CN115198035A - 基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和rna修饰的检测方法和应用 - Google Patents

基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和rna修饰的检测方法和应用 Download PDF

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CN115198035A CN202210932147.9A CN202210932147A CN115198035A CN 115198035 A CN115198035 A CN 115198035A CN 202210932147 A CN202210932147 A CN 202210932147A CN 115198035 A CN115198035 A CN 115198035A
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Abstract

本发明公开一种基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法及应用。包括：获得生物样品的总RNA；使总RNA经过分离纯化得到mRNA；将mRNA与逆转录接头连接；使逆转录接头与纳米孔测序接头连接；通过链特异性测序，使带有病毒整合的mRNA的文库单链通过位于芯片的纳米孔，而不测序互补cDNA链，同时检测出病毒整合转录本和RNA上的修饰信息。本发明的方法具有长片段测序的优势，同时能够获取碱基修饰信息，实现了简单、准确的单分子水平检测。此外，本发明的方法能够避免反转录和PCR中的偏好性，以及逆转录和扩增过程中对RNA修饰信息的丢失，保留RNA天然属性，获得多种碱基变异，结构变异与修饰信息，从而能够区分高度相似的异构体、识别新转录本。

Description

基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测 方法和应用
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体地涉及一种基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法和应用。
背景技术
宫颈癌是妇科中最常见的恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康。人类乳头瘤病毒(HPV)的DNA整合入宿主基因组，被认为是宫颈癌发生发展中的关键事件。HPV的整合水平与生殖道上皮恶性肿瘤和癌前病变密切相关。从感染HPV到发展成为宫颈癌约需数年或更长时间，通过检查HPV感染与否和HPV基因组整合状态，指导临床治疗，对于宫颈癌防治具有重要意义。
目前已有HPV检测方法存在一定的缺陷，具体如下：
1.细胞学检查(巴氏涂片、薄层液基细胞)，该方法不够敏感，假阴性高，不易推广，不能明确HPV基因组整合状态。
2.分子检测(DNA)：有杂交捕获检测(HC-Ⅱ)、实时荧光定量PCR技术(Cobas4800)、基因芯片法等，缺陷在于不能测定具体的HPV型别或特异性差，不能明确HPV基因组整合状态等。
3.基于二代NGS测序的基因组插入片段的检测，因为读长短，整合断点位于重复序列可能导致基因融合分析的难度大、漏检和误判等。DNA水平的检测无法判断病毒插入的基因是否仍具有转录活性，也无法获取病毒插入基因的表达与修饰的信息。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，发明人进行了深入研究，提出一种基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法，其包括以下步骤：
(1)获得来源于生物样品的总RNA；
(2)使所述总RNA经过分离纯化得到mRNA；
(3)将所述mRNA与逆转录接头连接；
(4)使步骤(3)中的逆转录接头与纳米孔测序接头连接；和
(5)使所述mRNA或其部分通过位于芯片的纳米孔，其中，所述芯片设置于电极附近，且所述电极能够检测通过所述纳米孔的电流。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，在连接逆转录接头后进行逆转录和逆转录产物纯化，其中，使用逆转录试剂合成第一链cDNA。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，进一步包括：通过分析，以确定病毒整合状态和RNA修饰信息，其中所述病毒为人类乳头瘤病毒。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述逆转录接头序列如SEQ IDNo.:1-2所示。在某些实施方案中，所述逆转录接头为适用于ONT平台逆转录RTA接头。优选地，所述逆转录接头序列包括：
Oligo A：5'-/5PHOS/GGCTTCTCTTTGCTTAGGTAGTAGGTTC(SEQ ID No.1)；
Oligo A’：5'-GAGGCGAGCGGTCAATTCCTAAGAGCAAGAAGCC(TTTTTTTTTT)(SEQ IDNo.2)。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述纳米孔测序接头序列如SEQ ID No.:3-4所示。在某些实施方案中，所述纳米孔测序接头为适用于ONT平台RNA直接测序RMX接头。优选地，述纳米孔测序接头包括：Oligo B：5'-TGATGATGAGGGATAGACGATGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTTTTTTTTTTATGATGCAAGATACGCAC-3'(SEQ ID No.3)；
Oligo B’：5'-GAGGCGAGCGGTCAATTTGCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCATCGTCTATCCCTCATCATCAGAACCTACTA-3'(SEQ ID No.4)。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，用于接头连接的反应程序为：20-25℃反应5-30分钟。
本发明的第二方面，提供一种用于检测病毒感染的系统，其包括：
数据获取单元，其设置为能够获取来自生物样本的RNA中的至少碱基修饰数据；
数据处理单元，其设置为能够分析所述碱基修饰数据以预测病毒基因插入位点，并基于预测结果判断病毒感染或其状态；和
数据输出单元，其设置为输出病毒感染状态的结果。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测病毒感染的系统，其中，所述生物样本为受试者收集的组织或体液，或体外培养的细胞。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测病毒感染的系统，其中，进一步包括纳米孔测序仪，所述数据获取单元通过调取所述纳米孔测序仪的测序结果获取来自生物样本的RNA中的至少碱基修饰数据。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测病毒感染的系统，其中，所述数据处理单元能够进一步调取所述碱基修饰附近的序列信息，并将其与参考基因组比较，并基于比较结果来判断或确认病毒基因插入位点；
其中，当序列中存在碱基修饰时，将含所述碱基修饰的1-1000bp范围内，优选1-500bp范围内，还优选1-100bp范围内的指定序列与参考基因组比较，如果指定序列与参考基因组对应序列基本一致，则判定所述生物样本中没有病毒感染或没有病毒整合，如果与参考基因组对应序列相比，指定序列中存在多余序列或多余的多个连续碱基，则判定所述生物样本中的病毒为整合状态。
本发明的方法基于纳米孔测序具有长片段测序的优势，其读长可以达到mb级别，可以对DNA或RNA进行单分子读长的端到端测序，同时获取碱基修饰信息等优势，实现了简单、准确的单分子水平检测。实时测序和分析的特点也大大缩短了实验及数据分析时间。此外，采用纳米孔RNA直接测序的方法能够避免反转录和PCR中的偏好性，保留RNA天然属性，获得多种碱基修饰信息；能够区分高度相似的异构体、识别新转录本。
通过本发明的方法发现病毒整合位点附近存在碱基修饰差异，基于碱基修饰可辅助预测和发现病毒在基因组中的整合位点。
附图说明
图1为本发明示例性的检测的方法流程图。
图2为示例性的示出了本发明检测过程，其中可选地进行反转录。
图3为HPV插入位点示例示意图。
图4-5为纳米孔测序原始电信号的比较分析结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明提供基于纳米孔测序技术同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法，其包括以下步骤：
(1)获得来源于生物样品的总RNA；
(2)使所述总RNA经过分离纯化得到mRNA；
(3)将所述mRNA与逆转录接头连接；
(4)使步骤(3)中的逆转录接头与纳米孔测序接头连接；和
(5)使所述mRNA或其部分通过位于芯片的纳米孔，其中，所述芯片设置于电极附近，且所述电极能够检测通过所述纳米孔的电流。
下面详细说明各步骤。
获得来源于生物样品的总RNA
本发明的步骤(1)中，总RNA可以通过已知方法进行提取，此类方式在本领域是已知的。提取方法可参考已知的教科书，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。本发明的总RNA不必进行打断，因此，其片段一般控制在1K以上，例如1K-3K，优选1.5K-3K，还优选2K-3K。其长度如果过小，则测序得到的结果可靠性变差，甚至不能进行检测。另一方面，如果该长度过长，虽然通过测序仍可进行检测，但成本变高且对于检测结果的准确性提高并无影响。因此，本发明的总RNA长度一般控制在1K-3K。当然长度大于3K时对于本发明目的而言也可行的。
本发明中，生物样品不限定，一般而言，其实例包括但不限于组织样品或流体样品。组织样品包括体细胞样品，例如癌组织等病变组织或正常的组织。流体样品包括血液或其成分例如血浆、血清等。生物样品可以是任何哺乳动物来源的样品，也可以是来源于人的样品。
在某些实施方案中，提取的RNA的OD260/280值为1.7<OD260/280<2.2，RQN值≥8.0，浓度≥250ng/ul，总量≥13ug。
mRNA分离纯化
本发明的步骤(2)为使所述总RNA经过分离纯化得到mRNA。纯化的方式不特别限定，但优选使用mRNA捕获磁珠进行，优选地，纯化后的mRNA总量为50-500ng。
逆转录接头的连接
本发明的步骤(3)中，将纯化后的mRNA与逆转录接头连接，其中逆转录接头具有5’段的一段polyT序列，T碱基的个数不特别限定，可以为5-15个，例如6、7、8、9、10个这样的碱基，从而与来自mRNA的polyA尾互补配对。这里的“互补”可以是指两条核酸序列通过氢键发生序列特异性的结合，它们的嘌呤和/或嘧啶碱基依据沃森-克里克法则形成双链核酸复合体，也可以是核酸序列及修饰的核酸序列与另一段序列依据沃森-克里克法则形成核酸双链。
本发明因此还提供一种用于mRNA与逆转录接头的连接体系，其包含连接缓冲液、RT Adapter、T4 DNA连接酶。优选地，所述逆转录接头具有SEQ ID No:1所示的序列。用于上述连接的反应程序为：20-25℃反应5-30分钟，还优选21-23℃反应8-15分钟。
本发明中，逆转录并不是本发明的方法所必须的，为了避免反转录和PCR扩增中的偏好性，保留整合RNA分子的突变和修饰属性，同时获得整合RNA转录本的变异和多种碱基修饰信息，优选不进行反转录过程。在某些实施方案中，进行反转录也仅反转录一链cDNA，以连接测序接头，以保证进行纳米孔测序的链为RNA原始链，而非cDNA链，从而在后续数据分析时能够分析HPV插入位点相关特异碱基突变或由其引起的碱基修饰差异化信息和细胞癌变状态之间的联系。
因此，本发明另一方面提供一种反转录体系，其包含无核酸酶水、10mMdNTPs、5xfirst-strand buffer、0.1DTT和反转录酶。用于上述反转录的反应程序为：45-60℃反应30-60分钟，65-75℃反应8-15分钟，4℃保温。可以理解的是，在反转录结束后，进一步包括对产物的纯化步骤。
纳米孔测序接头连接
本发明的步骤(4)为纳米孔测序接头连接步骤，优选地，所述纳米孔测序接头具有SEQ ID No:2所示的序列。本发明进一步提供一种测序接头连接体系，其包含连接反应缓冲液、RNA adaptor、无核酸酶水和T4 DNA酶。用于上述连接的反应程序为：20-25℃反应5-30分钟，还优选为21-23℃反应8-15分钟。可以理解的是，在纳米孔测序接头连接结束后，进一步包括对文库的纯化步骤。优选地，使用RNA Clean Beads进行文库的纯化。
测序步骤
本发明的步骤(5)为使所述mRNA或其部分通过位于芯片的纳米孔，其中，所述芯片设置于电极附近，且所述电极能够检测通过所述纳米孔的电流在具体实施方案中，当目标序列或其部分穿过纳米尺度的通道时，A、T、G、C不同的碱基化学性质的差异会导致纳米孔的电化学参数的变化量相应变化，对这些变化进行检测可以转换得到原始RNA的核酸序列，此类用于纳米孔测序平台可举例例如Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION测序平台。
实施例
本实施例用于示例性说明本发明方法，图1为检测流程图。
一、样本信息
选用培养的HPV感染细胞系，收集并重悬于RNASaferTM Reagent(R4811-03)中，4℃短期保存。
二、实验步骤
1.总RNA提取
离心富集细胞后使用MagPureFFPE RNA LQ Kit(R6625-02)，参照“石蜡包埋组织RNA手工操作”步骤进行总RNA提取(未进行脱蜡步骤)。提取后的总RNA使用Nanodrop 2000和
Figure BDA0003782025060000082
RNA HS Assay Kit及Qubit3.0Fluorometer进行定量，Qubit浓度为288ng/ul，OD260/280＝2.019。使用Qsep1(Bioptic)进行质检，RQN值为8.58。RNA质量要求：1.7<OD260/280<2.2，RQN值≥8.0，浓度≥250ng/ul，总量≥13ug。
2.mRNA分离纯化
取提取的总RNA 12.5ug使用VAHTS mRNA Capture Beads(N401-01)进行mRNA分离纯化。得到的mRNA使用
Figure BDA0003782025060000083
RNA HS Assay Kit和Qubit 3.0 Fluorometer进行定量，Qubit浓度为21.8ng/ul，总量305ng。使用Agilent 2100 Bioanalyzer质检。
3.测序文库构建
文库构建采用Direct RNA Sequencing Kit(SQK-RNA002，Oxford NanoporeTechnologies)试剂盒及实验流程。
3.1连接RT Adapter
在1个无核酸酶的0.2ml PCR管中配制反应体系，具体见下表1：
试剂 体积
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3.0ul
mRNA 9.5ul
RT Adapter(RTA) 1.0ul
T4 DNA Ligase 1.5ul
总体积 15ul
吹吸混匀并简单离心，22℃(PCR仪设置，热盖off)反应10分钟。
3.2反转录
该步骤只做反转录一链cDNA为连接测序接头，纳米孔测序实际链为RNA原始链而非cDNA链，见图4。准备反转录混合液，具体见下表2：
Figure BDA0003782025060000081
Figure BDA0003782025060000091
将反转录混合液加入到3.1步骤产物0.2mlPCR管中，吹吸混匀并简单离心，再加入2ulSuperScript III Reverse Transcriptase，吹吸混匀并简单离心，然后运行反应程序，见下表3。
Figure BDA0003782025060000092
3.3反转录产物纯化：
3.3.1将上步骤反转录反应产物全部吸取转移至新无核酸酶的1.5ml离心管中。
3.3.2加入72ul(1.8倍体积)RNA Clean Beads(提前平衡至室温)，吹吸混匀并简单离心。
3.3.3室温静置5分钟。
3.3.4将离心管放置于磁力架上，待磁珠聚集，上清澄清后吸弃上清。
3.3.5准备新鲜70％乙醇200ul，取150ul加入到弃上清的离心管中，保持离心管在磁力架上，180°旋转离心管，等待磁珠重新吸附磁力架并聚集。再次180°旋转离心管，等待磁珠重新吸附磁力架并聚集(归于原位)。
3.3.6吸弃70％乙醇，取下离心管离心后放回磁力架上，吸尽残液。
3.3.7晾干磁珠，加入21ul无核酸酶水重悬磁珠。
3.3.8室温静置5分钟。
3.3.9将离心管放置于磁力架上，待磁珠聚集，上清澄清后吸取转移20ul至新无核酸酶的0.2ml PCR管中。
3.4连接测序接头
在含3.3.9步骤纯化产物的PCR管中加入试剂配制反应体系，具体见下表：
Figure BDA0003782025060000093
Figure BDA0003782025060000101
吹吸混匀并简单离心，22℃(PCR仪设置，热盖off)反应10分钟。
3.5文库纯化
3.5.1将上步骤反转录反应产物全部吸取转移至新无核酸酶的1.5ml离心管中。
3.5.2加入40ul(1.0倍体积)RNA Clean Beads(提前平衡至室温)，吹吸混匀并简单离心。
3.5.3室温静置5分钟。
3.5.4将离心管放置于磁力架上，待磁珠聚集，上清澄清后吸弃上清。
3.5.5吸取150ul Wash Buffer加入到弃上清的离心管中。取下离心管，轻弹重悬磁珠，简单离心后放于磁力架上，等待磁珠重新吸附磁力架并聚集。上清澄清后吸弃上清。
3.3.6重复上一步骤一次。
3.5.7取下离心管离心后放回磁力架上，吸尽残液。
3.5.8晾干磁珠，加入18ul Elution Buffer重悬磁珠。
3.5.9室温静置5分钟。
3.5.10将离心管放置于磁力架上，待磁珠聚集，上清澄清后吸取转移17ul至新无核酸酶的1.5mlPCR管中。
3.3.11吸取1ul文库，使用
Figure BDA0003782025060000102
dsDNA HS Assay Kit及Qubit3.0Fluorometer进行定量，文库Qubit浓度2.24ng/ul。
4.上机测序
4.1上机试剂、芯片准备
室温化冻RNA Runing Buffer(RRB)、FB和FLT，混匀后置冰上备用。室温平衡Flongle Flow Cell(FLO-FLG001)。
4.2准备Flow cell Priming Mix：在1.5ml离心管中加117ul FB，3ul FLT，总120ul，吹吸混匀。
4.3准备上机文库：在1.5ml离心管中加RRB 15ul，文库用量20ng，使用无核酸酶水补足总体积30ul，吹吸混匀。
4.3MinION测序仪准备：MinION测序仪连接电脑，打开MinKNOW软件。
4.4Flow Cell Check：将准备好的Flongle Flow Cell通过适配器安装在MinION测序仪上，在MinKNOW软件运行Flow Cell Check程序，检测合格，即有效活性孔数≧50，可用于测序。
4.5文库上机测序：撕开Flongle Flow Cell封膜，将120ul Flow cell PrimingMix加入样本端口，接着加入30ul文库，将封膜贴回密封。在MinKNOW软件上按提示输入实验信息并设置运行参数：Experiment Name、Sample ID、Flow Cell Id、Run Length(24h)、Basecall Model(Fast)、数据存储位置等。最后核对设置后开始运行测序。
三、数据分析
1.数据质控，见下表。
Reads Generated 48.98K
Passed Bases 31.69Mb
Failed Bases 8.44Mb
Estimated Bases 45.07Mb
Read Filtering min_qscore＝7
Run Length 1d 0h 5m
Estimated N50 1.07K
2.数据分析
2.1 HPV分析信息
检测结果仅展示具有HPV整合的转录本为例，经过与病毒基因组数据库和人类基因组(hg19)数据库的序列比对分析，HPV分型为HPV18高危型，利用纳米孔长片段测序的序列片段(大于1kb)，可以准确的鉴定出病毒与人来源序列的整合断点位置，整合转录本的断点见下表，HPV插入位点示例示意图见图5。
Figure BDA0003782025060000111
Figure BDA0003782025060000121
2.2 RNA直读碱基修饰分析
通过比较分析纳米孔测序原始电信号可发现，发生融合的序列片段与其对应基因的未发生融合的序列片段在不含插入序列的相同序列部分的电信号峰值发生了显著变化(见图4)，特别是在病毒插入断点附近的区域，约1-100bp区域局部放大有更为明显的多处碱基修饰差异(见图5)。这些变化是碱基特殊修饰，例如包括但不仅限于甲基化，乙酰化修饰等引起的。分析发现，有病毒整合的RNA转录本与无病毒整合的转录本在对应区域的碱基修饰也有明显差异，因此修饰的改变可与病毒插入结构变异共同作为疾病检测的标志物。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (10)

1.一种基于纳米孔测序同时获取病毒整合转录本和RNA修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得来源于生物样品的总RNA；
(2)使所述总RNA经过分离纯化得到mRNA；
(3)将所述mRNA与逆转录接头连接；
(4)使步骤(3)中的逆转录接头与纳米孔测序接头连接；和
(5)使所述mRNA或其部分通过位于芯片的纳米孔，其中，所述芯片设置于电极附近，且所述电极能够检测通过所述纳米孔的电流。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在连接逆转录接头后进行逆转录和逆转录产物纯化，其中，使用逆转录试剂合成第一链cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：通过分析，以确定病毒整合状态和RNA修饰信息，其中所述病毒为人类乳头瘤病毒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录接头序列包括SEQ ID No.:1-2所示的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米孔测序接头序列包括SEQ IDNo.:3-4所示的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于接头连接的反应程序为：20-25℃反应5-30分钟。
7.一种用于检测病毒感染的系统，其特征在于，包括：
数据获取单元，其设置为能够获取来自生物样本的RNA中的至少碱基修饰数据；
数据处理单元，其设置为能够分析所述碱基修饰数据以预测病毒基因插入候选位点，并基于预测结果判断病毒感染或其状态；和
数据输出单元，其设置为输出病毒感染状态的结果。
8.根据权利要求7所述的用于检测病毒感染的系统，其特征在于，所述生物样本为受试者收集的组织或体液，或体外培养的细胞。
9.根据权利要求7所述的用于检测病毒感染的系统，其特征在于，进一步包括纳米孔测序仪，所述数据获取单元通过调取所述纳米孔测序仪的测序结果获取来自生物样本的RNA中的至少碱基修饰数据。
10.根据权利要求7所述的用于检测病毒感染的系统，其特征在于，所述数据处理单元能够进一步调取所述碱基修饰附近的序列信息，并将其与参考基因组比较，并基于比较结果来判断或确认病毒基因插入位点；
其中，当序列中存在碱基修饰时，将含所述碱基修饰的1-1000bp范围内的指定序列与参考基因组比较，如果指定序列与参考基因组对应序列基本一致，则判定所述生物样本中没有病毒感染或没有病毒整合，如果与参考基因组对应序列相比，指定序列中存在多余序列或多余的多个连续碱基，则判定所述生物样本中的病毒为整合状态。
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