CN111584008A - 构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，所述方法包括从样本中获得至少两种结直肠癌标志物的浓度，对测定的每个标志物的浓度值进行logistic回归，将检测得到的浓度代入到logistic回归模型中，得到分析结果，使用每个标志物的浓度和logistic回归分析结果进行综合结直肠癌分析。本申请还提供了所述方法的应用。

Description

构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法及其应用
技术领域
本申请涉及医疗诊断技术领域，具体地，涉及一种构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法及其应用。
背景技术
大肠癌是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。其发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。发病年龄趋老年化，男女之比为1.65：1。结直肠癌成为常见的癌症类型，目前其在全球的发病率与致死率都高居前列，仅2018年新发病人数达到近200万，而致死人数将近90万人。
结直肠的发生与经济发展在统计学上呈正相关，表明人类经济文明环境下某些原因导致了结直肠癌的发生。当然，最容易联想到的是生活方式的变化，比如饮食，运动等。也可能与生活环境的变化有关，比如空气，水资源等。同时，也离不开科技与医疗的进步，比如人的寿命随着生活质量的提高而增加，而结直肠癌的发生与老龄化密切相关，约90％患者发生在50岁以上；同时，随着医疗水平的提高，癌症的筛查率也在增长，人类抵抗其它疾病的能力也在增强，也会在一定程度上影响着结直肠癌的发病率。
结肠癌筛查对于其治疗至关重要，同时也影响着患者的有效治愈率。我们应该都有的常识，疾病发现的越早能够被治愈的机会就越大，正如扁鹊见蔡桓公故事中所言，结直肠癌的治疗也是如此，早期结直肠癌不仅治愈率高，并且目前有较为明确的治疗方式：一般手术治疗或再加以辅助化疗即可，治疗费用相对会低。因此，早期筛查是必要的，而筛查的全面性，精准度对于结直肠癌早期筛查同样很重要。
目前，结直肠早期筛查常规方法是肠镜筛查(colonoscopy)，也是目前为止检测精度高，价格便宜的有效筛查手段，也是医院普遍使用的筛查结直肠癌的技术。40年前，肠镜检测并不常见，那时美国癌症学会推荐使用的方法有两种，一是乙状结肠镜检(sigmoidoscopy)，侵入肠道很少，所以无法全面的检测肠道的癌变；二是粪便隐血试验(facal occult blood test，FOBT)，通过检测粪便中的血清素来判断结直肠癌发生情况，非侵入式且简单便捷，适合家用型检测，但是特异性与敏感性比较差，而且无非检测早期良性息肉的存在；随后FOBT的衍生检测粪便免疫化学检测(facal immunochemical test，FIT)，利用特异性抗体识别球蛋白来进行癌症筛查，特异性与灵敏度有所提高，但是同样无法检测早期良性息肉，不利用结直肠癌的预防治疗。大约在1988年纽约哥伦比亚大学医学中心的Alfred Neugut提出长肠镜检测可有效地提高结直肠的筛查，之后肠镜检测开始普遍应用于结直肠癌的筛查中。如今，肠镜检测基本已经成为标准的推荐筛查手段，或者单独使用，或者结合FOBT或FIT或sigmoidoscopy，以提高检测的精准性。此外，由于结直肠癌与老龄化的关系，一般推荐50岁以后需要进行常规肠镜检测，至少10年一次，而sigmoidoscopy至少5年一次，粪便检测至少每年一次；如果有癌症家族史的话，可能需要更早的进行肠镜筛查，筛查频率相对也要增加。
可是，肠镜检测本身也存在一些问题，因为肠镜检测它是侵入性检测，因此它存在破坏癌细胞而引起癌症恶化的风险；同时这种侵入性检测便捷性很差，只能在专业的医疗结构中专业人士指导下才能进行有效地检测，无法像FOBT或FIT那样实现家用型便捷式检测，也是导致其无法百分之百的推广使用的因素；此外，由于浸入主要发生在下降(descending)远端结肠处，对于上升(ascending)近端结肠的检测效果差。结直肠癌的鉴别为普遍性难题，结直肠癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗及细胞生物疗法，不同性质病变及不同临床分期其临床处理方法各异，因此，结直肠癌的早期诊断显得尤为重要，结直肠癌标志物(TM)是目前被看好的这类检测指标之一。但一项结直肠癌标志物可以出现在多种结直肠癌中，一种结直肠癌也可以出现多项结直肠癌标志物，这就使联合检测相关结直肠癌标志物以提高诊断敏感度、特异性成为趋势。
在2014年美国食品与药品监督局(FDA)批准了一款新的结直肠癌粪便检测方法——Cologuard，与FIT方法类似，需要人的粪便进行检测，但是Cologuard不仅进行FIT检测，同时抽取粪便中的DNA检测其与结直肠癌发生相关的三个基因突变，其中包括KRAS突变。这种检测方法相较于FIT方法，准确度提高了许多。目前Cologuard推荐使用于结直肠癌的筛查，但是需要强调的是，其并没有取代肠镜检测，且大约有13％的假阳性，现在一般推荐Cologuard阳性患者进行肠镜筛查来进一步确定。此外，不得不提的是，Cologuard的价格是比较昂贵的，即使推荐三年一检，也要比FOBT或FIT要高，所以能否达到拓展筛查人群及普及筛查的目的，也值得商榷。
近期，随着癌症液态活检的发展，结直肠癌血检尝试也在进行，即取少量血液就可以用于结直肠癌筛查，相比于粪便的可接受度更高。德国的Epigenomics公司推出一款基于血液SEPT9基因甲基化修饰检测的Epi proColon筛查方法，但是目前来看，约20％的假阳性且价格昂贵，暂时没有太多的临床筛查优势。不过，血液液态活检未来仍然是值得期待的筛查手段，新的基因标志物需要被发现及证明其有效性。
在人们的理想中，当人们需要筛查结直肠癌时，立即就可以利用有效的手段进行筛查。可是，就目前而言，没有任何一种筛查手段是完美的，是100％精准的。本发明提供一种多维度组合的体外诊断结直肠癌的方法，把结直肠癌相关的蛋白标志物、代谢物、无细胞DNA、无细胞非编码RNA、自身抗体、炎症因子和生长因子、循环结直肠癌细胞、外泌体等联合检测，提高结直肠癌检测的灵敏度和特异性。
发明内容
本申请的主要目的在于提一种构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法及其应用，以提高临床检测结直肠癌的灵敏度和特异性，目前结直肠癌检测没有一种标志物可以同时以非常高的灵敏度和特异性结果诊断结直肠癌，大部分结直肠癌采用联检形式，但都是采用分子诊断或免疫诊断检测一种类型的几种标志物，没有把各种维度的检测组合起来，为加强预测的精准度，最好是连横合纵、内外兼顾结合：把代谢物、外泌体、分子诊断、免疫诊断结合起来，此为本发明的目的。
本申请提供了一种构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，所述方法包括从样本中获得至少两种结直肠癌标志物的浓度，，对测定的每个标志物的浓度值进行logistic回归，将检测得到的浓度代入到logistic回归模型中，得到分析结果，使用每个标志物的浓度和logistic回归分析结果进行综合结直肠癌分析
优选地，所述结直肠癌标志物包括以下大类中的至少一类：
结直肠癌蛋白标志物、结直肠癌代谢物标志物、结直肠癌分子诊断标志物、结直肠癌自身抗体、结直肠癌相关炎症因子和/或生长因子、结直肠癌相关外泌体以及结直肠癌相关DNA甲基化标志物。
优选地，所述结直肠癌蛋白标志物选自CEA、HP、CA50、IGFBP2，LRG1、MAPRE1、CA19-9、CA24-2、ENO1、ESM-1、GP87、CK20、M2-PK、TPA、GSTs、PRL、CCSP-2、DKK3其中的任意一种或多种组合；
所述结直肠癌代谢物标志物选自乙酰精胺、二乙酰精胺、18F-FDG、吲哚衍生物、柠檬酸盐，犬尿酸盐，2-氨基丁酸盐、马尿酸盐、丙酮酸、乳酸、丝氨酸、肌酐、瓜氨酸、鸟氨酸、乙酸盐；
所述结直肠癌分子诊断标志物选自P53、p21/27、MSI-H、MSI-L、NRAS/KRAS、APC、Ecadherin、BAT-26、SMAD4、Bcl-2、DAPK1、EGFR、PCNA、FHIT、SEPT9、MMP9、sCD26、SPAG9、nm23-H1、PIK3CA、miR-150、miR-130a、miR-195-5p、miR-29a、miR-223、miR-224、miR-30d、miR-10b、miR-21、miR-106a、miR-92a、miR-31、miR-96、miR-145中的任意一种或多种；
所述结直肠癌自身抗体选自APE1、P53-AAbs、NY-ESO-1AAbs、MAPRE1AAbs中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关炎症因子和生长因子选自IL-2、IL-22、IL-8、CD3+、CD4+、CD8+、CD28-、IFN-γ、CRP中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关外泌体选自ΔNp73、CRNDE-h、CD24、A33、CD147、circ-KLDHC10、circRTN4、CircFAT1、CircARHGAP5、CircHIPK3、MAGEA3、CRNDE-h、miR-193a、miR-17-92a、miR-1229、miR-1246、miR-223、miR-210中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关DNA甲基化标志物选自hMLH1、CDKN2A(p16)、CDH4、HLTF、APC、ALX4、HPP1/TPEF、RUNX3、RASSF1A、CDH1、SEPT9、TMEFF2、NGFR、HLTF、CYCD2、SRBC中的任意一种或多种。
优选地，所述logistic回归的公式为：
Figure BDA0002516188490000051
其中Logit(P)为上述同一类或不同类结直肠癌标志物的logistic回归模型结果，C为回归得到的自然常数，α为回归分析得到的每个标志物的系数，为自然数，标志物浓度i为同一大类或不同大类中的标志物浓度，n为大于等于2的整数。
优选地，检测的样本包括：人体或动物体组织、血样、尿液、唾液、体液、粪便中的任何一种或多种。
优选地，检测技术方法包括放射方法、免疫方法、荧光方法、流式荧光、胶乳比浊法、生化法、酶法、PCR方法、测序法、杂交法、气质联用法、液质联用法、层析法、化学发光方法、磁电、光电转换方法其中的一种或多种。
优选地，所述结直肠癌标志物为结直肠癌蛋白标志物，结直肠癌分子诊断标志物和结直肠癌相关DNA甲基化标志物组合，其中结直肠癌蛋白标志物为Pro-SFTBP、CEA、CA125、SCC-Ag、CYFRA21-1、Pro-GRP，结直肠癌分子诊断标志物为EGFR、AKT1、ALK、HER2、BRAF、pIK3CA、BRCA1/2，结直肠癌相关DNA甲基化标志物为SHOX2、RASSF1A、AKAPl2，获得这些标志在样本的浓度值，进行自然对数转换，经logistic回归分析，剔除无贡献的标志物后，得到的回归模型为：Logit(P)＝-8.536+1.852*Ln(Pro-SFTBP)+0.741*Ln(CEA)+0.689*Ln(CA125)+0.521*Ln(SCC-Ag)+0.534*Ln(CYFRA21-1)+1.245*Ln(EGFR)+0.872*Ln(HER2)+0.316*Ln(BRAF)+0.872*Ln(pIK3CA)+0.352*Ln(BRCA1/2)+0.821*Ln(SHOX2)+0.258*Ln(RASSF1A)+0.698*Ln(AKAPl2)，其中Ln为自然对数或常用对数。
根据本申请的另一个方面，提供使用所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法得到数学模型在预测样本主体患癌风险中的应用，当根据所述数学模型得到计算分析结果的值为≥-2.156时，认为所述样本的主体具有癌症风险。
本申请具有以下优点：结直肠癌不同维度，不同种类组合连横合纵，内外兼顾的检测，克服市场上一种标志物或一个维度的检测灵敏度和特异性不高等缺点，极大提高诊断结直肠癌的精准度和准确性，可以替代传统的CT或活检穿刺等有创诊断，可以判断结直肠癌的亚型，也可以同时提供早诊、早筛、辅助诊断或预后观察，为患者带来福音。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例中所用的检测方法学，可以是购买的试剂检测试剂盒或自制试剂盒。
实施例1
用购买的化学发光方法检测试剂盒，测试血样中9种结直肠癌蛋白标志物浓度(CEA、CA50、IGFBP2，LRG1、MAPRE1、CA24-2、ENO1、ESM-1、M2-PK)，用荧光原位杂交法或测序法测试血样中10种结直肠癌分子标志物浓度(P53、MSI-H、NRAS/KRAS、APC、BAT-26、SMAD4、DAPK1、SEPT9、sCD26、SPAG9)，用流式荧光方法检测血样中10种结直肠癌相关的DNA甲基化标志物浓度(hMLH1、CDKN2A、CDH4、HLTF、APC、ALX4、RUNX3、RASSF1A、CDH1、SEPT9)，用标准的液质联用方法检测尿液或血液中5种结直肠癌相关代谢物标志物浓度(二乙酰精胺、18F-FDG、吲哚衍生物、柠檬酸盐，犬尿酸盐)。
把上述相关标志物的测试浓度先进行logistics回归分析得到Logit(P)＝常数+λ1*P1+λ2*P2+η3*P3+η4*P4……
再测试未知血样各个标志物浓度，代入到回归模型中，根据计算得到的Logit(P)及回归模型Logit(P)值的判断标准，综合诊断是否患结直肠癌的情况及结直肠癌风险。
Figure BDA0002516188490000071
实施例2
用购买的或自制的化学发光方法试剂盒，测试血样中7种结直肠癌蛋白标志物浓度(CEA、CA50、IGFBP2，LRG1、MAPRE1、CA24-2、M2-PK)，用荧光原位杂交法测试血样中6种结直肠癌分子标志物(miR-150、miR-130a、miR-195-5p、miR-29a、miR-223、miR-224)，用购买的免疫荧光方法检测血样中4种结直肠癌自身抗体的浓度(APE1、P53-AAbs、NY-ESO-1AAbs、MAPRE1AAbs)，用流式荧光方法检测尿液或血液中13种结直肠癌相关外泌体(ΔNp73、CRNDE-h、CD24、A33、CD147、circ-KLDHC10、circRTN4、CircFAT1、circARHGAP5、MAGEA3、CRNDE-h、miR-193a、miR-17-92a)。
把上述相关标志物的测试浓度先进行logistics回归分析得到Logit(P)＝常数+λ1*P1+λ2*P2+η3*P3+η4*P4……
再测试未知血样各个标志物浓度，代入到回归模型中，根据计算得到的Logit(P)及回归模型Logit(P)值的判断标准，综合诊断是否患结直肠癌的情况及结直肠癌风险。
Figure BDA0002516188490000081
实施例3
结直肠癌蛋白标志物为CEA、IGFBP2、LRG1、MAPRE1、CA24-2、M2-PK、DKK3，结直肠癌分子诊断标志物为APC、E cadherin、BAT-26、Bcl-2、DAPK1、EGFR、MMP9，结直肠癌相关DNA甲基化标志物为hMLH1、CDKN2A(p16)、CDH4、HLTF、ALX4、HPP1、TPEF、RUNX3、RASSF1A，获得这些标志在样本的浓度值，进行自然对数或常用对数转换，经logistic回归分析，剔除无贡献的标志物后，得到的回归模型为：Logit(P)＝-7.421+1.051*Ln(CEA)+0.821*Ln(IGFBP2)+0.712*Ln(LRG1)+0.621*Ln(MAPRE1)+0.934*Ln(CA24-2)+0.652*Ln(M2-PK)+1.165*Ln(APC)+0.712*Ln(Ecadherin)+0.606*Ln(Bcl-2)+0.425*Ln(MMP9)+0.754*Ln(hMLH1)+0.528*Ln(CDKN2A)+0.754*Ln(RUNX3)+0.364*Ln(RASSF1A)，其中Ln为自然对数或常用对数。
测试未知血样各个标志物浓度，代入到上述回归模型中，根据计算得到的Logit(P)及回归模型Logit(P)值的判断标准，综合诊断是否患结直肠癌的情况及结直肠癌风险。
Figure BDA0002516188490000091
经过试验研究发现，多维度的联合，组合方式结直肠癌检测，比单独的一种或几种种类型的检测，有更高的灵敏度和特异性，灵敏度可以达到99％，特异性100％，远远优于市场上的结直肠癌诊断标志物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于，所述方法包括从样本中获得至少两种结直肠癌标志物的浓度，对测定的每个标志物的浓度值进行logistic回归，将检测得到的浓度代入到logistic回归模型中，得到分析结果，使用每个标志物的浓度和logistic回归分析结果进行综合结直肠癌分析。
2.根据权利要求1所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于，所述结直肠癌标志物包括以下大类中的至少一类：
结直肠癌蛋白标志物、结直肠癌代谢物标志物、结直肠癌分子诊断标志物、结直肠癌自身抗体、结直肠癌相关炎症因子和/或生长因子、结直肠癌相关外泌体以及结直肠癌相关DNA甲基化标志物。
3.根据权利要求1所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于，所述结直肠癌蛋白标志物选自CEA、HP、CA50、IGFBP2、IGFBP1、LRG1、MAPRE1、CA19-9、CA24-2、ENO1、ESM-1、GP87、CK20、M2-PK、TPA、GSTs、PRL、CCSP-2、DKK3其中的任意一种或多种组合；
所述结直肠癌代谢物标志物选自乙酰精胺、二乙酰精胺、18F-FDG、吲哚衍生物、柠檬酸盐，犬尿酸盐，2-氨基丁酸盐、马尿酸盐、丙酮酸、乳酸、丝氨酸、肌酐、瓜氨酸、鸟氨酸、乙酸盐；
所述结直肠癌分子诊断标志物选自P53、p21/27、MSI-H、MSI-L、NRAS/KRAS、APC、Ecadherin、BAT-26、SMAD4、Bcl-2、DAPK1、EGFR、PCNA、FHIT、SEPT9、MMP9、sCD26、SPAG9、nm23-H1、PIK3CA、miR-150、miR-130a、miR-195-5p、miR-29a、miR-223、miR-224、miR-30d、miR-10b、miR-21、miR-106a、miR-92a、miR-31、miR-96、miR-145中的任意一种或多种；
所述结直肠癌自身抗体选自APE1、P53-AAbs、NY-ESO-1AAbs、MAPRE1AAbs中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关炎症因子和生长因子选自IL-2、IL-22、IL-8、CD3+、CD4+、CD8+、CD28-、IFN-γ、CRP、SAA中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关外泌体选自ΔNp73、CRNDE-h、CD24、A33、CD147、circ-KLDHC10、CircRTN4、CircFAT1、CircARHGAP5、CircHIPK3、MAGEA3、CRNDE-h、miR-193a、miR-17-92a、miR-1229、miR-1246、miR-223、miR-210中的任意一种或多种；
所述结直肠癌相关DNA甲基化标志物选自hMLH1、CDKN2A(p16)、CDH4、HLTF、APC、ALX4、HPP1/TPEF、RUNX3、RASSF1A、CDH1、SEPT9、TMEFF2、NGFR、HLTF、CYCD2、SRBC中的任意一种或多种。
4.根据权利要求3所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于，所述logistic回归的公式为：
Figure FDA0002516188480000021
其中Logit(P)为上述同一类或不同类结直肠癌标志物的logistic回归模型结果，C为回归得到的自然常数，α为回归分析得到的每个标志物的系数，为自然数，标志物浓度i为同一大类或不同大类中的标志物浓度，n为大于等于2的整数。
5.根据权利要求1所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于检测的样本包括：人体或动物体组织、血样、尿液、唾液、体液、粪便中的任何一种或多种。
6.根据权利要求1所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于检测技术方法包括放射方法、免疫方法、荧光方法、流式荧光、胶乳比浊法、生化法、酶法、PCR方法、测序法、杂交法、气质联用法、液质联用法、层析法、化学发光方法、磁电、光电转换方法其中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法，其特征在于，所述结直肠癌标志物为结直肠癌蛋白标志物，结直肠癌分子诊断标志物和结直肠癌相关DNA甲基化标志物组合，其中结直肠癌蛋白标志物为CEA、IGFBP2、LRG1、MAPRE1、CA24-2、M2-PK、DKK3，结直肠癌分子诊断标志物为APC、E cadherin、BAT-26、Bcl-2、DAPK1、EGFR、MMP9，结直肠癌相关DNA甲基化标志物为hMLH1、CDKN2A(p16)、CDH4、HLTF、ALX4、HPP1、TPEF、RUNX3、RASSF1A，获得这些标志在样本的浓度值，进行自然对数或常用对数转换，经logistic回归分析，剔除无贡献的标志物后，得到的回归模型为：Logit(P)＝-7.421+1.051*Ln(CEA)+0.821*Ln(IGFBP2)+0.712*Ln(LRG1)+0.621*Ln(MAPRE1)+0.934*Ln(CA24-2)+0.652*Ln(M2-PK)+1.165*Ln(APC)+0.712*Ln(E cadherin)+0.606*Ln(Bcl-2)+0.425*Ln(MMP9)+0.754*Ln(hMLH1)+0.528*Ln(CDKN2A)+0.754*Ln(RUNX3)+0.364*Ln(RASSF1A)，其中Ln为自然对数或常用对数。
8.使用权利要求1-7中任意一项所述的构建体外检测结直肠癌的数学模型的方法得到数学模型在预测样本主体患癌风险中的应用，其特征在于，当根据所述数学模型得到计算分析结果的值为≥-1.231时，认为所述样本的主体具有癌症风险。
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