CN114807230A

CN114807230A - 一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法

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Publication number: CN114807230A
Application number: CN202210628309.XA
Authority: CN
Inventors: 孙毅; 朱文敏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-07-29

Abstract

本发明提供了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，针对SEQ ID NO:1所示的TET2基因片段设计CRISPR‑Cas9靶标序列，接着合成带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至lentiCRISPR v2载体中，获得靶向TET2基因两个不同位点的质粒lentiCRISPR v2‑TET2‑gRNA1、lentiCRISPR v2‑TET2‑gRNA2；将上述的质粒转染人骨髓间充质干细胞，培养24小时后，采用嘌呤霉素处理细胞进行药筛；将嘌呤霉素药筛后获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，并提取细胞基因组DNA进行鉴定。本发明能够实现较高的MSCs细胞TET2基因敲除效率。

Description

一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及人骨髓间充质干细胞，具体来说是一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)存在于骨髓、脂肪、脐带、外周血、牙龈等多种组织，具有分化为中胚层和外胚层谱系的能力。间充质干细胞可通过旁分泌等方式参与血管生成、组织修复等过程，目前间充质干细胞已广泛应用于多种退行性和炎症相关疾病的临床治疗及研究中，如移植物抗宿主病、脊髓损伤、多发性硬化症、红斑狼疮、肌萎缩性侧索硬化症、器官纤维化、糖尿病性肾病等。其中，骨髓来源的间充质干细胞具有更为优异的特性，是理想的种子细胞。然而，其临床应用存在一定的问题，骨髓间充质干细胞随着供体年龄的增长，或者体外培养细胞扩增次数的增加，干细胞增殖能力和分化潜能明显下降，细胞表现出衰老的状态，如成骨能力降低、细胞增殖缓慢、凋亡率增加、线粒体活性氧水平升高等。因此，深入研究其衰老特性对临床应用至关重要。

转位甲基胞嘧啶双加氧酶(Ten-eleven Translocation，TET)基因编码参与活性DNA去甲基化的关键酶。已有研究表明，TET2表达降低与海马成体神经干细胞(Neural StemCells，NSCs)的衰老有关。在异种共生小鼠模型中，海马区TET2表达得到恢复，TET2表达升高可使成年海马NSCs恢复活力。相反，年轻海马区TET2的敲除会减少神经发生和学习障碍。人类遗传学研究显示，随着年龄增长，体细胞TET2基因突变频率增加，而TET2体细胞突变导致年龄相关病理条件的风险增加，如癌症、心血管疾病和中风。以上研究均表明，TET2基因在衰老进程中具有重要的作用。我们先前研究发现衰老间充质干细胞中，TET2基因的表达降低，但是TET2基因如何参与调控衰老进程尚不清楚，因此，构建TET2的敲除细胞系，并以此用于TET2基因功能及与其相关的衰老调控机制或通路研究是极为重要的。构建成功的MSCs细胞系可用于衰老相关的蛋白水平表达、转录组分析以及其他多种实验用途。

现有技术常采用基因沉默、敲低、干扰的方法实现靶基因的功能缺失或降低，往往效率低、脱靶率高，而本发明采用目前较为成熟的CRISPR-Cas9基因编辑系统，基因打靶效率高、且鉴定方法较为简单、易于操作。

目前尚未有在人源骨髓间充质干细胞中实现TET2基因的敲除，而本发明弥补了现有技术中的空白，本发明还提供了TET2基因敲除的MSCs细胞系及以其作为细胞模型在研究TET2基因的功能及与其相关的衰老调控机制或通路中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，所述的这种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法要解决现有技术中的敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法效率低、脱靶率高的技术问题。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用CRISPR-Cas9系统实现人骨髓间充质干细胞中TET2基因敲除的方法，该方法步骤如下：

1)针对SEQ ID NO:1所示的TET2基因片段设计如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的CRISPR-Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:4、5和SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至lentiCRISPR v2载体中，获得靶向TET2基因两个不同位点的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2；

2)将上述步骤1)所述的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2转染人骨髓间充质干细胞，培养24小时后，采用嘌呤霉素处理细胞进行药筛；将嘌呤霉素药筛后获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，并提取细胞基因组DNA进行鉴定。由测序公司将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对；在基因水平测序验证突变细胞株后，采用斑点印迹法(Dot blotting)分析技术验证基因蛋白水平的敲除效果。

基因测序结果表明，构建的人骨髓间充质干细胞株成功实现目标基因340个碱基的删除，确定TET2基因敲除。斑点印迹法结果表明，突变体细胞株#2-MSCs显示整体5-hmC降低，表明基因TET2敲除成功。

上述步骤2)中提及的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2是以lentiCRISPR v2质粒为起始载体，先用BsmBI酶切并回收载体，再合成如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的两对带有接头的核苷酸序列，合成后稀释并退火作为插入片段；然后用T4 DNA连接酶在16℃连接5小时将载体和插入片段连接，连接产物转化，挑克隆测序鉴定获得。

上述步骤2)中提及的PCR反应体系包括2×Tag Mix E 25μL、SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示引物各2.5μL、H₂O 21.5μL、基因组DNA 1μL。

上述步骤2)中提及的PCR反应变性、退火条件为：95℃5min；94℃10s，30times；75℃1min，16℃2min。

3)验证CRISPR-Cas9在真核细胞中的敲除效率：将步骤1)所述的质粒lentiCRISPRv2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2转染至感受态293T细胞中，培养24小时后，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；将嘌呤霉素药筛后获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，并提取细胞基因组DNA；以该提取的DNA为模板，用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的TET2基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析进行TET2基因敲除验证。验证结果表明，构建的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA中含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示TET2基因靶标序列的gRNA，该gRNA能与trRNA构成特异的识别结构，从而引导Cas9酶特异的剪切TET2基因对应序列。

上述步骤3)中提及的细胞株为从无急性全身性疾病、恶性肿瘤或内分泌紊乱的接受骨折手术的患者中分离出来的骨髓间充质干细胞(MSCs)。

本发明首次在人源间充质干细胞中实现了基因TET2的靶向敲除。采用在同一外显子上设计gRNA序列，针对该外显子进行切割，可高效敲除TET2基因；采用PCR筛选CRISPR-Cas9介导的TET2基因组片段缺失，可以确定293T细胞的基因敲除效率；将含有所述gRNA的CRISPR-Cas9系统转染人骨髓间充质干细胞，可获得敲除TET2基因的细胞株。利用测序分析技术和Dot blotting分析技术验证基因敲除效果；本发明提供的CRISPR-Cas9敲除系统能够实现较高的MSCs细胞TET2基因敲除效率，为研究TET2基因的功能及与其相关的衰老调控机制或通路提供了有效方法。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明利用CRISPR-Cas9系统针对MSCs细胞设计了特异性强、脱靶率低的gRNA，从而实现了TET2基因的靶向突变，效果完整而彻底，提供了用于研究TET2基因的功能及与其相关的衰老调控机制或通路的理想细胞模型。(2)本发明中基于CRISPR-Cas9系统敲除TET2基因的方法，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底，更有利于研究TET2对细胞衰老进程的影响。(3)本发明采用多种方法，从基因和蛋白水平的检测都证实，TET2已被成功敲除，说明蛋白已被彻底改变，可能造成TET2功能的彻底丧失，适于对TET2基因的下游功能进行更加深入的研究。

附图说明

图1：利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除MSCs细胞TET2基因。图1为人类TET2基因位点和为TET2基因设计的靶向外显子3的两个gRNA的示意图，#1-gRNA到#2-gRNA之间的跨度为520bp。#1-gRNA、#2-gRNA分别为两个靶基因gRNA位点。

图2：PCR筛选CRISPR-Cas9介导的TET2基因组片段缺失，以确定293T细胞敲除效率。

图3：CRISPR-Cas9介导的TET2基因缺失后的DNA小片段测序分析。

图4：Dot blotting分析global 5-hmC；TET2突变体#2-MSCs显示整体5-hmC降低，表明基因TET2敲除成功。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，实施例均按照常规实验条件进行，如J.萨姆布鲁克等人所著的《分子克隆实验指南》，或按照试剂厂商说明书建议的条件。

实施例1：CRISPR-Cas9打靶载体的构建

(1)针对靶序列，设计gRNA

针对TET2基因，打开网站NCBI Pubmed，输入“目标基因名称：tet2、种属：人”，获取目的基因的基因组信息(基因名：TET2，基因ID号：54790，基因详细信息见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54790)，确定目标基因TET2的基因组序列位置，确定起始密码子ATG的位置，下载目标基因的基因组信息并将该文件命名“TET2 geneome fromGenebank”。由此获得TET2部分基因组序列(SEQ ID NO:1)：CAACCAAATG TCTCCGATTTGAGTGATAAG AAAGAATCTG TGAGTTCTGT AGCCCAAGAA AATGCAGTTA AAGATTTCAC CAGTTTTTCAACACATAACT。

使用Sanpgene软件，打开上述文件，为TET2基因设计靶向外显子3的gRNA，计算机会自动分析gRNA在基因序列上的位置以及该gRNA的off-target(脱靶)信息计算并给与评分，从中分别选择最优的上游1个靶序列，如SEQ ID NO:2所示；下游1个靶序列，如SEQ IDNO:3所示，具体如下：

表1靶序列

序列号	靶序列
		SEQ ID NO:2	GTTGTAGCCAGAGGTTCTGTC
SEQ ID NO:3	GTCACTCAAATCGGAGACATT

(2)合成靶标片段

上述设计的靶标拟克隆至真核表达载体lentiCRISPR v2(plasmid no.52961)。将靶标序列加上载体BsmBI限制性内切酶的粘性末端，送上海生工生物公司合成单核苷酸链。

在SEQ ID NO:2序列加上接头，合成得到插入片段TET2-gRNA1：

gRNA1-F：5’-caccGTTGTAGCCAGAGGTTCTGTC(SEQ ID NO:4)

gRNA1-R：5’-aaacGACAGAACCTCTGGCTACAAC(SEQ ID NO:5)

在SEQ ID NO:3序列加上接头，合成得到插入片段TET2-gRNA2：

gRNA2-F：5’-caccGTCACTCAAATCGGAGACATT(SEQ ID NO:6)

gRNA2-R：5’-aaacAATGTCTCCGATTTGAGTGAC(SEQ ID NO:7)

将每组gRNA-F和gRNA-R单核苷酸链合为双链，gRNA序列和互补序列形成双链DNA，10μL反应体系见表2，反应程序：37℃，30min；95℃，5min，自然降至室温，即获得双链gRNA，将形成双链的目的片段按照1:100稀释，此时可与载体连接，或-20℃保存。

表2合成片段形成双链体系

(3)载体酶切

lentiCRISPR v2空载体酶切，30μL反应体系见表3，55℃酶切2.5-3.0小时。BsmBI酶购买于Thermo公司，此酶说明书的酶切时间为5min，但我们延长酶切时间让其反应更充分。

表3 lentiCRISPRv2空质粒酶切体系

成分	用量
		lentiCRISPR v2	2μg(xμL)
NEB BsmBI	1μL
		10X NEB Buffer3.1	3μL
ddH<sub>2</sub>O	(16-x)μL

(4)酶切产物回收

lentiCRISPR v2酶切产物的回收纯化，根据AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。

1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇

4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12,000×g离心1min。弃滤液。

5)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

6)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。将制备管置回2mL离心管中，12,000×g离心1min。

7)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30μLEluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

8)所得纯化样品进行质量和浓度测定。

(5)靶序列与lentiCRISPR v2质粒连接

将形成双链的目的片段与载体lentiCRISPR v2连接，得到重组载体lentiCRISPRv2-TET2。10μL反应体系见表4，反应程序：16℃，5小时。

表4连接体系

成分	用量
		胶回收lentiCRISPR v2质粒	xμL
靶序列	1μL
		T4 DNA连接酶缓冲液	1μL
T4 DNA连接酶	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	7-xμL

(6)连接产物转化

1)从-80℃超低温冰箱中取出100μL大肠杆菌感受态细胞(DH5α)，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；

2)加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；

3)42℃水浴热激60s，冰上放置2min；

4)加入1mL LB/tube，切记在超净工作台中进行；

5)摇菌30min，离心至上清和沉淀分离；

6)弃上清800μL，其余混匀涂布在氨苄青霉素平板上；

7)平板在37℃下正向放置10min以吸收过多的液体，之后倒置培养过夜(约12h)；

(7)质粒提取

根据天根基因组DNA提取试剂盒说明书方法实施以下步骤：

1)从氨苄青霉素培养板上挑取单个菌落，打入含5mL氨苄抗生素的LB培养管中，37℃，220rpm，摇床培育12h。

2)取3mL的菌液，室温下10000×g/min离心1min收集细菌；

3)倒弃培养基。加入250μL Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；

4)往重悬混和液中加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次，孵育2min左右；

5)加入350μL Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；

6)室温下，13 000×g/min离心10min；

7)转移上清液至套有2mL收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下10000×g/min离心1min；

8)倒去收集管中的滤液，把柱子重新装回收集管，加入500μL HB Buffer，室温下10000×g/min离心1min；

9)倒去收集管中的滤液，把柱子重新装回收集管，加入700μL DNA Wash Buffer，室温下10000×g/min离心1min；

10)倒去收集管中的滤液，把柱子重新装回收集管，重复上步步骤一次；

11)倒去收集管中的滤液，把柱子重新装回收集管，13000×g/min离心空柱2min；

12)把柱子装在干净的1.5mL离心管上，向吸附膜的中间部位悬空滴加20μL(加两次，共40μL)Elution buffer，室温放置2min后，13000×g/min室温离心1min；

13)所提取到的质粒进行浓度测定。

这些质粒分别命名为lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2。

(8)测序鉴定及结果

将得到的两质粒送上海生工生物科技有限公司进行测序。测序引物是U6启动子的正向引物序列：5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3’(SEQ ID NO:10)。测序结果分析表明，片段TET2-gRNAs已成功克隆到载体lentiCRISPR v2中，原始序列与已知序列Blast完全一致，可以用于后续实验。

实施例2：验证CRISPR/Cas9在真核细胞中的敲除效率

(1)质粒扩增

2)加入1μL质粒(lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2)轻轻混匀，冰上放置30min；

3)42℃水浴热激60s，冰上放置2min；

4)加入1mL LB/tube，在超净工作台中操作；

5)摇菌30min，离心至上清和沉淀分离；

6)弃上清800μL，其余混匀涂布在氨苄青霉素平板上；

8)从氨苄青霉素培养板上挑取单个菌落，打入含5mL氨苄抗生素的LB培养管中，37℃，220rpm，摇床培育12h。

9)取5mL菌液转移至120mL含氨苄抗生素的LB培养瓶中，37℃，220rpm，摇床培育12h。

(2)大提质粒(根据AxyPrep质粒大量提取试剂盒说明进行操作)

1)取120mL在LB培养基中培养过夜的菌液；

2)加250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

3)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

4)加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000×g/min离心10min。

5)将质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中，开启并调节负压至0.02-0.04MPa，缓慢吸走管中溶液；

6)加500μL Buffer W1，吸尽管中溶液。

7)加700μL Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次。

8)将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，12000×g/min离心1min。

9)将制备管移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加60-80μLEluent或去离子水，室温静置1min。12000×g/min离心1min。

(3)TET2-gRNAs转染293T细胞

1)按0.1x10⁶/孔细胞数铺板，取293T细胞悬液(含1.2x10⁶个细胞)，加入6mL培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，悬匀铺入12孔板，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数细胞中期，细胞汇合度达到80％左右进行转染；

2)进行转染前1小时，用0.5mL Opti-MEM润洗细胞，去除后，加入1.7mL培养基(含10％胎牛血清，不含双抗，避免抗生素对脂质体转染的影响)，在37℃，5％CO₂培养。

3)制备转染复合物：取两支无菌EP管，两管先分别加入150μL opti-MEM培养基，再加入3ug TET2-gRNA至管1；加6μL lipofectamine2000至管2，温柔混合，室温孵育10分钟。再将管1与管2中液体温柔混合形成复合物，室温孵育20分钟。

4)将上述复合物加入到12孔板中，来回轻柔摇晃细胞培养板，将细胞放回37℃，5％CO₂培养箱继续培养。

5)24小时后去除转染液，用PBS清洗一遍，加入新鲜的培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)。

(4)嘌呤霉素筛选

1)转染24小时后，倒弃培养液，弃去培养基，PBS清洗两遍。

2)配制嘌呤霉素浓度为1.5ug/mL的培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，每孔加入2mL，进行药筛(嘌呤霉素储存浓度100mg/mL)；

3)药筛24小时后，观察细胞状态，判断是否需要换液。

4)药筛72小时，直至细胞死亡至40％-50％，弃去培养基，PBS清洗两遍，将细胞消化，一部分细胞低速离心后收集至1.5mL离心管备用；一部分重新铺板至10cm培养皿(吹散细胞至单个状态)，撤掉嘌呤霉素，换正常培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)培养。

(5)细胞DNA提取

DNA提取试剂盒为天根DNA快速提取试剂盒，操作步骤如下：

1)嘌呤霉素筛选72小时后，倒弃培养液，向细胞培养皿中加入1mL的PBS，轻柔洗涤，倒去PBS。用移液枪小心吸除多余的PBS。

2)用胰酶消化细胞，一部分细胞低俗离心后收集至1.5mL离心管备用；一部分细胞小心吹散成单个后铺入10cm培养皿。

3)向含一部分细胞的离心管中加入600μL裂解液LB，混匀放置3-5min，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

4)室温静置3-5min以充分裂解细胞。

5)将DNA吸附柱置于2mL收集管中，将上述裂解液全部转移到DNA吸附柱中，室温离心(12000rpm/min，1min)，弃滤液。

6)向DNA吸附柱中加入500μL用无水乙醇配制的洗涤液WB1，室温离心(12000rpm/min，1min)，弃滤液。

7)将DNA吸附柱重新放回2mL收集管中，加入700μL洗涤液WB2，室温离(12000rpm/min，1min)，弃滤液。

8)重复步骤5两次。

9)将DNA吸附柱重新放回2mL收集管中，于室温12000rpm/min空柱离心1min后，置于新的1.5mL无核酸酶污染离心管中。开盖于室温静置或超净工作台风干3-5min，以彻底挥发残余的乙醇。

10)向吸附柱柱膜中央上方小心加入35-100μL无核酸酶污染纯水，室温静置3-5min，12000rpm/min离心1min。洗脱液即为DNA溶液。

(6)PCR扩增

以嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA为模板，用下列引物进行扩增：

TET2-F引物：5’-CAGCTGTCTTGATCGAGTTA(SEQ ID NO:8)

TET2-R引物：5’-AATTGGACACCCATGAGAGC(SEQ ID NO:9)

50μLPCR反应体系见表5。PCR反应程序为：95℃5min；94℃10s，30times；75℃1min，16℃2min。

表5 PCR反应体系

成分	用量
		2×Tag Mix E	25μL
F1+F2	2.5μL
		H<sub>2</sub>O	21.5μL
基因组DNA	1μL

将PCR产物取5μL，PCR筛选CRISPR-Cas9介导的TET2基因组片段缺失，经2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析实验结果，如图2所示，表明293T细胞敲除效率高效。

实施例3：构建TET2基因敲除人骨髓间充质干细胞株并鉴定敲除效果

(1)传代细胞准备：

1)本研究获得同济大学医学院以及同济医院伦理委员会批准。#1、#2和#3骨髓间充质干细胞(MSCs)从无急性全身性疾病、恶性肿瘤或内分泌紊乱的接受骨折手术的患者中分离出来。

2)将MSCs细胞培养在完全培养基中，温度37℃，含5％CO₂，当细胞汇合度达到90％时传代。MSCs完全培养基：10％FBS+DMEM/F-12+NEAA或者购买自Cyagen，货号为HUXMA-90011的骨髓间充质干细胞完全培养基。

3)使用0.25％胰酶消化细胞进行传代铺板：将12mL细胞悬液(3x10⁶)均匀铺板到6孔板中，次日当细胞达到70～90％汇合度时准备转染。

(2)细胞转染：

1)用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine 2000试剂，并充分混匀；

2)用Opti-MEM培养基稀释大提好的质粒lentiCRISPR v2-TET2，制备DNA预混液，加入Lipofectamine 2000试剂，并充分混匀；

3)将以上两种混合液按照1∶1的比例混匀，然后在室温下孵育5分钟，形成DNA-脂质体复合物，并加入到细胞中，在37℃下恒温培养箱中培养24小时后换液；

(3)嘌呤霉素筛选

1)转染24小时后，倒弃培养液，弃去培养基，PBS清洗两遍。

3)药筛24小时后，观察细胞状态，判断是否需要换液。

(4)细胞基因组提取：将流式分选获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，以2000rpm离心5分钟，弃尽上清，使用天根基因组提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤将细胞基因组提取出来。

(5)基因水平验证：由测序公司将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定TET2基因敲除，序列分析如图3所示。

(6)蛋白水平验证：在基因水平测序验证突变细胞株后，采用斑点印迹法(Dotblotting)，使用abcam公司5-hmC抗体与检测试剂，操作方法如下：

1)膜的处理：戴上干净手套，取一张硝酸纤维素膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。

2)DNA变性：将目标DNA样本溶于1×TE(pH8.0)缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加入小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，然后迅速放入冰水中。

3)点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μL变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后晾干。

4)封闭：将膜置于封闭液(5％脱脂奶粉溶于超纯水中)室温封闭一小时(也可4℃过夜封闭)

5)杂交：弃去封闭液后，加入含有待检样品第一抗体的TTBS缓冲液30mL，抗体稀释度为1：1000，且其中含有1％的脱脂奶粉，室温震荡孵育一小时。

6)将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液充分淋洗两次，每次洗后都尽量弃去溶液。然后再用TTBS缓冲液震荡洗涤3次，再次5分钟。

7)弃去液体后，加入含有第二抗体的TTBS缓冲液30mL(抗体稀释度为1：2000)，室温震荡孵育1小时。

8)重复步骤6)，取出硝酸纤维素膜，加入适量的荧光显色剂A、B(4mLA、B混合液，且A液:B液＝1:1)。

9)取出硝酸纤维素膜，放在曝光夹上，根据样品及标准品的亮度，初步确定曝光时间。

10)曝光后，取出胶片浸于显影液中，在红光下观察，直到胶片上的样品点不再变化为止，取出胶片在水中涮洗一下，再放入定影液中，当胶片本底呈现蓝色透明后，即可取出胶片进行流水冲洗，洗净后晾干即可。

实验结果分析发现TET2突变体#2-MSCs显示整体5-hmC降低，表明TET2基因敲除成功，结果见图4所示。

通过以上DNA水平以及蛋白水平的验证，证明TET2基因敲除的MSCs细胞构建成功，#2-MSCs表示3号外显子突变产生的敲除细胞株。

序列表

<110> 朱文敏

<120> 一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

caaccaaatg tctccgattt gagtgataag aaagaatctg tgagttctgt agcccaagaa 60

aatgcagtta aagatttcac cagtttttca acacataact 100

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgtagcca gaggttctgt c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcactcaaa tcggagacat t 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccgttgta gccagaggtt ctgtc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacgacaga acctctggct acaac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgtcact caaatcggag acatt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacaatgtc tccgatttga gtgac 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagctgtctt gatcgagtta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aattggacac ccatgagagc 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagggcctat ttcccatgat tcc 23

Claims

1.一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）针对SEQ ID NO:1所示的TET2基因片段设计如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的CRISPR-Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:4、5和SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至lentiCRISPR v2载体中，获得靶向TET2基因两个不同位点的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2；

2）将步骤1）所述的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2转染人骨髓间充质干细胞，培养24小时后，采用嘌呤霉素处理细胞进行药筛；将嘌呤霉素药筛后获得的贴壁细胞处理为细胞悬液，并提取细胞基因组DNA进行鉴定。

2.如权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，其特征在于，所述质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2是以lentiCRISPR v2质粒为起始载体，先用BsmBI酶切并回收载体，再合成如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的两对带有接头的核苷酸序列，合成后稀释并退火作为插入片段；然后用T4 DNA连接酶在16℃连接5小时将载体和插入片段连接，连接产物转化，挑克隆测序鉴定获得。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，其特征在于，为验证CRISPR-Cas9在真核细胞中的敲除效率，将权利要求1步骤1）所述的质粒lentiCRISPR v2-TET2-gRNA1、lentiCRISPR v2-TET2-gRNA2转染至感受态293T细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的TET2基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析TET2基因敲除效果。

4.如权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人骨髓间充质干细胞TET2基因的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括2×Tag Mix E 25μL、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示引物2.5μL、H2O 21.5μL、基因组DNA 1μL。

5.权利要求1所述方法在检测基于TET2-gRNAs的CRISPR-Cas9人骨髓间充质干细胞中TET2基因敲除鉴定中的应用。

6.权利要求1所述方法在检测TET2基因敲除细胞系是否存在脱靶现象中的应用。

7.权利要求1所述方法获得的TET2基因敲除的人骨髓间充质干细胞系。