CN111705135A - 一种检测mgmt启动子区甲基化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测MGMT启动子区甲基化的方法，包括以下步骤：a)提供基因组DNA样品；b)在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；c)使用内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；d)使用外侧引物对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；e)得到MGMT启动子区甲基化检测文库；及f)对步骤e)所得文库进行二代测序，以检测MGMT启动子区甲基化情况。该方法的优点在于检测片段短，检测成本低，结果稳定性高。

Description

一种检测MGMT启动子区甲基化的方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体地，本发明涉及一种检测MGMT启动子区甲基化的方法。
背景技术
脑胶质瘤（Glioblastoma，GBM）是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发病率约占颅内肿瘤的44%，是导致死亡的重要肿瘤类型之一。替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）化疗目前是GBM的一线标准治疗方案。有研究表明，MGMT基因启动子甲基化状态是预测TMZ对患者是否敏感的重要检测指标。另外，MGMT基因启动子甲基化的病人的生存时间明显长于非甲基化患者，提示MGMT基因启动子甲基化引起的MGMT基因沉默是胶质母细胞瘤化疗效果好的因素之一。
目前，针对MGMT基因启动子甲基化的检测方法主要是基于焦磷酸测序技术（pyrosequencing，PSQ）。PSQ是一种新型的酶级联测序技术，能够快速的检测甲基化频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，PSQ检测技术是由4种酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的统一反应体系中的酶级联化学发光反应。
实际应用中，基于PSQ检测MGMT基因启动子甲基化的方法表现出很多缺点，例如：位点检测结果不稳定，对于不同含量的肿瘤样品检测结果的准确性不唯一；检测起始量高，临床中无法提供足够的样品量进行检测；PCR过程中样品稳定性差，样品扩增效率低；影响因素多，实验周期长。
因此，急需一种可稳定、准确且低成本地检测MGMT启动子区甲基化的方法，以利于脑胶质瘤的风险预估与用药指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种可稳定、准确且低成本地检测MGMT启动子区甲基化的方法，更具体地本发明的方法基于二代测序技术实现。
在本发明的第一方面，提供了一种用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对，包括上游引物和下游引物，其中：
所述上游引物选自下组：
MGMT-F1:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTCGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQID NO.: 1）、
MGMT-F2:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTTGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQID NO.: 2）;和/或
所述下游引物选自下组：
MGMT-R1:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCGAAACTACCAC-3’（SEQID NO.: 3）、
MGMT-R1:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCAAAACTACCAC-3’（SEQID NO.: 4）。
本发明的第二方面，提供了一种用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物，包括P5引物和P7引物，其中：所述P5引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（SEQ ID NO.:7）；和所述P7引物序列为 ：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACGATTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG（SEQ ID NO.: 8）。
在本发明的第三方面，提供了一种用于扩增pUC19c的引物对，包括: pUC19c-F:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTGTTTAATGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.:5）, 和pUC19c-R: 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGCAACGAATCAATAAACG-3’（SEQ IDNO.:6）。
在本发明的第四方面，提供了一种MGMT启动子区甲基化检测文库的构建方法，包括以下步骤：
a)提供基因组DNA样品；
b)在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；
c)使用内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；
d)使用外侧引物，对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；及
e)得到MGMT启动子区甲基化检测文库。
在本发明的第五方面，提供了一种检测MGMT启动子区甲基化的方法，包括以下步骤：
a) 提供基因组DNA样品 ；
b) 在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；
c) 使用内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；
d) 使用外侧引物对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；
e) 得到MGMT启动子区甲基化检测文库；及
f) 对步骤e)所得文库进行二代测序，以检测MGMT启动子区甲基化情况。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的所述样品来自病理组织，优选脑胶质瘤组织。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤c)之前还包括对扩增产物进行纯化的步骤，优选地，所述对扩增产物进行纯化通过柱内脱硫实现。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤a)的样品中的基因组DNA含量为1ng-100μg，优选为35ng-10μg，更优选地为50ng-1μg ；所述基因组DNA浓度为1ng/μl-100ug/μl，优选为10ng/μl -10ug/μl，更优选地为20ng/μl -1μg/μl。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤b)中所述的对照为pUC19c。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤b)中的DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合；优选亚硫酸氢盐。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤c)中所述的内侧引物对为第一方面所述的内侧引物对。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤c)中所述的扩增所述对照的引物对为第三方面所述的引物对。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤d)中所述的外侧引物为第二方面所述的外侧引物。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤c)中的第一轮PCR扩增进行10-50个循环，优选为23-27个循环，更有选为25个循环。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤d)中的第二轮PCR扩增进行5-30个循环，优选为15个循环。
在一个具体实施方式中，第四方面和第五方面所述方法的步骤c)和d)中所述的纯化通过磁珠法实现。
在一个具体实施方式中，所述磁珠法包括使用磁珠和醇溶液进行洗脱，优选地使用0.8X磁珠和65%-95%酒精进行洗脱；更优选地使用0.8X磁珠和80%酒精进行洗脱。
在本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，其包括用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对、用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物、对照以及用于扩增所述对照的引物对、DNA甲基化修饰转化试剂以及任选地脱硫纯化试剂。
在一个具体实施方式中，所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对为第一方面所述的内侧引物对和/或所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物为第二方面所述外侧引物和/或所述对照为pUC19c和/或所述用于扩增所述对照的引物对为第三方面所述的引物对。
在一个具体实施方式中，所述DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合；优选亚硫酸氢盐。
在本发明的第六方面，提供了所述的试剂盒在通过二代测序检测MGMT启动子区甲基化中的用途。
在本发明的第七方面，提供了所述的试剂盒在制备用于脑胶质瘤的风险预估与用药指导的产品中的用途。
附图说明
图1显示了本发明检测MGMT启动子区甲基化的方法的完整流程。
图2显示了作为对照的pUC19c_DNA的序列信息。
图3显示了两组临床样本的阳性率测试结果。
图4显示了两组临床样本的阴性率测试结果。
图5显示了使用本方案或焦磷酸测序方法检测同一份脑胶质瘤组织样品的甲基化水平的测序结果。
图6显示了检验样品008同一批次两次重复测序的结果。
图7显示了检验样品229同一批次两次重复测序的结果。
图8显示了三个不同批次中检验样品006的测序结果。
图9显示了三个不同批次中检验样品008的测序结果。
具体实施方式
参考以下本申请的优选实施方案的详述以及包括的实施例可更容易地理解本公开内容。
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
为了实现稳定、准确且低成本地检测MGMT启动子区甲基化，本发明人通过大量实验发现基于二代基因测序技术检测MGMT启动子区甲基化的方法，结果重复性和均一性高、稳定性好。进一步，发明人设计了一种针对MGMT启动子第71-81位点，尤其是76-79位点甲基化检测的优化技术方案，完成了本发明。
引物
本发明提供了一种用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对，包括上游引物和下游引物，其中：所述上游引物选自下组：MGMT-F1:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTCGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQ ID NO.: 1）、MGMT-F2:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTTGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQ ID NO.: 2）;和/或所述下游引物选自下组：MGMT-R1:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCGAAACTACCAC-3’（SEQ IDNO.: 3）、MGMT-R1:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCAAAACTACCAC-3’（SEQ ID NO.: 4）。
上述引物由两部分构成，一部分是与基因组中MGMT启动子的核酸序列特异性对应的序列以及一段位于接头序列。对于MGMT启动子的上游引物，具体地MGMT-F1和MGMT-F2，其5’端的第1-34位为相同的接头序列：“TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGG”；对于MGMT启动子的下游引物，具体地MGMT-R1和MGMT-R2，其5’端的第1-34位为相同的接头序列：“GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG”。
MGMT基因编码一种DNA 修复蛋白——O'-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase），MGMT基因位于10号染色体10q26.3，共6个外显子。其NCBI参考序列ID为NG_052673.1。本文中所述的MGMT基因启动子位于十号染色体上，具体位置为chr10:131264928-131265769。
PCR建库还需要一对外侧引物：P5引物和P7引物。P5引物与待建库序列的一端相对应，并延伸出一段接头；P7引物与待建库序列的另一端相对应，P7引物内或邻近位置含有用于区别的标签INDEX序列。本发明还提供了一种用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物，包括P5引物和P7引物，其中：所述P5引物序列为 ：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（SEQ ID NO.: 7）；和所述P7引物序列为 ：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACGATTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-3’（SEQ ID NO.: 8）。
本发明使用的对照是pUC19c质粒。本发明还提供了一种用于扩增pUC19c的引物对，包括: pUC19c-F: 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTGTTTAATGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.:5）, 和pUC19c-R: 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGCAACGAATCAATAAACG-3’（SEQ ID NO.:6）。
建库方法
本发明提供了一种MGMT启动子区甲基化检测文库的构建方法，包括以下步骤：
a)提供基因组DNA样品；
b)在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；
c)使用内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；
d)使用外侧引物，对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；及
e)得到MGMT启动子区甲基化检测文库。
在一个具体实施方式中，其中所述样品来自病理组织，优选脑胶质瘤组织。
在一个具体实施方式中，在步骤c)之前，还包括对转化后的样品进行纯化的步骤。
在一个具体实施方式中，所述对转化后的样品进行纯化通过柱内脱硫实现。
在一个具体实施方式中，步骤a)的样品中的基因组DNA含量为1ng-100μg，优选为25ng-10μg，更优选地为50ng-1μg；所述基因组DNA浓度为1ng/μl-100ug/μl，优选为10ng/μl-10ug/μl，更优选地为20ng/μl-1μg/μl。
在一个具体实施方式中，步骤b)中所述的对照为pUC19c。
在一个具体实施方式中，步骤b)中的DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合；优选亚硫酸氢盐。
在一个具体实施方式中，步骤c)中所述的内侧引物对为第一方面所述的内侧引物对。
在一个具体实施方式中，步骤c)中所述的扩增所述对照的引物对为第三方面所述的引物对。
在一个具体实施方式中，步骤d)中所述的外侧引物为第二方面所述的外侧引物。
在一个具体实施方式中，步骤c)中的第一轮PCR扩增进行10-50个循环，优选为23-27个循环，最优选为25个循环。
在一个具体实施方式中，步骤d)中的第二轮PCR扩增进行5-30个循环，优选为15个循环。
在一个具体实施方式中，步骤c)和d)中所述的纯化通过磁珠法实现。
在一个具体实施方式中，所述磁珠法包括使用磁珠和醇溶液进行洗脱，优选地使用0.8X磁珠和65%-95%酒精进行洗脱；更优选地使用0.8X磁珠和80%酒精进行洗脱。
检测甲基化的方法
本发明还提供了一种检测MGMT启动子区甲基化的方法，包括以下步骤：
a) 提供基因组DNA样品；
b) 在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；
c) 使用内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；
d) 使用外侧引物对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；
e) 得到MGMT启动子区甲基化检测文库；及
f) 对步骤e)所得文库进行二代测序，以检测MGMT启动子区甲基化情况。
在一个具体实施方式中，其中所述样品来自病理组织，优选脑胶质瘤组织。
在一个具体实施方式中，在步骤c)之前，还包括对转化后的样品进行纯化的步骤。
在一个具体实施方式中，所述对转化后的样品进行纯化通过柱内脱硫实现。
在一个具体实施方式中，步骤a)的样品中的基因组DNA含量为1ng-100μg，优选为25ng-10μg，更优选地为50ng-1μg；所述基因组DNA浓度为1ng/μl-100ug/μl，优选为10ng/μl-10ug/μl，更优选地为20ng/μl-1μg/μl。
在一个具体实施方式中，步骤b)中所述的对照为pUC19c。
在一个具体实施方式中，步骤b)中的DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合；优选亚硫酸氢盐。
在一个具体实施方式中，步骤c)中所述的内侧引物对为第一方面所述的内侧引物对。
在一个具体实施方式中，步骤c)中所述的扩增所述对照的引物对为第三方面所述的引物对。
在一个具体实施方式中，步骤d)中所述的外侧引物为第二方面所述的外侧引物。
在一个具体实施方式中，步骤c)中的第一轮PCR扩增进行10-50个循环，优选为23-27个循环，最优选为25个循环。
在一个具体实施方式中，步骤d)中的第二轮PCR扩增进行5-30个循环，优选为15个循环。
在一个具体实施方式中，步骤c)和d)中所述的纯化通过磁珠法实现。
在一个具体实施方式中，所述磁珠法包括使用磁珠和醇溶液进行洗脱，优选地使用0.8X磁珠和65%-95%酒精进行洗脱；更优选地使用0.8X磁珠和80%酒精进行洗脱。
二代测序
二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。在二代测序中，单个DNA分子扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列。
文库构建
文库构建即为测序片段添加接头。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。二代测序文库构建的流程包括：末端修饰、添加接头、磁珠纯化、PCR扩增、第二次磁珠纯化。
典型的建库方法如下：
1.建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。2.添加接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列。3.使用特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。4. 添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增，片段需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。5. PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。
在本发明中，为了提高建库和测序的效率，本发明创造性地在使用甲基化修饰转化试剂步骤前加入对照核酸分子。对照核酸分子的目的是作为阴性标准品，已排除实际操作中假阳性的存在。
试剂盒
本发明提供了一种试剂盒，其包括用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对、用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物、对照以及用于扩增所述对照的引物对、DNA甲基化修饰转化试剂以及任选地脱硫纯化试剂。
在一个具体实施方式中，所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对为第一方面所述的内侧引物对和/或所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物为第二方面所述外侧引物和/或所述对照为pUC19c和/或所述用于扩增所述对照的引物对为第三方面所述的引物对。
在一个具体实施方式中，所述DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合；优选亚硫酸氢盐。
本发明还提供了所述的试剂盒在通过二代测序检测MGMT启动子区甲基化中的用途。
脑胶质瘤的风险预估与用药指导
本发明还提供了所述的试剂盒在制备用于脑胶质瘤的风险预估与用药指导的产品中的用途。
MGMT蛋白是一种高效的DNA甲基转移酶,此酶可以将DNA分子上的甲基转移到自身氨基酸残基上,以修复各种烷化剂药物造成的细胞DNA烷基化损伤,特别是DNA分子中鸟嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化损伤,从而有效的修复DNA损伤,防止细胞癌变和死亡。MGMT启动子甲基化将导致MGMT基因的沉默，从而减少 MGMT mRNA 和蛋白的表达，因此，患者的MGMT基因启动子区甲基化程度越高，使用烷基化药物的效果可能越好。烷基类化合物——替莫唑胺(temozolomid, TMZ)是一种新型咪唑四嗪类药物,对人类肿瘤细胞系具有广谱抗肿瘤活性。目前，美国和欧洲医学界已经将替莫唑胺定为治疗恶性脑瘤的“金标准”，国际医学界也已将替莫唑胺作为治疗恶性脑瘤的一线药物。在脑胶质瘤患者的治疗过程中，MGMT蛋白过量表达会对化疗药物替莫唑胺产生耐药性，而MGMT基因启动子高甲基化,导致该基因转录水平下降（基因沉默），进而导致细胞内MGMT蛋白表达降低。因此，MGMT甲基化修饰作为预测替莫唑胺敏感性的分子标记物被广泛使用。
焦磷酸测序技术是检测甲基化位点的“金标准”，目前通常使用PSQ检测MGMT启动子区甲基化情况。但是PSQ检测明显的缺陷包括：同样检测的位点检测结果不稳定，对于不同含量的肿瘤样品检测结果的准确性不唯一，检测起始量高，无法确保有足够的量进行检测；PCR过程中样品稳定性差，样品扩增效率低，影响因素多，实验周期长。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1.本方法检测的是MGMT基因启动子76-79位点的短片段，数据量小，相比焦磷酸测序方法（PSQ）从送检样品到结果出具时间长达1周时间，本发明的实验周期为3天，检测时间显著缩短，价格低；
2. 本方法样品需求量小，检测结果稳定性高，影响因素少，准确性高。
实施例
下面结合说明书附图，进一步对本申请的优选实施例进行详细描述，以下的描述为示例性的，并非对本申请的限制，任何的其他类似情形也都落入本申请的保护范围之中。
实施例1
步骤一、提供DNA样品
样品来自于患者的脑胶质瘤组织，以提取其中的基因组DNA(gDNA)。
具体操作步骤如下：
1. 准备工作：打开金属浴，一台温度设为56℃；Buffer AW1 & Buffer AW2：第一次使用前加入相应体积的无水乙醇。Buffer ATL和Buffer AL：室温放置，每次使用时先检查是否有沉淀，如有则用56 ℃ 金属浴加热至沉淀溶解，然后平衡至室温摇匀后使用。
2. 样品脱蜡：
可以选择白片组织处理方式和卷片组织处理方式，来进行完全脱蜡处理或者非过夜处理：
2.1白片组织处理方式进行完全脱蜡处理：向1.5ml离心管中加入1 ml Histo-ClearII，在生物安全柜中用干净的手术刀将样品全数刮入到此1.5 ml的离心管中。刀片丢入利器盒内，离心管放至56℃恒温混匀仪上孵育片刻融化石蜡；
2.2卷片组织处理方式进行完全脱蜡处理：将带有样品编号1.5ml管子的卷片组织放入离心机中，瞬离至所有组织于管底，向离心管中加入1 ml Histo-Clear II，涡旋剧烈震荡至管底组织完全悬浮后，放置56℃恒温混匀仪至石蜡完全融化。将56℃金属浴上的样品管涡旋剧烈震荡，至管中石蜡完全融化，14,800 rpm离心2 min；弃掉全部上清，注意不要吸到样品（废液单独收集处理）；再向管中加1 ml Histo-Clear II，涡旋剧烈震荡3–5 min后，14,800 rpm离心2 min；如果脱蜡不完全可以重复步骤5）；加1 ml ethanol ( 96～100% )，涡旋混匀，然后14,800 rpm离心2 min；弃掉全部上清，注意不要吸到样品（废液单独收集处理）；重复上述加ethanol步骤再清洗一次；沉淀14,800 rpm离心2 min，用移液器吸弃上清，注意不要碰到沉淀；开盖状态下，在室温静置晾干或者56℃金属浴烘干；加180 μl BufferATL，低速涡旋使沉淀重悬；加20 μl Proteinase K，低速涡旋混匀；在56℃金属浴过夜孵育；再次加20 μl Proteinase K，低速涡旋混匀，56 ℃金属浴中孵育1 h；然后在90℃金属浴孵育1 h；
2.3白片处理方式进行非过夜处理:向1.5ml离心管中加入500 ul Histo-Clear II，在生物安全柜中用干净的手术刀将样品全数刮入到此1.5 ml的离心管中。刀片丢入利器盒内，离心管放至56℃恒温混匀仪上孵育片刻融化石蜡；
2.4卷片处理方式进行非过夜处理:将带有样品编号1.5ml管子的卷片组织放入离心机中，瞬离至所有组织于管底，向离心管中加入500 ul Histo-Clear II，涡旋剧烈震荡至管底组织完全悬浮后，放置56度恒温混匀仪至石蜡完全融化；加入180 μl Buffer ATL重悬沉淀，加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，短暂离心；56℃金属浴孵育2h； 然后在90℃金属浴孵育1 h；立即用200 ul的移液枪吸取下层液体转移至新的1.5 ml离心管；样品降至室温后，加2 μl RNase A (100 mg/ml)，低速涡旋混匀，室温孵育2 min。
实验发现，使用上述4种方法处理患者的脑胶质瘤组织样品，都可以得到可用于本方法的建库样品。提示本方案不受样品处理方式的限制，除了本实施例中提到的4种方法，其他常用的样品处理方法也可以有选择性地用于本方案。
3.从上述获得的样品中提取gDNA。具体方法如下：
（1）加入预先混合的200 μl Buffer AL和200 μl 酒精 ( 96～100% )，涡旋混匀，以尽量避免沉淀（涡旋混匀后仍有大块沉淀的，可以再多加一倍以上试剂）；
（2）短暂离心，将管盖上的残留液滴收集到离心管中；将溶液转移到相应编号的QIAampMinElute Column中，8000 rpm离心1 min（如果有液体残留，则提高转速至13000rpm，直至液体全部离心下来。如果有固形物妨碍液体过柱，使用新的tip将固形物去除后再离心）；
（3）将QIAamp MinElute Column转移到新的2 ml收集管；加500 μl Buffer AW1，然后8,000 rpm离心1 min，更换2 ml收集管；加500 μl Buffer AW2，然后8,000 rpm离心1 min，更换2 ml收集管；将QIAamp MinElute Column转移到新的2 ml收集管，最大转速离心3min；将QIAamp MinElute Column转移到相应编号的1.5 ml 离心管，开盖晾干或用10 μl移液器吸掉内圈边缘残留试剂；
（4）使用100 μl的移液枪，加70 μl Buffer ATE至QIAamp MinElute column滤膜中央，室温孵育5 min，8000 rpm离心1 min；
（5）将步骤（4）中获得的70μl洗脱液吸取并重新加入至对应QIAamp MinElute column滤膜中央，室温孵育5 min，8,000 rpm离心1 min；
（6）获得的gDNA直接进入下一步质检程序。暂时不质检的，暂存于4℃冰箱；
（7）质检：仔细确认样品编号后，取1 μl gDNA溶液使用Qubit定量，以测定纯化产物中的DNA浓度，并检测基因组DNA的提取结果。
步骤二、构建MGMT启动子区甲基化检测文库
1.通过步骤一得到了临床患者脑胶质瘤组织来源的gDNA样品，并提供对照核酸——pUC19c质粒，分别作为实验样品和阴性对照。
2. 设计用于扩增MGMT启动子区甲基化位点和对照核酸pUC19c的引物对，其中，所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点和对照核酸pUC19c的引物对的序列为：
Figure 800503DEST_PATH_IMAGE001
3. 使用亚硫酸氢盐转化实验样品和阴性对照的DNA样品。具体操作步骤如下：
取1µL puc19C原液加99µL H2O稀释至100X，从100X稀释液中取20µL加80µL H2O稀释至2000X于BS处理时备用。然后取一管CT Conversion Reagent，加入900 μL H2O，300 μL的M-Dilution Buffer和50μL 的M-Dissolving Buffer，将配置好的CT Conversion Reagent固定在Votex上室温涡旋10min；取样品到相应编号的0.2mL离心管内，并加入1µL 上述配置好的2000X puc19c，最后加入H2O补充到20µL总体积，加入130 µL 上述配制好的CTConversion Reagent，反应体系共150µL；涡旋混匀并离心。配制得到如下的转化反应体系：
Figure 779960DEST_PATH_IMAGE002
转化反应条件为：
Figure 576009DEST_PATH_IMAGE003
4.对转化产物进行脱硫操作，具体步骤如下：
(1)将Zymo-spin IC Column放入 Collection Tube中，向其中加入600µL 的M-Binding Buffer；
(2)将样品全部转入含有M-Binding Buffer 的Zymo-spin IC Column中，关盖后Votex振荡混匀；
(3)全速（>10,000g）离心30s，弃Collection Tube中的废液；
(4)加入100µL 的M-Wash Buffer 到column中，全速离心30s，弃废液;
(5)加入200µL M-DesµLphonation Buffer 到column中，并室温(20-30℃ )放置15-20分钟后，全速离心30s，弃Collection Tube中的废液；
(6)加入200µL M-Wash Buffer 到column中，全速离心30s，弃Collection Tube中的废液；
(7)重复1.1.6一次，共清洗2次；
(8)洗脱结束后，将管子全速离心空转1min，确保去除柱子内的所有液体；
(9)将column放入新的1.5 mL离心管中，加入20µL M-Elution Buffer到column中的膜上，全速离心30s，使洗脱下来的溶液收集在新的1.5mL离心管中，得到脱硫后的转化产物。
5. 检测文库的构建。
转化和脱硫处理后，使用两轮扩增法加接头。具体操作步骤如下：
5.1第一轮扩增反应，配制体系如下所示：
Figure 299114DEST_PATH_IMAGE004
其中，所述第一轮扩增的扩增条件为：
Figure 425071DEST_PATH_IMAGE005
5.2第二轮扩增反应，配制体系如下所示：
Figure 513113DEST_PATH_IMAGE006
其中，所述用于P5引物、P7引物的序列为：
Figure 842463DEST_PATH_IMAGE007
其中，所述第二轮扩增的扩增条件为：
Figure 119992DEST_PATH_IMAGE008
得到扩增产物，即为建库样品。
步骤三甲基化水平检测
步骤二中得到的建库样品进行质检、稀释至150~350 pM，然后通过Illumina测序平台对上述实施例构建的文库进行高通量测序，以500M数据量上机测序，下机后分析76-79位点的甲基化程度，及其甲基化的平均水平。然后通过生物学手段分析数据，以定量检出MGMT启动子区的甲基化程度数据。
结果：本发明采用pUC19c_DNA质粒为对照来计算亚硫酸氢盐转化的效率，未经亚硫酸氢盐转化的pUC19c_DNA的序列如图2所示，其中字体加粗+浅灰色标记为pUC19c引物的链接位点，其间甲基化的胞嘧啶（深灰色标记）有13个，非甲基化的胞嘧啶（浅灰色标记）有25个。根据作为对照的pUC19c的甲基化测序结果，确定本方案的甲基化正确率。35次独立甲基化测序实验结果，如下表所示，本方案的非甲基化位点平均正确率和甲基化位点平均正确率均高达99.4%和98.47%。
Figure 851187DEST_PATH_IMAGE009
Figure 359398DEST_PATH_IMAGE010
对临床样本的甲基化测序结果如图3，独立进行两组临床样本甲基化测序CpG76-79位点的阳性率分别为60%、59%，对应的阴性率分别为0.25%、0.75%。这有力地证明本发明的方法检测准确率很高。
实施例2
为了进一步证明本方案的准确性，使用编号为004的脑胶质瘤组织样品分别使用本实验方法和焦磷酸测序法检测和评估样本的甲基化。
结果测序结果图如图4所示，统计结果如下表所示。可见本方案检测目的基因特定位点甲基化的结果与基于焦磷酸测序（PSQ）的结果较为一致。而两次焦磷酸测试结果却差异较明显。
Figure 176044DEST_PATH_IMAGE011
实施例3
为了证明本方案的稳定性，分别安排了使用编号为008、229的脑胶质瘤组织样品按照实施例1中的步骤进行甲基化测序，每个样本重复测序2次。然后，对编号为008、006的样品进行三次独立重复实验，比较批次间的重复性。
结果如图5所示，对于所使用的两种样品，测序结果都表现出很好的批内重复性。而对所述样品进行多批次重复实验，结果如图6所示，也出现使用本方案的三批次的结果均显示出高度一致性。
序列表
<110> 至本医疗科技（上海）有限公司
<120> 一种检测MGMT启动子区甲基化的方法
<130> EID200164
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtttcgg atatgttggg atag 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggttttgg atatgttggg atag 54
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaaacc actcgaaact accac 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaaacc actcaaaact accac 55
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggggtgtt taatgagtga gt 52
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcgcaac gaatcaataa acg 53
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agattaacga ttgtctcgtg ggctcggaga tgtg 54

Claims (23)

1.一种用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对，包括上游引物和下游引物，其中：
所述上游引物选自下组：
MGMT-F1:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTCGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQID NO.: 1）、
MGMT-F2:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTTGGATATGTTGGGATAG-3’（SEQID NO.: 2）；和
所述下游引物选自下组：
MGMT-R1:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCGAAACTACCAC-3’（SEQID NO.: 3）、
MGMT-R2:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAAACCACTCAAAACTACCAC-3’（SEQID NO.: 4）。
2.一种用于扩增pUC19c的引物对，包括: pUC19c-F: 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTGTTTAATGAGTGAGT-3’（SEQ ID NO.:5）, 和
pUC19c-R: 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGCAACGAATCAATAAACG-3’（SEQID NO.:6）。
3.一种MGMT启动子区甲基化检测文库的构建方法，包括以下步骤：
提供基因组DNA样品；
在所述DNA样品中添加对照，然后使用DNA甲基化修饰转化试剂转化所述添加有对照的DNA样品；
使用权利要求1所述的内侧引物对和扩增所述对照的引物对，对转化后的DNA进行第一轮PCR扩增，并对第一轮扩增产物进行纯化；
使用外侧引物，对步骤c）所得纯化产物进行第二轮PCR扩增，并对第二轮扩增产物进行纯化；及
得到MGMT启动子区甲基化检测文库。
4.权利要求3所述的方法，其中所述样品来自病理组织。
5.权利要求4所述的方法，其中所述样品来自脑胶质瘤组织。
6.权利要求3所述的方法，在步骤c)之前，还包括对转化后的样品进行纯化的步骤。
7.权利要求6所述的方法，其中所述对转化后的样品进行纯化通过柱内脱硫实现。
8.权利要求3所述的方法，其中步骤a)的样品中的基因组DNA含量为1ng-100μg；所述基因组DNA浓度为1ng/μl-100ug/μl。
9.权利要求3所述的方法，其中步骤b)中所述的对照为pUC19c。
10.权利要求3所述的方法，其中步骤b)中的DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合。
11.权利要求3所述的方法，其中步骤c)中所述的扩增所述对照的引物对为权利要求2所述的引物对。
12.权利要求3所述的方法，其中步骤d)中所述的外侧引物包括P5引物和P7引物，其中所述P5引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（SEQ ID NO.:7）；和
所述P7引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACGATTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-3’（SEQ ID NO.: 8）。
13.权利要求3所述的方法，其中步骤c)中的第一轮PCR扩增进行10-50个循环。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤c)中的第一轮PCR扩增进行23-27个循环。
15.权利要求14所述的方法，其中步骤c)中的第一轮PCR扩增进行25个循环。
16.权利要求3所述的方法，其中步骤d)中的第二轮PCR扩增进行5-30个循环。
17.权利要求16所述的方法，其中步骤d)中的第二轮PCR扩增进行15个循环。
18.权利要求3所述的方法，其中步骤c)和d)中所述的纯化通过磁珠法实现。
19.权利要求18所述的方法，其中所述磁珠法包括使用磁珠和醇溶液进行洗脱。
20.一种试剂盒，其包括权利要求1所述的用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的内侧引物对、用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物、对照以及用于扩增所述对照的引物对、DNA甲基化修饰转化试剂以及任选地脱硫纯化试剂。
21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于扩增MGMT启动子区甲基化位点的外侧引物包括P5引物和P7引物，其中所述P5引物序列为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’（SEQ ID NO.:7）；和
所述P7引物序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAACGATTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-3’（SEQ ID NO.: 8）；
和/或所述对照为pUC19c；
和/或所述用于扩增所述对照的引物对为权利要求2所述的引物对。
22.权利要求20所述的试剂盒，其中所述DNA甲基化修饰转化试剂选自：亚硫酸氢盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐及其组合。
23.权利要求20-22中任一项所述的试剂盒在制备用于脑胶质瘤的风险预估与用药指导的产品中的用途。
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