CN103924002B - 血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用 - Google Patents

血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了microRNA——miR-3126-5p作为肝癌诊断标志物的应用。本发明利用高通量芯片检测不同进展期肝癌细胞和临床肝癌血清标本中microRNA的表达，从中筛选出候选microRNA，随后通过检测大样本血清中候选microRNA的表达，发现miR-3126-5p对于诊断肝癌具有较好的灵敏度和特异性，尤其在诊断早期肝癌、AFP低表达的肝癌中具有较好的诊断价值。在此基础上，本发明开发了检测miR-3126-5p的引物、试剂盒及检测方法，具有较好的开发前景和临床应用价值。引物序列如SEQ？ID？NO.2所示，试剂盒由microRNA抽提试剂、反转录试剂、特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂组成。

Description

血清中的microRNA作为肝癌诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及一种血清中的microRNA——miR-3126-5p作为肝癌诊断标志物的应用，属于生物技术和医学领域。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一。据有关统计，男性肝癌患者年新增病例以及死亡率都高居前五位，女性肝癌患者死亡率在第七位。肝细胞性肝癌是肝癌最主要的病理类型，占原发性肝癌的80％左右，在我国占到了90％。其死亡率高预后差的主要原因之一是其具有高转移性。
肝癌的诊断主要依靠影像学检查、血清甲胎蛋白(alphafetalprotein，AFP)进行筛查。肝癌发生早期，影像学检查不到；而AFP敏感性又较低。早期诊断治疗延误，使得超过三分之二的肝癌患者在晚期才得到治疗。基于对肝癌以及其他肿瘤的研究发现，miRNA在肿瘤发生发展过程中有重要意义。有研究发现microRNA在肝癌组织中异常表达，可能参与了肝细胞癌变与肝癌转移的病理过程。MicroRNA是一类高度保守的非编码小RNA，通过调控基因表达参与多种生物学信号通路的调节。外周血液循环中的microRNA稳定存在，且与多种癌症密切相关。如果能够开发血清microRNA作为肿瘤诊断标志物将大大提高诊断效率。目前血清miRNA已在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中作为诊断标志物被研究。
成熟的microRNA由microRNA前体，一段具有发夹样环状结构的单链，经dicer等酶切割成为长度在21-24nt的小核苷酸片段。在哺乳动物中，成熟miRNA通过与相关蛋白质一起组成RNA-诱导沉默复合体(RISC)，与靶mRNA分子的3`端非编码区互补结合，抑制翻译或者引起mRNA降解。根据生物信息学预测分析，单独一个microRNA就可以调节上百个基因的表达，在细胞增殖分化凋亡等等多个过程发挥重要作用。而异常的microRNA表达可能与包括肿瘤在内人类许多疾病密切相关。
现已有众多报道证明肿瘤组织中microRNA的表达谱与其发病预后密切相关，但是，直接检测组织中microRNA对患者来说创伤较大，技术也相对复杂，难以真正用于诊断。而外周血血清microRNA则较易获得，对患者损伤较小，常规的临床抽血检查即可获得血清标本。并且由于microRNA的结构特点，microRNA耐RNA酶水解，对热、低温、酸、碱都具有抗性，耐反复冻融，在血清中能够长期稳定地存在。长期低温下保存的血清中，microRNA的理化性质不会改变。因此，血清microRNA是一种理想的用于肝癌检测的指标。
关于血清中microRNA的来源，现在还没有明确的理论依据，普遍被认同的是来源于组织细胞的主动分泌过程。在细胞内，成熟的microRNA被脂质或脂蛋白包裹，成为外分泌体(exosome)，分泌至胞外并进入血液；细胞通过内吞作用接受外分泌体并将其去包被化，释放出的microRNA即在受体细胞内行使其生物学功能。这种由外分泌体介导的细胞间的microRNA的交换常常作为细胞间通讯的新渠道，对于维持内环境的稳态具有重要意义。
检测血清microRNA对于肿瘤的诊断和预后判断往往能够提高检测的灵敏度和特异性；而单独的一种microRNA的表达异常往往不具有代表性或作为肿瘤标志物特异性不高，选择多个microRNA，或者与其他肝癌标志物结合使用可以提高诊断的准确性。近年来，有三个研究报道了HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu，KZ.etal(2011)JClinGastroenterol45：355-60)研究了血清hsa-miR-16、hsa-miR-195以及hsa-miR-196a在283个样本中的诊断价值，发现hsa-miR-16具有最好的诊断效能，灵敏度和特异性分别为72.1％和88.8％。Xu等(Xu，J.etal(2011)MolecularCarcinogenesis50：136-42)发现了血清中hsa-miR-21、hsa-miR-122和hsa-miR-223是区分HCC和健康个体的潜在标志物。Li等(Li，LM.etal(2010)CancerRes70，9798-807)报道了血清microRNA显著的诊断价值，hsa-miR-375的灵敏度和特异性分别为96％和100％，hsa-miR-375、hsa-miR-25以及hsa-let-7f联合应用后，灵敏度和特异性分别为97.9％和99.1％。以上结果提示，血清microRNA诊断HCC是可行的，但是这些研究存在诸多缺陷，如用于筛选microRNA的方式和候选基因的数目有限，没有对不同时期肝癌的诊断进行检测、样本量小、缺乏早期肝癌的诊断标志物或缺少独立的验证。因此，仍然有必要在HCC患者的血浆或血清中发现有诊断价值的microRNA生物标志物，尤其是对于早期肝癌的诊断标志物。通过比较多个microRNA的诊断效率，以及多个microRNA生物标志物联合应用，可以确定能够快速、准确、低成本地对早期肝癌患者进行诊断的microRNA标志物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明通过研究，发现了一个新的可以作为肝癌诊断标志物的microRNA。本发明利用体外肝癌细胞模型结合临床病例对肝癌中异常表达的microRNA进行了表达分析，并分析了其对肝癌诊断的临床意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过分析临床肝癌血清样本和体外肝癌细胞模型，从中筛选出了六个在肝癌血清中异常表达的microRNA(miR-16-2-3p、miR-17-5p、miR-92a-3p、miR-107、miR-1246和miR-3126-5p)，并通过realtimePCR验证、单因素和多因素Logistic模型检测以及ROC分析，最终明确miR-92a-3p、miR-107和miR-3126-5p对肝癌的诊断有意义，而miR-3126-5p具有最高的诊断效能。
本发明重点分析了血清microRNA——miR-3126-5p的成熟体(其序列为UGAGGGACAGAUGCCAGAAGCA，如SEQIDNO.1所示)的表达情况，首次发现血清miR-3126-5p对于诊断肝癌，尤其是诊断早期肝癌和甲胎蛋白阴性的肝癌具有较高的灵敏度和特异性，因此，microRNA——miR-3126-5p可以作为肝癌诊断标志物进行应用，用于诊断诊断早期原发性肝癌、低甲胎蛋白分泌的原发性肝癌(低甲胎蛋白分泌为血清甲胎蛋白含量小于200ng/mL的原发性肝癌)。具体应用时，检测待诊断患者外周血血清中miR-3126-5p的表达水平，对肝癌进行诊断：若RealtimePCR检测miR-3126-5p的相对表达量低于2.497，则该检测者诊断为肝癌；若RealtimePCR检测miR-3126-5p的相对表达量高于2.497，则该检测者不诊断为肝癌。判断的依据是基于ROC曲线对肝癌/非肝癌这一二分类变量的判断，AUC(曲线下的面积)反映了诊断效率。经分析显示，miR-3126-5p对肝癌的总体诊断效率为0.881，略高于AFP(0.848)；miR-3126-5p对BCLC0期的早期肝癌的诊断效率为0.97，远高于AFP(0.698)；而对于低AFP患者(AFP<200ng/mL)的诊断效率为0.927，远高于AFP(0.726)。
所述早期原发性肝癌是BCLC(0+A)级的原发性肝癌，是按照巴塞罗那临床肝癌标准(barcolonacliniclivercancer，BCLC)0+A级的肝癌。
所述低甲胎蛋白分泌的原发性肝癌(低AFP分泌肝癌)是指一种适应症，其是一种肝癌，但其AFP表达较低(AFP<200ng/mL)。AFP是当前应用最广泛的肝癌标志物，根据现有技术，当AFP界值为200ng/mL时，AFP诊断肝癌的灵敏度仅为55～60％，产生约40％的假阴性率。这部分AFP阴性肝癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。并且，AFP不是肝癌的特异性指标，一部分肝炎、肝硬化、结肠炎和结肠癌患者也会出现AFP的异常增高，造成了临床应用AFP进行诊断的干扰。由此，AFP并不是诊断肝癌的理想标记物，目前临床迫切需要新的指标用于提高肝癌的诊断率。
进一步地，本发明还提供了一种用于检测血清miR-3126-5p成熟体的特异性扩增的方法，概述如下：首先进行血清microRNA的抽提，然后在poly(A)聚合酶在其3'末端加polyA尾,在反转录酶的作用下反转录为cDNA,并进行RealtimePCR扩增。其中特异性的前向引物序列为：TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQIDNO.2所示；逆向引物序列为通用的适配子引物。
本发明还提供了一种用于检测miR-3126-5p的试剂盒(用于诊断肝癌的试剂盒)，试剂盒由上述特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂(核酸抽提试剂、聚合酶链式反应试剂等，为常规试剂)组成。进一步地，试剂盒的组成如下(表1)：
表1试剂盒组成
其中，特异性上游引物序列为：TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQIDNO.2所示；逆向引物序列为通用的适配子引物。内参为U6基因，其上游引物序列为：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物序列为：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，如SEQIDNO.3、4所示。
采用上述试剂盒检测miR-3126-5p的具体方法(即利用miR-3126-5p作为肝癌诊断标志物进行诊断的方法)为：
(1)microRNA的提取：
①取待诊断患者的外周血血清400μl，加入750μl裂解液MRL，吹打几次，剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。
②加200μl氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。于4℃12000rpm离心10min；样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNasefreeEP管中。
③加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。10000rpm离心45s。
④收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。
⑤加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
⑥将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。取出RB，放入到一个新的RNasefreeEP管中。
⑦在吸附膜中间加15μlRNasefreewater，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA。
(2)miR-3126-5p的检测：
①按照得到的RNA+逆转录缓冲液5μl+逆转录酶1μl+2.5U/μl聚合酶1μl+去RNA酶水补足到25μl。
②37℃水浴60min；85℃水浴5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA。
③cDNA2μl+2xqPCR混合液10μl+引物(2μM)2μl+通用引物(2μM)2μl+DDW4μl。
④预变性95℃10min→(变性10秒→退火60℃20秒→延伸72℃15秒)45个循环熔解曲线72℃-95℃0.5℃/10秒→冷却25℃30秒。
⑤根据得到的Ct值，减去内参基因，代入2-ΔΔCT，得到miR-3126-5p在该病人中的表达值。
本发明利用高通量芯片检测不同进展期肝癌细胞和临床血清样本microRNA的表达，从中筛选出候选microRNA，随后通过检测大样本血清中候选microRNA的表达，发现miR-3126-5p对于诊断肝癌具有较好的灵敏度和特异性，尤其在诊断早期肝癌、AFP低表达的肝癌中具有诊断价值。在此基础上，本发明开发了检测miR-3126-5p的引物、试剂盒及检测方法，具有临床应用价值。
附图说明
图1：Real-timePCR检测候选microRNA在临床样本中的表达，其中，A.miR-16-2-3p，B.miR-17-5p，C.miR-92a-3p，D.miR-107，E.miR-1246，F.miR-3126-5p。H.为肝癌患者外周血清，N.为健康对照。*P＜0.05，***P＜0.001。
图2：microRNA在对所有患者进行肝癌诊断的诊断效果，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-107诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图3：MicroRNA在BCLC0期诊断肝癌的ROC，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-107诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图4：MicroRNA在BCLCA期诊断肝癌的ROC，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-107诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图5：MicroRNA在BCLCB期诊断肝癌的ROC，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-107诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图6：MicroRNA在BCLCC期诊断肝癌的ROC，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-107诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图7：AFP小于200ng/ml患者中microRNA诊断肝癌ROC，其中，A.外周血AFP诊断肝癌的ROC曲线。B.血清miR-3126-5p诊断肝癌的ROC曲线。C.miR-92a-3p诊断肝癌的ROC曲线。D.miR-107诊断肝癌的ROC曲线。AUC，曲线下面积。
图8：AFP和microRNA在BCLC肝癌各个分期中的AUC。横坐标为BCLC分期。纵坐标为ROC曲线下面积AUC。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。
实施例1血清标本收集
血清标本共155例，其中50例正常人血清、105例肝癌患者血清。血清来自山东大学省立医院感染科，血清在临床诊断时即收取，收取时间自2012年3月至2013年11月。血清收集于促凝管内，2000～3000rpm离心18～20min，吸取上清与离心管中，-80℃分装保存。患者临床病例特征如表2所示。
表2临床肝癌病例及其临床特征
肿瘤分期按照巴塞罗那分级标准，BCLC分级中0和A为早期，BCLC分级中B、C和D为晚期。
实施例2血清microRNA的提取
步骤如下：
(1)吸取400μl冻存的病人血清，加入750μl裂解液MRL，吹打几次。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。
(3)每750μl裂解液加200μl氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。
(4)于4℃12000rpm离心10min；样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNasefreeEP管中。
(5)加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。
(6)10000rpm离心45s，收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。
(7)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
(8)加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
(9)将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
(10)取出RB，放入到一个新的RNasefreeEP管中，在吸附膜中间加30μlRNasefreewater，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA保存于-80℃。
实施例3microRNA逆转录
取2μgRNA，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表3配制混合液。
表3microRNA逆转录的反应体系
37℃，60min；85℃，5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA可用于后续实验，或置于-20℃保存。
实施例4Real-timePCR检测基因表达
以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表4所示。
表4RealtimePCR的反应体系
按照两步法PCR设定反应步骤。反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照公式得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。
实施例5统计学分析
数据分析采用SPSS16.0软件(SPSSInc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差(Mean±SD)表示；计量资料间差异比较采用Mann-WhitneyUtest；通过绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristies，ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(areasunderthecurves，AUC)来评价诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度与特异性之和最大、误差[(1-灵敏性)2+(1-特异性)2的平方根]最小所对应的值。采用medcalel0.4.7.0软件比较曲线下面积AUC差异性。P＜0.05(双侧)为有统计学差异。采用R软件分析检验效能及样本大小，R≥0.8为具有检验效能。
实施例6血清miR-3126-5p是诊断早期肝癌的血清标志物
首先本发明分析了候选microRNA在各组血清中的表达情况。如图1所示，通过比较肝癌和健康对照组血清候选microRNA的表达水平，可知肝癌患者中miR-3126-5p的表达水平显著低于正常人对照组，而肝癌患者血清中miR-92a-3p和miR-107的水平显著高于正常对照组。
实施例7血清microRNA对于肝癌判断的单因素Logistic模型
应用各候选microRNA的RealtimePCR检测数值，建立单因素Logistic回归模型。为了进一步排除性别和年龄的影响因素，建立的模型进一步用性别和年龄因素进行校正，结果见表5。
表5候选microRNA对肝癌判断的单因素Logistic模型
校正性别和年龄后所构建的模型结果显示，校正和不校正所得到的统计学结果是一致的。因此，根据单因素Logistic模型的检测结果，确定miR-92a-3p、miR-107、miR-3126-5p这3个候选的microRNA具有诊断肝癌的潜力，进一步以此进入多因素logistic模型进行逐步回归筛选。
实施例8血清microRNA对于肝癌判断的多因素Logistic模型
应用候选的microRNA构建多因素Logistic模型，并通过Stepwise逐步回归对候选的microRNA进行筛选，结果见表6。
表6候选microRNA对肝癌判断的多因素Logistic模型
多因素stepwise筛选后，模型中仍然包含miR-92a-3p、miR-107、miR-3126-5p这3个对肝癌诊断有意义的标记物。
实施例9评估血清miR-3126-5p对早期肝癌的诊断能力
随后本发明以肝癌为病人组，以正常人为对照组制作ROC曲线，确定血清miR-3126-5p诊断肝癌的曲线下面积、敏感性和特异性。miR-3126-5p对肝癌的总体诊断效率为0.881，略高于AFP(0.848)(图2)；miR-3126-5p对BCLC0期的早期肝癌的诊断效率为0.97，远高于AFP(0.698)(图3)；对BCLCA期的肝癌的诊断效率为0.899，高于AFP(0.796)(图4)；对于晚期肝癌(BCLCB-C期)的诊断，miR-3126-5p与AFP的诊断效率类似(图5、图6)；而对于低AFP患者(AFP<200ng/mL)的诊断效率为0.927,远高于AFP(0.726)(图7)。
结论：作为一个新型的肿瘤血清标志物，血清miR-3126-5p对肝癌具有优于AFP的诊断价值，尤其对于早期(BCLC0+Astage)肝癌和AFP低表达的肝癌，诊断效果远比AFP好。

Claims (4)

1.miR-3126-5p的检测试剂在制备早期原发性肝癌和低甲胎蛋白分泌的原发性肝癌的诊断试剂中的应用，所述miR-3126-5p的序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种用于检测血清miR-3126-5p的特异性扩增引物，其特征在于：序列为：
TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQIDNO.2所示。
3.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂组成；其中，特异性扩增引物序列为：TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQIDNO.2所示，其特异性扩增的目标序列为miR-3126-5p；PCR扩增所需试剂包括抽提和富集血清中microRNA的试剂、对microRNA进行反转录的试剂以及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的组成为：2.5U/μlPolyA聚合酶20μl，逆转录酶20μl，5×逆转录缓冲液100μl，去RNA酶水1000μl，2×qPCR混合液2000μl，50μM上游特异引物20μl，50μM下游适配引物20μl，内参上游引物20μl，内参下游引物20μl，血清裂解液100ml，70％乙醇100ml，氯仿100ml，吸附柱20个，漂洗液100ml，无水乙醇100ml；
所述上游特异引物为权利要求2所述的特异性扩增引物。
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