CN110791552B - 一种基于ngs方法检测ntrk-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒 - Google Patents

一种基于ngs方法检测ntrk-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NGS方法检测NTRK‑1‑2‑3融合基因变异的探针池及试剂盒。所述探针池选自核酸序列如SEQ ID NO 1～74所示的探针中的至少一种，其试剂盒适用于FFPE、新鲜组织的，基于NGS方法针对NTRK‑1‑2‑3融合基因变异的检测。其根据NTRK‑1‑2‑3融合基因变异高度相关的区域设计捕获探针，覆盖率高而均一，提高了融合检测的特异性。其文库转化率高，RNA使用量低，测序成本低。本发明覆盖热点靶向突变基因，探针捕获特异性高，此外一个产品解决多种泛癌种NTRK‑1‑2‑3融合基因检测的需求，以及临床上样本凑样问题，减少实验工作人员重复工作的复杂问题。

Description

一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池技术领域，特别涉及一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒，以弥补国内市场NTRK融合基因检测的空白。
背景技术
高通量测序技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短为标志。Illumina测序平台是现在主流的二代测序平台，可以同时检测到常见、罕见突变、基因融合、基因扩增等基因不同突变，指导靶向用药、揭示耐药机制。
NTRK-1-2-3基因融合属于染色体改变，其结果会产生构象激活的异常TRK融合蛋白，其作用为肿瘤驱动因子，在肿瘤细胞系中可促进肿瘤细胞的增殖和存活。FDA已批准TRK抑制剂Larotrectinib(商品名为Vitrakvi)，用于治疗无已知耐药突变的，广泛转移或局部手术治疗效果不好的，现有治疗方案进展或无可替代治疗方案的，NTRK基因融合的成人和儿童实体瘤患者，并且疗效显著。Larotrectinib在多种独特的肿瘤类型中显示了较为明显的临床获益，包括肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、结肠癌、软组织肉瘤、涎腺肿瘤和婴儿纤维肉瘤等。
但是，目前国内市面上还未有NTRK-1-2-3融合基因检测试剂盒，因此急需研发出NTRK-1-2-3检测试剂盒，以弥补NTRK-1-2-3融合基因检测空白的现象。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种探针池，基于二代测序技术，通过杂交捕获靶向富集的工作流程，用于泛癌种患者NTRK-1-2-3融合基因的精准分子诊断技术。
本发明主要基于二代测序方法，针对泛癌NTRK-1-2-3融合基因设计探针池，通过靶向捕获测序的方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异。本发明所述的探针池，其选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1～74所示的探针中的至少一种，进一步，优选自核酸序列如SEQ IDNO.1～74所示的探针中的n种，其中n为2、3、4、5……～74的整数。本发明所述的全部74个探针，其所针对的癌基因，覆盖了包括16个NTRK融合高度相关的基因，LMNA-NTRK1、TFG-NTRK1、TP53-NTRK1、TPM3-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、AFAP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、BEND5-NTRK2、CPEB1-NTRK3、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。优化的探针池，其包括融合基因序列为SEQ ID NO 1～74组成的全部探针，可以用于泛癌患者的精准治疗，同时适用于FFPE组织，新鲜组织的基因变异检测。
本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，包括上述的探针序列为SEQ ID NO 1～74所示的探针组合物中的至少一种，该试剂盒基于NGS方法探针池检测NTRK-1-2-3融合基因泛癌种，且同时适用于FFPE、新鲜组织的变异检测。
利用上述探针组合物或上述的试剂盒，可用于基于高通量测序方法的NTRK-1-2-3融合基因检测，其检测过程包括：样本采集，样本RNA提取，RNA逆转录合成cDNA，末端修复加A，连接，标签PCR扩增，杂交、捕获富集等，并进行NGS上机测序，针对测序后的数据进行分析，判断样本变异类型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)针对每个融合变异位点设计探针，覆盖度高而均一，且捕获探针长度为120nt，保证探针的高特异性。同时检测16个NTRK-1-2-3融合基因变异，覆盖热点靶向突变基因，且降低检测成本。
2)采用自主建库技术，文库转化率高，降低了RNA使用量的要求(低至50ng)，同时可以有效利用测序数据，降低测序成本。
3)对于一个第三方检验实验室或者企业来讲，可一个产品解决所有泛癌种NTRK-1-2-3融合基因检测的需求，解决探针合成成本问题，以及临床上样本凑样问题，减少实验工作人员重复工作的复杂问题。
4)本发明提供的试剂盒设计时加入了临床实验期的药物靶点。有助于实现产品从实验室向工业应用的转化，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本试剂盒名称为：NuoCancerTMNTRK Gene For Tissue(NTRK融合基因检测试剂盒，基恩生物科技(大连)有限公司；可以通过商业途径购买获得)，以下实验均按照该试剂盒说明书进行操作。
本申请下述实施例中，试剂盒的设计选择了16个NTRK融合高度相关的基因，LMNA-NTRK1、TFG-NTRK1、TP53-NTRK1、TPM3-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、AFAP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、BEND5-NTRK2、CPEB1-NTRK3、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。
实施例1
本发明建库杂交捕获流程采用的验证方法如下：
一、从医院收集的FFPE或者新鲜组织中提取RNA。
1.以下操作需要在不含RNase和DNase的环境下进行。
2.定量，RNA的最佳范围是40ng-500ng之间(总量)。
3.Agilent Technologies 4200Bioanalyzer质检RNA片段完整，主峰在200bp-6000bp之间，且18s，28s均可质检出片段。
二、RNA逆转录合成cDNA。
1.RNA片段化
(1)取5μL RNA样本，以及5μL FBS1混合均匀，瞬时离心。
(2)设置以下程序在PCR仪上进行反应，热盖温度均设置为94℃。
2.合成第一链cDNA
(1)取出片段化试剂，按照下表要求加入以下试剂，混匀。
组分 体积
上一步片段化反应液 10μL
SEM1(一链合成酶) 1.5μL
Nuclease-free Water(无核酸酶水) 8.5μL
总体积 20μL
(2)设置PCR仪程序，25℃，10min；42℃，15min；70℃，15min；4℃，∞上进行反应，热盖温度均设置为105℃，运行。
3.合成第二链cDNA
(1)取出第一链合成cDNA反应液，加入SB2(二链合成缓冲液)试剂8.5μL，SEM2(二链合成酶)试剂3.5μL，Nuclease-free Water试剂48μL，混匀，瞬时离心，16℃，60min，程序结束后立即进行下一步反应。
4.磁珠纯化：
(1)磁珠提前20min平衡至室温。
(2)将二链合成后的反应液转移到1.5mL管中，加入144μL磁珠，混匀，室温孵育5min。
(3)将离心管放磁力架上，待管内溶液澄清，约2min，弃上清。
(4)离心管放磁力架上，加200μL 80％乙醇，静置30sec，弃上清。
(5)重复用80％乙醇清洗一遍，弃上清，并室温开盖晾干磁珠。
(6)加入37.5Elution Buffer液体重悬磁珠，室温孵育5min。
(7)置磁力架上，2min，将36.5μL Elution Buffer至新的PCR管中。
5.cDNA合成后质控
定量，使用生物分析仪生物分析仪进行条带分析。cDNA浓度大于1ng/uL，主峰在100bp-400bp，则合格，可进入下一步反应。
三、cDNA末端修复、加A
1.取出cDNA纯化后溶液，加入5μL ERB(末端修复尾端加A缓冲液)，10μL ERA(末端修复尾端加A酶混合液)，混匀，离心。置于PCR仪中，“4℃，1min；20℃，30min；65℃，30min；4℃，∞”，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步。
四、接头连接
1.取出加A后的反应液，加入10μL LIG(DNA连接酶)，20μL LIB(DNA连接缓冲液)，15μL Nuclease-Free Water，以及5μL SUA(illumina测序平台通用短接头)，混匀，瞬时离心。
2.置于PCR仪中，“20℃，15min；4℃，∞”，运行，达到4℃时，进行下一步。
五、连接后纯化
1.取80uL磁珠加入连接后溶液中，混匀，室温孵育5min。
2.置于磁力架上，2min，直至溶液完全澄清，弃上清。
3.保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复80％乙醇清洗一次，完全弃上清。
4.室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
5.加入26.5μL Elution Buffer，充分涡旋重悬磁珠，室温孵育5min。
6.置于磁力架上，2min，待上清澄清后取25μL上清至新的PCR管中。
六、加标签，文库扩增
1.取出纯化后溶液，加入25μL HPM(增强型PCR混合液)，5μL CPM((唯一标签引物混合液))混匀，瞬离。
注：不同子文库CPM编号不同。
2.设置以下程序在PCR仪上进行反应，热盖温度设置为105℃，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步纯化工作。
七、加标签，文库扩增
1.取50μL磁珠加入上述反应后的PCR管中，混匀，离心，室温孵育5min。
2.将PCR管放置在磁力架上，静置2min，待溶液澄清，弃上清。
3.保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复80％乙醇清洗一次，完全弃上清。
4.室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
5.加入27μL Elution Buffer，充分涡旋重悬磁珠，室温下孵育5min。
6.置于磁力架上，2min，待上清澄清后取26μL至新离心管中。
八、子文库质控
定量，Agilent 4200生物分析仪进行条带分析。子文库浓度大于20ng/uL，主峰在150bp-500bp，则合格，可进入下一步杂交反应。
九、子文库样本pooling混合、浓缩和杂交
1.子文库样本pooling混合
(1)将不同CPM编号的RNA文库分别取500ng，加到1.5ml低吸附离心管中，同时加入7.5μLHCD(人cot脱氧核糖核酸片段)，记录混合文库总体积，加入2倍体积的磁珠进行浓缩。(注：不同Index编号的RNA子文库可pooling在一起，最多12个子文库pooling在一起；同一编号的Index子文库需分开杂交)
2.混合文库浓缩
(1)移液器上下吸打混匀。瞬时离心，室温孵育10min。
(2)将离心管放置在磁力架上，待溶液完全澄清，约2min，弃上清。
(3)保持离心管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清，重复该步骤一次，且完全去除残留酒精。
(4)室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
3.杂交
(1)提前配置下表杂交混合液。
组分 体积
HYB(杂交缓冲液) 9.5μL
HYE(杂交增强缓冲液) 3μL
HUB(杂交阻断剂) 2μL
CPR-NTRK(NTRK探针) 4.5μL
总体积 19μL
注：NTRK探针即为本发明所述的SEQ ID NO.1～74所示探针混合物。
(2)加入19μL配好的杂交混合液，重悬磁珠，磁力架静置2min。
(3)将17μL上清转移至新的PCR管中，置于PCR仪上，95℃运行30sec，65℃杂交过夜(16h～20h)，热盖温度设为100℃。
十、捕获、洗脱
1.试剂准备
(1)试剂准备：按照下表(1个样品)将试剂稀释到1x工作液，可于室温放置最多放置4周。
(注：将分装好的1xWB1和1x SWB提前30min放置于65℃下温育)
2.磁珠准备：
(1)提前取出链霉亲和素磁珠，涡旋混合均匀，室温平衡30min。
(2)取50μL链霉亲和素磁珠至低吸附离心管中，加入100μL1x清洗液1，置于磁力架上，直至管内溶液完全澄清，小心移除上清，重复两次，共清洗两次。
3.水浴锅准备：提前将水浴锅调至65℃。
4.捕获
(1)转移转移PCR仪上的杂交产物到上一步的磁珠中，用移液枪吸打10次混匀，置于PCR仪上“65℃45min”，PCR仪热盖温度设为75℃。
(2)每隔10min，移液器混匀。45min后，立即进行捕获后清洗步骤。
5.热清洗
(1)加入100μL65℃预热好的1x清洗液1到上述PCR管中，用移液枪吸打10次混匀，放置于磁力架上，静置1min，小心移除上清。
(2)加入150μL65℃预热好的1x增强型清洗液，重悬磁珠，用移液混匀。瞬时离心，65℃水浴锅中孵育5min。置于磁力架上2min，弃上清。
(3)重复上一步，即加入150μL65℃预热好的1x增强型清洗液，重悬磁珠，用移液枪吸打10次混匀，尽量避免产生气泡。瞬时离心，65℃水浴锅中孵育5min。置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
6.室温清洗
(1)加入150μL室温放置的1x清洗液1，移液枪吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。
(2)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清。
(3)加入150μL室温放置的1x清洗液2，移液枪吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。
(4)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋震荡30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清。
(5)加入150μL室温放置的1x清洗液3，移液枪吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。
(6)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋震荡30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清。
(7)瞬时离心，彻底清除残留液体，避免吸到磁珠。
(8)离心管置于磁力架上，室温开盖，干燥磁珠，勿太干。
(9)加入20μL无核酸酶水，吸打混匀。
十一、富集
1.配置以下反应体系，吸打混匀，保证磁珠均匀分散在溶液中：
2.设置以下程序在PCR仪上进行反应(单个子文库杂交)，PCR仪热盖温度设置为105℃，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步纯化工作。
3.富集后纯化
(1)磁珠提前20min平衡至室温，取80μL磁珠加入上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，瞬时离心，室温孵育5min。
(2)将PCR管放置在磁力架上，等待2min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。
(3)保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复该步骤一次，完全去除残留乙醇。
(4)室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。
(5)加入22Elution Buffer到离心管中，重悬磁珠，室温下孵育5min。
(6)置于磁力架上，2min，待上清澄清后取21μL至新的PCR管中。
十二、文库质控
定量，Agilent 4200生物分析仪进行条带分析。混合文库浓度大于3ng/μL，主峰在200bp-500bp，则合格，可进入测序环节。
实施例2阳性标准品检测：
1.从SeraCare公司购买国际通用标准品(SeraCare：FFPE NTRK Fusion RNAReference Material)。
2.Qubit定量，NTRK-1-2-3阳性标准品采用50ng逆转录。
3.采用核苷酸序列如SEQ ID NO 1～74所示的探针池，按照实施例1所述方法进行建库，测序，使用Illumina平台测序。
4.NTRK-1-2-3阳性标准品检测数据，如下表1：
表1.NTRK-1-2-3阳性标准品检测数据
Fusion RNA 断点1 断点2 断点1深度 断点2深度 频率
LMNA-NTRK1 chr1:156108398 chr1:156844697 1061 674 48％
IRF2BP2-NTRK1 chr1:234744192 chr1:156844362 457 4724 49％
SQSTM1-NTRK1 chr5:179252226 chr1:156844362 2635 305 29％
TFG-NTRK1 chr3:100451516 chr1:156844362 1348 8043 12％
AFAP1-NTRK2 chr4:7780488 chr9:87356806 25 2440 72％
NACC2-NTRK2 chr9:138905044 chr9:87359887 3479 2006 57％
PAN3-NTRK2 chr13:28713224 chr9:87549076 5735 657 52％
ETV6-NTRK3 chr12:12006497 chr15:88576274 657 5248 24％
BTBD1-NTRK3 chr15:83710479 chr15:88576276 327 5248 83％
测试总结：NTRK-1-2-3融合panel共设计16个融合基因位点，其中阳性标准品中涵盖本发明panel中的9个融合基因，分别为LMNA-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、TFF-NTRK1，AFAP1-NTRK2、NACC2-NTRK2、PAN3-NTRK2、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3融合基因的突变，均检测出，剩余7个融合位点因为标准品局限性未涵盖，因此无法提供测试结果，但是由此可以证明本试剂盒实验方法和探针捕获的技术可行性。同时由此证明本发明所述方法可以一次同时检测16个NTRK-1-2-3融合基因变异的技术可行性，覆盖热点靶向突变基因，检测成本低，便于产业化应用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 基恩生物科技（大连）有限公司
<120> 一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒
<130> 2019
<160> 120
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TGACAGAGCA TGACTCTGTC TCGAACAACA AACAAACAAC CACAACAAAA CACTAATGGT 60
TTTATTATCT AATTAAAGAC TGAATACAAG ATCCTCTCGA TTTCTGTTAT CTTTGTAACT 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AGCTGAAAAA TGACTCTATC TGACAGTAAA AGGGACCTAG TCAGGGCAGT CTTCATCTGA 60
GCAGGTAATT GTAGTTTCTT TTGCAACATA TTAATAAGAG AAGTATTATT TTAACACACT 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CCACAACTCA TTGTATAAGG CCAACATCAT CTTGATACCA AATCCTCACA GAGGCACAAC 60
AACAAAAAGA ACTTTAGGCC AATATCCTTG ATGAACATTG ATGCAAATAT CCTCAACAAA 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
CAATAAATTA AAACAGGATG TTATCGTCTA TCTTAATCAG GACTTGGAAA AAATATGGCC 60
TCATAACCAG TACCTTTGTA AGACATGATT ATGAAGCCAA TATACTAAAG TATTAAAATC 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
GGCTGAGGCA CAAGAATTGC TTGAACCTGG GAGGCAGAGG TTGCAGTGAG CCAAGTCTGC 60
GCCACTGCAC TCCAGCCTGG GTGACAGAGT CAGACTCTGT CTCTAAAAAA AAAAAAAAAT 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TCTGTCCATA TGCTCTTCGT AAGAGACACA CCTAAAACCA GGGAAATAAT AATCAAAATG 60
AACTGGTATG AAAATATTAG TATCAGACAA ATTAGTCTTT AAGTCATATG CAATTTAGGG 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
TCTCATGATA AAACTTGAGC AGATGAGGAG TTAATTCTTA TGGATGAGCA AAGAACGTGG 60
TTTCTTTAGA TGATGGAATC TACTGTTAGT GAAGAGGCTA TGAACATTGT TGAAATGACA 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
AGAGAATTCT CTGTAACTGA AATTAGTGAA ATAATTTTAT TTCTCACTAT ATTTAGCAAG 60
TCGTATGCTT CAGGCAGACC TCAAATACTG CCACATTGTT AAACTAATCC AAACTACAGT 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
GTTTTCCTCT GGAAAAAAAA ATATTTATAT ATATACCTGG GAATTTGAGA AAGGATTAGA 60
CAGTCACTAA CCACACATGT CCTGGTTACT CTCGTCACCT CTTACCTTCC GTTTTCTTAT 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ATATATACCT GGGAATTTGA GAAAGGATTA GACAGTCACT AACCACACAT GTCCTGGTTA 60
CTCTCGTCAC CTCTTACCTT CCGTTTTCTT ATAATAGAAT GTCTGGTTCC TACAATTTAA 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
GCTCGAACTG GGTGGAGCCC ACCACAGCTC ACGGAGGCTT GCCTGCCTCT GTAGGCTCCA 60
CCTCTGGGGG CAGGGCACAG ACAACAAAAA GACAACAGTA ACTTCTGCAG ACTTAAATGT 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
CCAAAAGTAG ATAAAACCAC AAAGATGGGG AAAAAACAGA ACAGAAAAAC TGGAAACTCT 60
AAAACGCAGA GCGCCTCTCC TCCTCCAAAG GAACGCAGTT CCTCACCAGC AACGGAACAA 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
CCACAAAGAT ACTCCTCGAG AAGAGCAACT CCAAGACACA TAATTGTCAG ATTCACCAAA 60
GTTGAAATGA AGGAAAAAAT GTTAAGGGCA GCCAGAGAGA AAGGTCGGGT TACCCACAAA 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
AGACATCTAC AGAACTCTCC ACCCCAAATC AACAGAATAT ACATTTTTTT CAGCACCACA 60
CCACACCTAT TCCAAAATTG ACCACATACT GGGAAGTAAA GCTCTCCTCA GCAAATGTAA 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ACTATTCCAA TCAATAGAAA AAGAGGGAAT CCTCCCTAAC TCATTTTATG AGGCCAGCAT 60
CATTCTGATT CCAAAGCCTG CCAGAGACAC AACAAAAAAA GAGAATTTTA GACCAATATC 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
CAAAAAACCA AACACCGCAT ATTCTCACTC ATAGGTGGGA ATTGAACAAT GAGATCACAT 60
GGACACAGGA AGAGGAATAT CACACTCTGG GGACTGTTGT GGGGTGGGGT GAGGGGGGAG 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
GGGAGATATA CCTAATGCTA GATGACGAGT TAGTGGGTGC AGCGCACCAG CATGGCACAT 60
GTATACATAT GTAACTAACC TGCACAATGT GCACATGTAC CCTAAAACTT AAAGTATAAT 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
AAATCTGGAG AACTTACACT GTCCTATTTC AAGAATTACA ACAAAGCTAC AGTAATCAAG 60
ACATTGTGAT ACTGACAAAG AATAGACATT CAAATCAACG GAATGGAAAT AATTCAGAAA 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
CTGTTTTGGT TACTGTAACC TTGTGACATA GTTTGAAGTC CAGTAGTGTA TGCCTCTGGC 60
TTTGTTTTTT CTGCTTAGGA ATACTTTGAC TATTCAGGCT CTTTTTTTGG TTCTGTATAA 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
CAATGGCAAT GCTTCCAGTT TTTCCCCATT CAGTATGATG TTGGTTGTGG GAGTTTGTCA 60
TAGATGACTC TTGTTATTTT GAGGTATATT CTTTTGATAC TTAGTTTGTC AAGGGCTTTT 120
<210> 21
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
CCGTTTTTAA CATGAAGGGG TGTTTGAATT TTATCAGATA TTTTTCTGCA TCTATAGAGA 60
TGATCATGTG GTTTATGTTT TTAGCTTTAT ATGTTTAATC ACATTTATTG ATTTGTTTAT 120
<210> 22
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
CTGAAATCTT TCTAACTTCT TAAGGTTTAG TGCTGTAAAC TTTCCTTAGA AGACTGCTTT 60
AGCTGTATCC CAGAGATTCT GGCACATTGA GTCTTTGTTT TCATTAGCTA CAAACAAAAA 120
<210> 23
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
CTACCTGTCT GACAGGATCA ATCATACCTC AAACTTCAGC ATCACACAAT ATACCCACAT 60
GACAAATGTG CACTTGTATA CCCCCATGAA TCTAAAATAA AAGTTGAAAT TTTTAAAAAC 120
<210> 24
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
TCAAACTATT TGATTTAATC ACACTTGCAA GTTTCCTTTT ACATATGTAC CACAGTCACA 60
TGTTCTGGGG TTTAAGATGT GGGTACTTTT GGGGCATCAT TCTGCCTACC ATAAGGTGAT 120
<210> 25
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ATAAGGTGAT ACAACCAGAA CCGGCTTTTT AATTTGCAGA GTCCAGTGTA AAATGAAATG 60
CAGGACTCCA TATTAAACAA TTGTTAAGAA TCTCAAGATA GCCACAGCAG AGCATAAAAC 120
<210> 26
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
CATTATATTT CTTGTGATTT ATTTAATAAT TATATTAATA CCTGAATTAA ATACAAGGGC 60
CTAATATGCG ATTCTTTTAT ATCTTGCCTT GATCTTAGTA ACTAGGTTTA TTTTTACTTT 120
<210> 27
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
GTAATAGTTA AATAATTTTT TAATAAAATA AAATAAATGC ACAACAAGAG GAATGATTAA 60
GTATAATTTG ATTCAATCCA ATAACATAGA ATACCATACA ACCATTAGCT GTGATCATAG 120
<210> 28
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
AGCACCAAAG GAATTTTGTA GTTGTTTGGT TGGTTGGTTT TACTTTGTTT TAACATGAAT 60
GCCCAAGCTC CATCCAAGGG ATCTACTTAA TCAGAATCTC CAGAGTTTAG ACAAGATAAA 120
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
AATGGCTGAG TGGATAATGG CAGGAGACAT CTTTAGCTAC CATGAAAAGT ATTAAGCCAA 60
TGTGTTTGTT GAATTCATTT TGCTGGTGGT CACTTTGTGT TCATTCTGAA CATCCAGCAG 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
AGGAGAAGCT ACAGAGCATT TGGAGAAGAG CTTGTAAAGA CAGAAGGAGT CCCAGTTGCA 60
GGGATCCCAT ATGTTAAGTC ACATGGGTGG ACATTATGAG GAGGCATGAT GAGGAGTCAA 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ATCCTAGCAC TTTGGGAGGC AGAGGTGACT GAATTACTTG AGCTCAGGAG TTCAAGACCA 60
GCCTGGGCAG CATGGCAAAA CCCCATCTCT ACAAAAAATA CAAAAATTAG CCTGGCATGG 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
GGCTCACTGG CAAAATGACT TTAAAAGCAA AGGCTGTGGA GCCAACTTTT CTGGTTCAAA 60
TCCAAGCTCT CTATATGCCA GCACAGGATC TTGAGCACAT TATTATTCCT CCTGGAGCTC 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
TATCTATCTT ATATGTATTA TCCTCTATAT AATTTTCTAA TTATCGTAGT TATCTTTATT 60
AGGTCAAATT TATTAATAAT CGGTTTGGAT TTTATTAACA GAACACTTTC TCTTATGGGA 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
TTAAAATCAT ATGAGGGTTA TAAAAGTTTA CACTTTTTCT TTTTGGGACT TTTCTTATAC 60
ACAATATTTT CATATCGGAC TATTCTTATA TATATAATGT TTCGTATTTT TCACGTTTAA 120
AATACGCTTA TTACGTCGAT TATAAATTTG TCTAGTTAAT CACGTTCTTT TTTATTATCG 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
CATAGTTAGT TGACAGTATC TTTAATCTTC AGATCTATAT TTTTCTTTCC AGGATTTATA 60
TATTTTCATT CGGTTATAAT TTTATTAACA TAAAATTCTA TTTTCGTGAA TGAGTTTCAA 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
AAATTATTGA CGTGTGTCTG ATTATTAGTA ATTCTATTGA ATTGCTGTTA TATTCTCATA 60
CTAGTATTTC TTTTATAAGT AACCATTTTG AATTTTTTAC ACTTCCTTAT GAACAATTTA 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ATATTATCTG TCTGATTATT GTAAATTCCG CGCATTATTG TTATGTTACC GCATTTATTT 60
CGCTTTATAA GATTTATTAA ACTGTAATAG ACTAATTTTA CATTATTTAT GTCTTTAATA 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
TGTTGTGTTT TGTTTTTATT TTGACTTCAA TTTTTAATTA TTTTATGCAA ATATCAACTA 60
CTATGTACTT GCATTATGTG AATAACTTTA AAGTTACAAC TAATGCATTT AATTTCGCCA 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ATAATTCCTA TGCTTTTCCT TATCATCACA CTTATATATA TGTAATCAAT GAGTCTTTTG 60
ATTATGTAAG TACACTTGTT GTCTTAGTAA TTATTATTCT AATAAATTTG TAGTTGTTTA 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
GTTTTCTATT TTTATACTAC GAATTATCAA GAGCTTTTTA TGATTTAAGA CCACATAAGT 60
CTTTTTTAGT CTTTTTGTTC ACTGGATCTA TTGATAATTA TATTTACTTA TTGACATAAA 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
TTGTTCTATT AACTTCTAGA TTGTTAAATC ACTTTGTTCT TATTAATTTA GTTACATTCT 60
TATGTTTAGT TTTGTCTAAA ATATAAAAAT ATCTTATTAA TGTTGCGGTA TCCCAGCAAT 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ATTGTTGACT GTCATTTATT TTTTATGCTC TGGACTTCAC TTTACATTTA TTAGTATCTA 60
AATCATATGT GTAAATTTAA ATATTTATTT ATCTATTCAG ATAGCCATAG ATTTTAATCG 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
CTTAATATCC AGCCAGACGG AAATGAGACC TTACTTTATA ATTTTTAGAT TCTAATGTGT 60
TTTATAATTT TCGATATTGG TTTTATTCTA CATATATTTC TATTAACTAT ATTATGTTTT 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
AGTTTCTAAT AGATCGTGTT GGATTCATAT AATTATTAAT ATATTCAATT TTGATTTTTG 60
ATTCAATATT TTATCTTAAT TGCTCCTCAG TTTGCTTTTC AACACTTTGA AAATTATGCA 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
AATCTCACTT TATTATACCT TTGGTTTCAT ATACTTACTA GATTAGTAAC TGCCAAGTAA 60
AGGTTTTATA ATAAATCATT TTTGTTTTTA CTTGAAGGTT ATTTTTTTAG AACTTCTTTA 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
CGCGGCGCTG GGGGCGGAGC CGGAGAGGTG CAGGGCCCGG CAGGAGGCAC GGGGCGGGGC 60
CGGAGCGCCG GGGGCGGGGC GGGAGGTGCG GCGGCCGACG ACGCTCAGGC CCGGCCCCGC 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
AATTCACTCC AAGCTTCAAA GTCACCCACC TGCTCTCCCC AGCAGCCCAA CGCCCACCCG 60
TGGGGCTGGC AGTGCCATCT GGCAAGGGCC ATTTCCAGTT CCAGAGAGGG CTGGGTTGGG 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
TGCTGACCCC AGACCCTGGC GACGGATCGG AGCTCCTCGG ATTTGGAGTG GATCCTTACA 60
AATCCTGCAC ACTAGACAGC AGACACAGGC CCTGCCAGAG CCAGGGACCC GAATTTTTGT 120
<210> 49
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
TTCCTCTTCC CCCGGGGGTA CTCCAGCAGG CACACAAACA CGCCCGCCAC ACTGAAGCCA 60
TGTGGTTAAG GAACAGCCCA GCTCAGCCTG AGGGGCCACA GGGAACTCCC TTTACTGAAG 120
<210> 50
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
CCTGCTTCCT CCTAGGAATG TGAGGTTTGT CAGGAGATGA GGGGTGGGGC CTGATGTCGT 60
CTCCTCGCAG GGGACCTGAG GGACCACTCA GCCTTTCCGG GGCTACCAGG GAGGACACTG 120
<210> 51
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
CCTCAGTGTC AGGCAGCCCT GGTGTTCTGC CCGCACTTGG ATCAAGGAAG TCACCAGGAG 60
ACCTGGGCTG TCCCCAGCAG AGTATACAAA GCAACTCTCA GAGGGGATCT GACTGGTGCC 120
<210> 52
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
TTAGATCATC CTTATTCATC AATCAAAGTC TAGTAATTGA GGGCCCAGTA TACTACCTTC 60
CATGTGCATA GGCTTTCCCT GTTTCTAAAG AACTTTCATG CACACTGTCA TTGGCTCTT 120
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
GTCTGTTTCT GAGGGAGCCC AGCCTAAGAC AACCTCCAGT ACTTAGCACA GTGCCTGACA 60
TATGGTATTG ACTCAGTAGA TATTTGCTGA AAGAATAAAA TACTTTGCAA ATGAAATCCT 120
<210> 54
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
AAATTACTAT AACATTCTTA GTGTTCTGTA TATGTAAAGA AGAATTGCTT GAGCATAATA 60
AATTGTTCCG ATCTAGAAAA TTATAGGTTT TAGTCTCTCA TGTTTTCAAA GGGTTATTTT 120
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
AGCCTCCCGA GTGGCTGGAA TTACAGGTGC CTGCCACCAC GCCTGGCTAA TTTTTGTATT 60
TTTAGTAGAG ACGGGGTTTC ACCATGTTGG CCATGGCTGG TCTTGAACTC CTGACCTCAG 120
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
AACTGGGGCT AGCAGGGGTT GGAAATGACC TTGCAAGCTA AAAGAGCAAG GATTGCAGGA 60
CATACAGGAG AGATGAATGA GAGGAGAGGA GTCAGAGACT TGTCAAAACT GATAAGGTTT 120
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
GTCATCATTT TCATCCCAAA TGTGTGACTT TTTAAAGAGC CTCTGCTTTT CTTTCTAATC 60
TTGCTCAGTA GGCAGGGGCC CCTGTGAGAC AGCTGGTTGA GAATGCTTGG TATGTTTGGA 120
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
TCAACAGATA GGTTTGCTTA TTTTGGAGAT TATATTATAA TATAAACCAG CCAAACTGTT 60
AGGGTTGGGA GCAAAACCAG GGCTAGATAC TGCGTGATGA AACCTTGCCA GTGAAATGGC 120
<210> 59
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
CCGCAGCAGG CCCCGGCCTC AGTGAGGATC ACCAAGTGCC ACCAGGCCCC CACAACCCCG 60
CTCAGGAGGA GGAAGCAGGC TTCCCTGACC ATCTTTAAAG AAAAGGGGGC ACCATGATGG 120
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
AAAGAAAGTG AAGCTACAAC TAGGAAGGAA GAAGCCTCCC ATTGTGGCTG TTGACCTCCT 60
AGAATAAAAC CATCATCATT CTGCCATTGG AATAAGTGGT GGGCAGAGGC GCCAGGCTGC 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
AGGGGAAAAG GGGTCACCAA ACGCTGCTCC AAGTGACTGG TGAAACCTGA AGACGTCCCT 60
CAGACTCAGT CAGTGGGGTC AGTGGGGTTT CGCTGGAGGG AGACAAGTGG ATAGATTTGA 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
CACTGCACCC TCCCGCTCCT TCCTGGCACT GGGGAACGTT GGCACCCATC CAGGGGATTG 60
CCTGGGTCTC CCTTCTTTAA ACCGTGGGCT CCTCTTGCTC ACCACAGAAC TCTCAGTGCC 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
CACCGCAAAA AGTGCAGGGA CAGCCCCTGA GGCTGGACCA TCTGGGCTGA ACCATTGCAA 60
ACCTCGGTCC TGCAACACCA AATCCAAAGT GAGCCCAAAT CCCCAGGGGA AACTCTCGGA 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
CAGGCACTAT CCTAGGCATT TTGTGCACAA AAACCCTCTA CAGAGATTTT ATCCCAACCG 60
TACAGATGGG AAAAATGAGC TCAGAGGGGT TAAGTGACTT GCTTAATGCC ACACAGTTAC 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ATTTTATCCC AACCGTACAG ATGGGAAAAA TGAGCTCAGA GGGGTTAAGT GACTTGCTTA 60
ATGCCACACA GTTACTAAGA GATGGTACAG GGATTCAAAG CCTGATCCGT TGGCCCCAAA 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
TAAGACAATC CAATGTCAAC TCATTCACAA TCAATTAAAG AAAATAGACA AAAAACATTA 60
ACAATGAGCT GTAAACCACG AAGATAAGCA CGTACTTTCA ATTAGAAAAA TGTGTTTTCA 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
CTTTTATTTC GATTTTTTGT ATTATTCCTA ATCTGCTAAA TATTTAAAAT ATTAGATTTA 60
GTTGACCTTT TTCTTAGTAA GGATCTTCAA TATATTACTA TAGGACTGTT TAGTACTCAA 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
TTAATATTAT TTTACTTTTA TAGAGTATAT AGAAGTTCCT ATTTGCAGGC TTAATATTGA 60
TCCATTGATA ATCTTAAATT TTGTTTCTAC CCTTACGAAT TATATAGTGT TTTCTATCTA 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
AGCAGAACAT ACTTTTTCTT TTTTAAAAGT AAGCCGGTCA GCATTTTTTT TGATATTTAT 60
TTCAATTTCA ATTAAACAGT TTTTAATTGT AACTCAGTAG TATCTTATTT ATTATTCTGT 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ATGCTAATTT ATCATTATGT ATACTAGTTG TTTATTAGTT AGAATTTATA TTAGTCTAAA 60
ATTCTGTAGT TACTCTATAT TTATTCTATA GCCATGATCT CCAATTTCAT TATAGTCTGT 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
TTATGATCGG AAATTACTTT TGTGTTTAAG ATTACTTTGT AACGATTTTA TTATCGATTA 60
TAACGTAATT CTATTACTTC TTTTAAACTC ATTAATATTT ATCGAAGTCC ATCTGTTATT 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
ATCTTACTAT TATTAGAAGA CTCTGATACT GACGTTTCTG TATTATTATT TAATATCTTT 60
AATCAGATTA ATGCTATATG TTGTTCTTCT CGTTATATCA ACTGTTTTAA AGTTATTAAT 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
TAAATAAAGT AGTAGAGACT GCCTCATTTA TAACGTCACG TACCTCTATT TATTGTTATT 60
ACTATCTATT ACTTTCTTAT TGATATATAT TATTATAATA TTTTTCTTTT GATTGTGTGA 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
GTTCTTTCTG ACTCTAAAGA ATAGTTTCTT ATTTGTTATC TGAAAGACAT ACTTTGTATA 60
TTTATTGTTT TAATCTCATT AAGAATATAT TTTTTGTCTA GGTTCTAAAT CCAATTTACA 120

Claims (5)

1.一种一次同时检测9个NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池，其特征在于：其由核酸序列如SEQ ID NO.1~74所示的探针组成。
2.权利要求1所述的探针池，其特征在于：所述NTRK-1-2-3融合基因为LMNA-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、TFG-NTRK1，AFAP1-NTRK2、NACC2-NTRK2、PAN3-NTRK2、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。
3.一种用于一次同时检测9个NTRK-1-2-3融合基因变异的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的探针池。
4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒适用于FFPE或新鲜组织的分子检测。
5.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒基于NGS方法针对泛癌NTRK-1-2-3融合基因进行检测。
CN201911167386.4A 2019-11-25 2019-11-25 一种基于ngs方法检测ntrk-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒 Active CN110791552B (zh)

Priority Applications (1)

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CN201911167386.4A CN110791552B (zh) 2019-11-25 2019-11-25 一种基于ngs方法检测ntrk-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒

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