CN114574587A - 一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用，属于生物检测技术领域。该标记物组合物是通过与结直肠癌诊断相关的三种蛋白标记物与血浆游离DNA甲基化生物标记物组合,能够使用离体血液样本区分良性肠道息肉与恶性结直肠癌肿瘤。鉴于离体血液样本的无创性以及便利性，适于大规模推广应用。检测血液中结直肠癌相关的特异的甲基化位点，并结合蛋白肿瘤标志物检测结果，极大提高了结直肠癌检测的灵敏度和特异性，从而实现结直肠癌的早筛早诊。通过直接对比良性息肉和结直肠癌患者的离体血液样本筛找出的cfDNA甲基化标记物能够在检测结直肠癌的同时区分息肉的良恶性，能够很大程度上避免结直肠癌筛查过程中的过度诊疗问题。

Description

一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用。
背景技术
根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据。如何有效地降低结直肠癌疾病负担数据是亟待解决的重大公共卫生问题。
结直肠癌大都经由腺瘤发展而来，由腺瘤-不典型增生-癌的演变，过程大概要经过10-15年，这一时间窗为结直肠癌的预防和早期诊断提供了有利的时机，也使得结直肠癌成为为数不多的可以通过筛查降低发病率和病死率的恶性肿瘤。大量的研究和实践已经表明结直肠癌筛查和早诊早治可以有效降低结直肠癌的死亡率。
结直肠癌筛查的方法有结肠镜、乙状结肠镜、免疫法粪便隐血试验(FIT)、结肠CT成像技术、粪便DNA检测等。在当前的研究和临床实践中，结肠镜是结直肠癌筛查普遍应用的金标准，循证医学证据级别高。但由于检查具有侵入性且需要充分的肠道准备，在人群组织性筛查中，我国人群结肠镜筛查的参与率低，如何进一步提升结肠镜筛查参与率是未来需要解决的关键问题。
FIT检测由于成本低且属于非侵入性筛查手段，在结直肠癌筛查项目中，单轮次FIT筛查参与率较高。但整体灵敏度较低，且对其他造成消化道出血的常见良性疾病容易产生误判。
结肠CT成像技术由于需要严格的肠道准备、检查设备和专业技术人员有限、放射线辐射风险等原因，在人群筛查中仍有一定的局限性。
粪便DNA技术在我国人群结直肠癌筛查中的筛查效果仍有待进一步通过大样本人群研究证实。
更进一步地，由于当前的结直肠癌的筛查方法无法在干预前准确地判断肠道息肉的良恶性，为避免风险往往选择切除所发现的息肉。然而近期研究表明，肠镜筛查中所切除的息肉只有很小一部分为结直肠癌肿瘤，大部分的息肉只有很小的风险能够进展为恶性肿瘤。据另一项国际研究表明，60岁左右人群中约有32％的人能够筛查出息肉，而更高的年龄人群组则可达50％以上的息肉患病率。但实际上，人的一生中患有结直肠癌的风险仅有不到5％。由此可见，对于良性息肉的过度诊断与治疗会导致很大比例人群的过度焦虑、经济损失以及潜在的治疗副作用，尤其对于身体羸弱的老年人群。因此，结直肠癌的筛查工作亟需一种能够平衡结直肠癌早筛早诊的需求和避免筛查过程中的过度诊疗的检测方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种用于结直肠癌检测的标记物组合物及其应用。
本发明所采用的技术方案为：一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化生物标记物，所述DNA甲基化生物标记物包括chr13:46756082-46756083、 chr16:29757360-29757361、chr16:29757375-29757376、 chr1:211780424-211780425、chr16:29757350-29757351、chr12:123707827-123707828、chr12:123707825-123707826、 chr1:211780438-211780439、chr20:55968287-55968288、 chr13:46756209-46756210、chr7:11208563-11208564、chr10:11207969-11207970、 chr13:46756193-46756194、chr10:11207977-11207978、 chr5:115152492-115152493、chr5:115152479-115152480、 chr13:78493280-78493281、chr10:11207913-11207914、chr19:58095644-58095645、 chr6:393188-393189、chr16:86544859-86544860、chr2:176932783-176932784、 chr5:115152504-115152505、chr20:45142061-45142062、chr8:54789919-54789920、chr10:11206756-11206757、chr13:78493561-78493562、chr7:98245999-98246000、 chr3:105717036-105717037、chr3:196065318-196065319、 chr3:105717020-105717021、chr17:81014094-81014095、 chr17:81014091-81014092、chr4:4661893-4661894、chr3:196065306-196065307、 chr12:111725541-111725542、chr13:27769458-27769459、 chr20:30804542-30804543、chr12:26832094-26832095、 chr12:111725432-111725433、chr5:123964982-123964983、chr4:4662007-4662008、 chr7:1626779-1626780、chr7:1626809-1626810、chr7:1626788-1626789、 chr17:57915717-57915718、chr7:1626792-1626793、chr17:43319085-43319086、 chr17:43319071-43319072、chr17:43319109-43319110、chr17:43319137-43319138、 chr17:57915800-57915801、chr17:43319124-43319125、chr17:57915773-57915774、 chr17:57915740-57915741、chr2:12246595-12246596和chr2:12246569-12246570 中的一种或多种。
一种用于检测结直肠癌的标记物组合物，所述标记物组合物为所述的57种 DNA甲基化生物标记物和3种蛋白标记物的组合；
所述3种蛋白标记物包括C-反应蛋白、癌胚抗原和癌抗原19-9中的一种或多种。
一种标记物组合物在制备检测结直肠癌的试剂盒中的应用。
一种用于检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求2所述的标记物组合物；以及标记物组合物的探针。
作为优选地，所述探针为杂交捕获含有所述标记物组合物的DNA序列片段。
作为优选地，所述结直肠癌为早期结直肠癌。
作为优选地，所述试剂盒的检测流程包含以下步骤：
步骤1，测定样本的蛋白标记物CRP、CEA、CA19-9浓度水平；
步骤2，提取离体血液样本中的cfDNA，NEB EM-seq试剂盒酶转化处理，甲基化DNA建库；
步骤3，使用标记物组合物的探针进行靶向杂交捕获文库,文库定量后进行二代测序；
步骤4，数据下机，测序数据预处理以及对上述蛋白标记物、甲基化生物标记物进行数据分析。
作为优选地，所述步骤2中，酶转化处理为将未发生甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶。
上述试剂盒使用下述平台：PCR扩增法、数字PCR、荧光定量PCR、甲基化芯片法、甲基化特异PCR法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐测序、一代测序、二代测序、三代测序或者它们的组合所使用的试剂。
肠道疾病是不同病理分类，不同大小的息肉；结直肠癌是不同分期，优选为早期(I-II期)结直肠癌。
本发明的有益效果为：
(一)本发明提供的该用于结直肠癌检测的标记物组合物，是通过对与结直肠癌诊断相关的三种蛋白标记物，并且结合在不同时期结直肠癌患者以及患有良性肠道息肉的人群中的显著差异的DNA甲基化生物标记物，获知蛋白标记物与血浆cfDNA甲基化生物标记物的组合能够用于区分良性肠道息肉与恶性结直肠癌肿瘤。
(二)本发明公开了三个与结直肠癌诊断相关的蛋白标记物，同时公开了57个区分息肉良恶性的血浆cfDNA甲基化生物标记物。鉴于离体血液样本的无创性以及便利性，适于大规模推广应用。
(三)由于DNA甲基化与肿瘤的发生、发展有着重要联系，是肿瘤发生过程中的早期事件。人体循环系统中来源于肿瘤的片段DNA携带着癌症特异性遗传和表观遗传特征，可以作为癌症患者的诊断、预后和监测标志物。采用液体活检技术，检测血液中结直肠癌相关的特异的甲基化位点，并结合蛋白肿瘤标志物检测结果，极大的提高了结直肠癌检测的灵敏度和特异性，从而实现结直肠癌的早筛早诊。更进一步地，通过直接对比良性息肉和结直肠癌患者的离体血液样本筛找出的血浆游离DNA甲基化标记物能够在检测结直肠癌的同时区分息肉的良恶性，能够很大程度上避免结直肠癌筛查过程中的过度诊疗问题。
附图说明
图1是实施例1中公开的蛋白标记物和筛选57个检测结直肠癌的cfDNA甲基化标记物的研发流程图；
图2是实施例3中三种蛋白标记物检测结直肠癌的AUC结果示意图；
图3是实施例3中三种蛋白标记物联合检测结直肠癌的AUC结果示意图；
图4是实施例3中57种DNA甲基化生物标记物区分良性肠道息肉和结直肠癌的AUC结果示意图；
图5是实施例3中三蛋白标记物联合57种DNA甲基化生物标记物区分良性肠道息肉和结直肠癌的AUC结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
本发明实施例提供一种用于结直肠癌检测的标记物组合物，该标记物组合物是用于区分肠道息肉良恶性并检测结直肠癌的血浆游离DNA甲基化标记物57 种的至少一种及应用。具体包含以下结直肠癌患者与肠道息肉患病人群血浆中具有显著差异甲基化的基因片段：chr13:46756082-46756083、 chr16:29757360-29757361、chr16:29757375-29757376、 chr1:211780424-211780425、chr16:29757350-29757351、 chr12:123707827-123707828、chr12:123707825-123707826、 chr1:211780438-211780439、chr20:55968287-55968288、 chr13:46756209-46756210、chr7:11208563-11208564、chr10:11207969-11207970、 chr13:46756193-46756194、chr10:11207977-11207978、 chr5:115152492-115152493、chr5:115152479-115152480、 chr13:78493280-78493281、chr10:11207913-11207914、chr19:58095644-58095645、 chr6:393188-393189、chr16:86544859-86544860、chr2:176932783-176932784、 chr5:115152504-115152505、chr20:45142061-45142062、chr8:54789919-54789920、 chr10:11206756-11206757、chr13:78493561-78493562、chr7:98245999-98246000、 chr3:105717036-105717037、chr3:196065318-196065319、 chr3:105717020-105717021、chr17:81014094-81014095、 chr17:81014091-81014092、chr4:4661893-4661894、chr3:196065306-196065307、 chr12:111725541-111725542、chr13:27769458-27769459、 chr20:30804542-30804543、chr12:26832094-26832095、 chr12:111725432-111725433、chr5:123964982-123964983、chr4:4662007-4662008、 chr7:1626779-1626780、chr7:1626809-1626810、chr7:1626788-1626789、 chr17:57915717-57915718、chr7:1626792-1626793、chr17:43319085-43319086、 chr17:43319071-43319072、chr17:43319109-43319110、chr17:43319137-43319138、 chr17:57915800-57915801、chr17:43319124-43319125、chr17:57915773-57915774、 chr17:57915740-57915741、chr2:12246595-12246596、chr2:12246569-12246570。
为了解决血浆cfDNA含量较低以及重亚硫酸盐会对DNA的损伤问题，本发明采用NEBNext Enzymatic Methyl-seq kit进行胞嘧啶到尿嘧啶的转化。
如图1所示，结直肠癌血浆样本cfDNA甲基化标记物的筛选以及检测包含以下步骤：
步骤1，根据TCGA公共数据库挖掘结直肠癌发生相关的cfDNA甲基化标记物；
步骤2，结直肠癌相关的甲基化标记物的捕获探针的设计以及合成；
步骤3，血浆cfDNA的提取，酶转化以及甲基化cfDNA建库；
步骤4，结直肠癌特异性panel靶向捕获甲基化cfDNA文库；
步骤5，文库定量后进行二代测序；
步骤6，测序数据进行质量控制以及预处理后，计算目标位点的甲基化水平；
步骤7，分析筛选出在结直肠癌的组织与患者的血浆中具有一致性甲基化差异的并且与蛋白标记物具有互补效果的cfDNA甲基化标记物，用于构建区分良性肠道息肉和结直肠癌的算法模型并验证。
实施例2：用于结直肠癌检测的血液蛋白标记物浓度与cfDNA甲基化标记物的检测方法：
一、蛋白标记检测具体实验步骤如下：
1、样本处理：在静脉采血后24小时内分离血清，溶血、脂血样本不得用于检测，需重新采样。
2.检测前准备：先打开仪器(MQ60 PLUS全自动化学发光免疫分析仪)电源开光，开始初始化，仪器开机30min后方可进行检测。将分离处理的血清样本取出，如果样本冷冻，需解冻，室温平衡30min，同时试剂盒及标准品取出后室温平衡30min。
3.定标：向校准品1和校准品2中各加500μL校准品稀释液进行复溶，复溶后可轻轻振荡，使干粉完全溶解后静置。在仪器操作界面选择定标品，然后选择“两步法”，后依据所选择蛋白标志物进行定标。拿出提前平衡好的试剂条，加入100μL复溶好的标准品进行检测，标准品1和2设置复孔检测。定标完成后查看标准曲线，显示定标成功，可检测样本。
4.样本检测：每次使用新批号试剂的时候，需录入试剂批号，如果已经有该批次，则不需要再次录入，准备好对应数量的试剂条和样本，将试剂条装入卡槽，同时加入100μL样本到对应试剂条中，将样本及足够枪头放入仪器，点击开始，仪器开始检测。仪器检测结束后清理废液盒，清理台面，关闭仪器。
二、cfDNA甲基化标记物检测具体实验步骤如下：
1、血液cfDNA提取：血液cfDNA提取具体操作步骤按照“游离DNA提取试剂盒(抽滤法)操作说明书”结合真空抽滤泵进行：将血液用蛋白酶K和裂解液裂解，使用真空抽滤泵和DNA结合柱结合DNA，并用洗涤液和无水乙醇洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱。
2、使用磁珠对cfDNA进行片段筛选：
①往cfDNA中加入0.75倍于cfDNA产物的SPRIselect磁珠，涡旋混匀，室温孵育5分钟；置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液到新的1.5mL离心管中，备用；
②往上一步的上清液中加入1.05倍于cfDNA产物的SPRIselect磁珠，吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；
③用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清液，重复该步骤一次；晾干，用洗脱缓冲液洗脱。
3、质控品准备：每个样本中需加入10μL的0.1ng/μL CpG甲基化的pUC19 和10μL的2ng/μL非甲基化的λDNA；两种质控品需提前使用Covaris M220 超声波打断仪打断并片段筛选至200bp左右。
4、cfDNA的文库构建：使用NEBNext Enzymatic Methyl-Seq试剂盒进行建库。
4.1末端修复和3′端加“A”
4.1.1取50ng待测样本，用NF水稀释至50μL，然后加入以下试剂进行反应。
组分 体积(μL)
Control DNA工作液 20
末端修复反应液 5
末端修复酶混合液 5
4.1.2置于PCR仪中按以下程序进行反应
Figure BDA0003583469220000091
4.2接头连接
4.2.1往末端修复产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
EM-seq连接接头溶液 5
连接增强液 5
连接混合液 50
4.2.2置于PCR仪中，按下表条件设置PCR反应程序：
60℃，60min，热盖关闭。
4.2.3接头连接产物纯化
A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠。
B、按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例，配制80％乙醇，备用。
C、分别向连接产物中加入55μL纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清进行下一步反应。
4.3甲基化：氧化反应
4.3.1配制buffer：
a.往100ul E1反应缓冲液补充液中加入400ul E1反应缓冲液振荡混匀，标记配制日期。
b取10μL 500mM的Fe(Ⅱ)加入到1249μL的无核酸酶水中，稀释后的溶液立即使用，现配现用，不可保存。
c使用无核酸酶水按1:10的比例稀释终止缓冲液。
4.3.2往14μL纯化后的连接产物中加入以下试剂并混匀，然后再往已加入氧化酶的纯化后连接产物中加入10μL稀释后的Fe(Ⅱ)并混匀离心。
组分 体积(μL) 备注
配制好的TET2反应液 5 溶解后的E1补充液
氧化补充反应液 0.5 -
二硫苏糖醇 0.5 -
氧化增强液 10 -
E1 2 -
4.3.3置于PCR仪上，按照以下条件反应：37℃，1h，热盖温度≧45℃。
4.3.4反应完成后往产物中加入1μL稀释后的反应终止液，并置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，30min，热盖温度≧45℃。
4.3.5氧化反应产物纯化
A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
B、按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例，配制80％乙醇，备用；
C、分别向连接产物中加入45μL NEB Next Sample纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用9.5μL洗脱缓冲液洗脱，吸取8μL 上清进行下一步反应。
4.4甲基化：胞嘧啶脱氨基
4.4.1变性：
a PCR仪提前预热至85℃，热盖开启；
b向8μL纯化后的氧化反应产物中加入2μL甲酰胺，涡旋振荡混匀，瞬时离心。
4.4.2往变性后产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
无核酸酶水 34
E2反应液 5
牛血清蛋白 0.5
E2 0.5
4.4.3置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，3h，热盖温度≧45℃。
4.4.4胞嘧啶脱氨基反应产物纯化
a将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例，配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入50μL NEB Next Sample纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用11μL洗脱缓冲液洗脱，吸取10μL 上清进行下一步反应。
4.5 PCR扩增及纯化
4.5.1向以上纯化产物中加入以下试剂进行反应
组分 体积(μL)
引物 2.5
酶混合液 12.5
4.5.2置于PCR仪上，按以下条件反应
Figure BDA0003583469220000121
4.5.3 PCR扩增产物纯化
a将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入22.5μL NEB纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清，进行质检。
5、杂交洗脱
5.1杂交：
a每个待杂交文库取10ng，计算合并杂交所需的文库体积，并将12个文库混在一起；
b向文库混合液中加入以下试剂进行反应；
c打开真空浓缩仪，设置V-AQ模式，常温下浓缩成干粉；
d立即取20μL杂交混合液加入到浓缩完成的干粉中，混匀并室温静置5 分钟后，加入30μL杂交增强液混匀离心；
e置于PCR仪上，按以下条件进行反应。
表1试剂组分表
Figure BDA0003583469220000131
Figure BDA0003583469220000141
表2 PCR反应条件表
Figure BDA0003583469220000142
5.2捕获洗脱
5.2.1buffer预热：
将快速结合液、快速洗涤液2在48℃预热至沉淀溶解，快速洗涤液1在63 ℃预热至沉淀溶解，链霉亲和素磁珠室温平衡至少30min。
5.2.2磁珠捕获
a涡旋振荡混匀已平衡至室温的链霉亲和素磁珠；
b取70μL链霉亲和素磁珠加入到1.5mL离心管中；
c加入20μL结合缓冲液，吹打混匀，瞬时离心后置于磁力架上，静置1min，弃上清液；
d重复b和c步骤两次，共进行三次链霉亲和素磁珠清洗；
e加入20μL结合缓冲液重悬链霉亲和素磁珠；
f转移20μL重悬的链霉亲和素磁珠到杂交反应管中，然后全部液体转移到 1.5mL离心管中。
g室温条件下，在混匀仪上混匀30分钟，不可涡旋；
h混匀完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清。
5.2.3洗脱
a加入200μL 54℃预热的快速清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54℃孵育5min；
b孵育完成后，瞬时离心，转移所有液体至新的1.5mL离心管中，去除结合在离心管表面的非特异性捕获片段；
c置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；
d加入200μL 63℃预热的清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54 ℃孵育5分钟；
e孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min，弃上清；
f加入200μL 54℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀，置于恒温金属浴中54 ℃孵育5分钟；
g孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；
h重复a到g步骤两次，共进行三次清洗；
i瞬时离心，用10μL吸头弃掉残留的上清，立即加入45μL无核酸酶水，吹打混匀，冰上孵育。
5.3捕获产物PCR富集
5.3.1取22.5μL捕获产物(链霉亲和素磁珠悬浮液)加入以下试剂，进行反应。
Figure BDA0003583469220000151
Figure BDA0003583469220000161
置于PCR仪上，按以下条件进行反应
Figure BDA0003583469220000162
5.3.2 PCR产物纯化
a将DNA纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀；
b按照无水乙醇：无核酸酶水＝8:2比例配制80％乙醇，备用；
c分别向连接产物中加入90μL DNA纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80％乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用32μL洗脱缓冲液洗脱，吸取30μL上清进行质控，并上机测序。
6测序数据的分析：
下机的原始数据首先使用fastQC过滤低质量的序列(phred33 score<＝20)以及read中的接头序列和polyA/T序列。过滤后的高质量reads使用BSMAP回帖到hg19人类基因组，并筛选出回帖质量较高的reads。使用picard去除PCR重复后再通过samtools选择回帖到目标基因组区域(DNA甲基化标记物所对应的区域)的reads并计算各个DNA甲基化标记物的甲基化水平。
实施例3
本实施例首先基于TCGA公共数据库中45例结直肠癌癌旁组织样本，408 例结直肠癌组织样本挖掘出200个在结直肠癌样本中发生显著差异甲基化的 DNA甲基化标记物，并进行捕获探针的设计与合成。进一步地，该实施例使用 203例良性肠道息肉患者血浆样本，230例结直肠癌患者血浆样本提取cfDNA、建库并测序。最后，利用随机森林模型筛选出预测性能与蛋白标记物(CRP、 CEA、CA19-9)具有较好互补作用的57个cfDNA甲基化标记物用于区分肠道良性息肉和结直肠癌患者。整个分析流程如图1所示。
如图2所示，本实施例公开了用于检测结直肠癌的蛋白标记物组合，单独检测CRP预测结直肠癌的AUC值为0.692，单独检测CEA预测结直肠癌的AUC 值为0.683，单独检测CA19-9预测结直肠癌的AUC值为0.62。
如图3所示，结合三种蛋白共同预测结直肠癌的AUC值高达0.822。
进一步地，该实施例公开了用于区分肠道息肉良恶性并检测结直肠癌的57 个cfDNA甲基化标记物，每个位点的位置信息以及单独的检测性能见表3。
表3 57个cfDNA甲基化标记物区分息肉良恶性的具体性能
Figure BDA0003583469220000171
Figure BDA0003583469220000181
Figure BDA0003583469220000191
Figure BDA0003583469220000201
Figure BDA0003583469220000211
Figure BDA0003583469220000221
如图4所示，这57个cfDNA甲基化标记物的组合预测结直肠癌AUC为0.845。
如图5所示，结合蛋白标记物和cfDNA甲基化标记物的综合随机森林模型在区分良性肠道息肉患者和结直肠癌患者的AUC值高达0.880。
由此可见，结合蛋白标记物和甲基化标记物所构建出的模型比各自单独构建的模型更能准确地预测结直肠癌。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化生物标记物，其特征在于，所述DNA甲基化生物标记物包括chr13:46756082-46756083、chr16:29757360-29757361、chr16:29757375-29757376、chr1:211780424-211780425、chr16:29757350-29757351、chr12:123707827-123707828、chr12:123707825-123707826、chr1:211780438-211780439、chr20:55968287-55968288、chr13:46756209-46756210、chr7:11208563-11208564、chr10:11207969-11207970、chr13:46756193-46756194、chr10:11207977-11207978、chr5:115152492-115152493、chr5:115152479-115152480、chr13:78493280-78493281、chr10:11207913-11207914、chr19:58095644-58095645、chr6:393188-393189、chr16:86544859-86544860、chr2:176932783-176932784、chr5:115152504-115152505、chr20:45142061-45142062、chr8:54789919-54789920、chr10:11206756-11206757、chr13:78493561-78493562、chr7:98245999-98246000、chr3:105717036-105717037、chr3:196065318-196065319、chr3:105717020-105717021、chr17:81014094-81014095、chr17:81014091-81014092、chr4:4661893-4661894、chr3:196065306-196065307、chr12:111725541-111725542、chr13:27769458-27769459、chr20:30804542-30804543、chr12:26832094-26832095、chr12:111725432-111725433、chr5:123964982-123964983、chr4:4662007-4662008、chr7:1626779-1626780、chr7:1626809-1626810、chr7:1626788-1626789、chr17:57915717-57915718、chr7:1626792-1626793、chr17:43319085-43319086、chr17:43319071-43319072、chr17:43319109-43319110、chr17:43319137-43319138、chr17:57915800-57915801、chr17:43319124-43319125、chr17:57915773-57915774、chr17:57915740-57915741、chr2:12246595-12246596和chr2:12246569-12246570中的一种或多种。
2.一种用于检测结直肠癌的标记物组合物，其特征在于，所述标记物组合物为如权利要求1所述的57种DNA甲基化生物标记物和3种蛋白标记物的组合；
所述3种蛋白标记物包括C-反应蛋白、癌胚抗原和癌抗原19-9中的一种或多种。
3.一种如权利要求2所述的标记物组合物在制备检测结直肠癌的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的标记物组合物；以及标记物组合物的探针。
5.根据权利要求4所述的用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述探针为杂交捕获含有所述标记物组合物的DNA序列片段。
6.根据权利要求5所述的用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌为早期结直肠癌。
7.根据权利要求6所述的用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测流程包含以下步骤：
步骤1，测定样本的蛋白标记物CRP、CEA、CA19-9浓度水平；
步骤2，提取离体血液样本中的cfDNA，NEB EM-seq试剂盒酶转化处理，甲基化DNA建库；
步骤3，使用标记物组合物的探针进行靶向杂交捕获文库,文库定量后进行二代测序；
步骤4，数据下机，测序数据预处理以及对上述蛋白标记物、甲基化生物标记物进行数据分析。
8.根据权利要求7所述的用于检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述步骤2中，酶转化处理为将未发生甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶。
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