染田间样品的多重PCR检测方法。

具体的，本发明提供了一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV 三种病毒的方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其特征在于逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。

SEQ ID NO.1-6的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3’(PAV F)

SEQ ID NO.2：5’-CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3’(PAV R)

SEQ ID NO.3：5’-GGTCGCCCTTAGAAATG-3’(GPV F)

SEQ ID NO.4：5’-GCCTCGGTGATGAACTG-3’(CPV R)

SEQ ID NO.5：5’-GTAGAAATAACCGCAGGAG-3’(GAV F)

SEQ ID NO.6：5’-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3’(GAV R)

上述方法中，优选地，在多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4×-0.9×；dNTPs浓度为0.1-0.5mM；Mg²⁺浓度为1.0-3.5mM；退火温度为51-55℃；循环次数为20-45次；延伸时间为30-55s。

上述方法中，优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×或0.9×；dNTPs浓度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；Mg²⁺浓度为1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM或3.5mM；退火温度为51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；循环次数为20、25、30、35、40或45次；延伸时间为30、35、40、45、50或55s。

上述方法中，更加优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.8×或0.9×，dNTPs浓度为0.4mM或0.5mM，Mg²⁺浓度为2.5mM或3.5mM，退火温度54℃，延伸时间45s，循环次数30次。

上述方法中，尤其优选地，多重PCR反应的反应体系中，TaqDNA聚合酶浓度为0.04U/μL-0.06U/μL。

上述方法中，尤其优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.9×，dNTPs浓度为0.4mM，Mg²⁺浓度为3.5mM，Taq DNA聚合酶浓度为0.06U/μL。

上述方法中，多重PCR反应的反应体系中，3对引物之间的摩尔比例为PAV∶GPV∶GAV＝2∶1∶1。

应用本发明的多重PCR反应检测小麦黄矮病的方法对田间复合侵染的小麦材料检测具有快速、省时、节约成本等优势。

附图说明

图1是三种病毒单重PCR检测结果：M：DNA分子量标准；1：健康小麦；2-4分别为PAV，GPV，GAV感染的小麦

图2是应用多重PCR对陕西各地区BYDVs种群的田间检测：1：DNA分子量标准；2：健康小麦；3-12：凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳和韩城感染黄矮病的小麦。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

引物的设计和合成：

根据BYDV-PAV株系杨凌分离物、GPV株系中国分离物、GAV株系中国分离物的外壳蛋白基因序列、DNAMAN软件计算引物Tm值，选择Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退火温度下同时检测到PAV、GPV和GAV 3种病毒。通过Primer Primier 5.0和Blast序列比对方法对引物进行互补性测试，选择互补性最低的引物对，优化多重PCR的引物，核苷酸序列为SEQ ID NO.1-6，由南京思特公司合成。

单重PCR反应：

总RNA提取：

小麦黄矮病株材采集自凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳和韩城。

分别称取PAV，GPV，GAV感染的小麦(分别标记为样品2、样品3、样品4)各0.1g于-80℃深冻研钵中，加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1.5mL eppendof管中，加入1mL BIOzol Extraction Reagent混匀，放置15min。加入0.2mL氯仿和0.3ml苯酚溶液上下倒置混匀，4℃12000×g离心15min。取上清液转入新eppendof管中，加入与上清液等体积的异丙醇，振荡混匀，-20℃放置30min。4℃12000×g离心15min，弃上清液。用1mL 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4℃12000×g离心5min，弃上清液，自然干燥。加入30μL DEPC水溶解沉淀。-80℃保存备用，获得3种病毒的总RNA，同时以健康烟草(标记为样品1)总RNA为阴性对照，提取方法同上。

RT反应

分别对每种病毒的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒cDNA第一链：25μLRT反应体系如下：2μL总RNA，1μL病毒引物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6)(10μmol/L)，7μLDEPC-H₂O，70℃变性5min，迅速置冰上2min；再加入5μL 5×RT buffer，5μLdNTP(各2.5mmol/L)，0.5μLRNase抑制剂(40U/μL)和1μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，离心后，42℃水浴1h，95℃灭活5min，置冰上待用，获得3种病毒的cDNA。

PCR反应

分别对每种病毒的cDNA进行PCR反应。25μLPCR标准反应体系：14.4μLddH2O，2.4μL10×PCR buffer[750mmol/LTris-HCl(pH8.8)，200mmol/L，(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween 20]，2μL25mmol/L，MgCl₂，2μLdNTP(各2.5m mol/L)，1μL上游和下游引物混合物(SEQ ID NO.1-6)(各10μmol/L)，0.2μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)和2μLcDNA模板。PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃终止补偿延伸10min。取5μLPCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析比较。

电泳检测

取5μL PCR反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到3条特异性条带，得到每种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图1。

多重PCR反应：

将RT产物作为多重PCR反应的模板，各BYDV特异性引物(SEQ IDNO.1-6)同时加入一个离心管中进行PCR反应。25μL反应体系的梯度设计，缓冲液浓度为0.9×，dNTPs浓度为0.4mM，Mg²⁺浓度为3.5mM，Taq DNA聚合酶浓度为0.06U/μL，退火温度54℃，延伸时间45s，循环次数30次。3对引物之间的比例为PAV∶GPV∶GAV＝2∶1∶1

PCR反应产物的纯化

(1)电泳检测PCR产物，紫外切割目标条带；

(2)将切割的凝胶装入一个预先称量好的干净1.5ml离心管后，称重。

(3)加相当于两倍体积凝胶的结合液DB(0.1g凝胶相当于100μL溶液)。

(4)将上述装有溶液的离心管放入56℃水浴，至胶完全溶解。每1-2分钟振荡一次以加速溶解。

(5)溶化后的凝胶溶液慢慢加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，离心12000rpm，1min，弃滤液。如过凝胶总体积超过750μL，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中，中间重复离心一次。

(6)加入700μL预先处理好的漂洗液WB于吸附柱AC中，离心12000rpm，1min，弃滤液。

(7)将吸附柱AC放回空离心管中，空离12000rpm，2min。

(8)将吸附柱AC放入干净的离心管中，慢慢加入预先预热的30μl洗脱缓冲液EB，室温静置2min，离心12000rpm，1min。

连接、转化和筛选

将纯化的目标片段与pMD18-T simple vector 进行连接，在PCR管中加入5.5μl的PCR纯化产物，0.5μL的pMD18-T vector，6μl的solution后，16℃1h或4℃过夜连接。转化感受态大肠杆菌E.Coli JM109病筛选。CaCl₂法制备感受态大肠杆菌，转化和筛选方法如下：

(1)取-70℃保存的感受态细胞置于冰上融化，加入10μL连接产物，冰浴30min。

(2)放入42℃水浴热激90sec后，立即置于冰上数分钟。

(3)加入预冷的液体LB培养液900μL，37℃摇床低速培养1h。

(4)室温下8000×g离心0.5min，吸去上清至剩余200μL，用移液器将沉淀轻轻悬浮。

(5)将悬浮液100μL均匀涂布在含50-100mg/mL Amp的LB平板(预先涂布4μL 200mg/mL IPTG和40μL 20mg/mL的X-gal)上，先于37℃将平板正放30min。然后倒置培养10-14h。

(6)筛选白色单菌落置3mL含50-100mg/mL Amp的LB培养液中，37℃培养8-12h。

重组质粒DNA的少量提取

经过PCR鉴定为阳性克隆的菌液扩繁后，进行重组质粒的提取：

(1)取4.5ml已扩繁菌液进行离心9000rpm，30s，弃上清，收集菌体。

(2)加入250μl溶液P1(第(1)步)涡旋振荡至菌体沉淀彻底悬浮。

(3)加入250μl溶液P2(第(2)步)，温和地上下翻转6-10次，至菌液清亮。

(4)加入400μl溶液P3(第(3)步)，立即温和地翻转，13000rpm离心10min，取上清。

(5)加入500μl溶液P4(第(4)步)于收集管上的吸附柱内，13000rpm常温离心1min，弃滤液进行平衡；将步骤(4)的上清液加入带有收集管的吸附柱AC中，13000rpm常温离心10min，弃滤液。

(6)加入500μl去蛋白液PE于AC管中，13000rpm离心1min，弃滤液。

(7)加入500μl已预先处理的漂洗液WB，13000rpm离心1min，弃滤液。

(8)重复步骤(7)一次。空柱13000rpm离心2min。

(9)加入60-100μl洗脱缓冲液EB于吸附柱内，静置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存备用。

重组质粒鉴定，目的片段的测定和同源性分析

对重组质粒进行PCR检测，将含有目标片段的阳性重组质粒寄送南京金思特生物技术有限公司测序。根据序列测定结果，在GenBank中用BLAST搜索同原序列，进行同源性分析。

测序结果表明，PAV、GPV和GAV的扩增产物分别由600、342、274bp，与设计的PCR产物大小相同。所得序列与参考序列的同源率分别达到99.24％、100％和100％。证明了多重PCR检测结果的可靠性。

利用多重PCR对陕西田间采集样品进行检测，得出病毒侵染在田间的不同组合(图2)。在杨凌的标样中检测出PAV、GPV和GAV，这证明多重PCR体系完全可以用于BYDV三种病毒种的检测，田间确实存在三种病毒的混合侵染，也说明了多重PCR可以快速灵敏的检测低浓度的病毒存在。

本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV三种病毒的方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其特征在于逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4×-0.9×；dNTPs浓度为0.1-0.5mM；Mg²⁺浓度为1.0-3.5mM；退火温度为51-55℃；循环次数为20-45次；延伸时间为30-55s。

2.根据权利要求1所述的方法，其中多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.8×或0.9×，dNTPs浓度为0.4mM或0.5mM，Mg²⁺浓度为2.5mM或3.5mM，退火温度54℃，延伸时间45s，循环次数30次。

3.根据权利要求1所述的方法，多重PCR反应的反应体系中，Taq DNA聚合酶浓度为0.04U/μL-0.06U/μL。

4.根据权利要求1所述的方法，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.9×，dNTPs浓度为0.4mM，Mg²⁺浓度为3.5mM，Taq DNA聚合酶浓度为0.06U/μL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中多重PCR反应的反应体系中，3对引物之间的摩尔比例为PAV∶GPV∶GAV＝2∶1∶1。